碳纳米管稳定的内源性自组装脂质颗粒的简便制备

摘要

我们报道了一种利用碳纳米管对含有自组装纳米结构内核的脂质颗粒进行动力学稳定化的智能应用。制备此类脂质颗粒仅需较低浓度的碳纳米管，因而可将其应用于药物递送等生物医学领域。

摘要

我们介绍一种利用碳纳米管（CNTs）稳定纳米结构脂质颗粒的简便制备方法。采用单壁（原始）和多壁（功能化）碳纳米管作为稳定剂，制备皮克林型水包油（O/W）乳液。以Dimodan U和Phytantriol等脂质作为乳化剂，这些脂质在过量水中可自组装形成双连续立方Pn3m相。该高黏度相在传统表面活性剂稳定剂或本文所用的碳纳米管存在下，通过探头式超声破碎仪处理，被破碎成更小的颗粒。首先将碳纳米管（粉末形式）分散于水中，随后与熔融脂质进一步超声处理，形成最终乳液。在此过程中，碳纳米管表面被脂质分子包覆，进而推测其围绕脂质液滴形成稳定的颗粒乳液，可保持数月稳定。由碳纳米管稳定的纳米结构脂质颗粒平均粒径处于亚微米范围，与使用传统表面活性剂稳定的颗粒相当。小角X射线散射数据证实，与纯脂质相（块体状态）相比，碳纳米管稳定的脂质分散体系中仍保留了原始的Pn3m立方相。拉曼光谱中碳纳米管特征G带和G'带出现蓝移及强度降低，表明碳纳米管表面与脂质分子之间存在相互作用。这些结果表明，碳纳米管与脂质之间的相互作用是其在水溶液中实现相互稳定的关键。由于用于稳定的碳纳米管浓度极低，且脂质分子能够对碳纳米管进行功能化修饰，因此碳纳米管的毒性预期可忽略不计，而其生物相容性则显著提高。因此，该方法在多种生物医学应用中具有广阔前景，例如可用于开发递送多种功能分子的杂化纳米载体系统，如联合治疗或多药治疗。

引言

近几十年来，纳米技术已成为一种强大的工具，尤其在抗癌等重大疾病的临床前药物开发领域备受关注¹。在此背景下，尺寸小于<1,000 nm的纳米级结构被广泛研究，用作多种活性生物分子（如药物、蛋白质、核酸、基因及诊断成像剂）的递送载体^1-4。这些生物分子可被包封于纳米颗粒内部，或共价连接在其表面，并通过pH或温度等刺激因素在作用部位释放^5,6。尽管纳米颗粒尺寸极小，但其较大的比表面积在活性生物分子的靶向递送中展现出显著优势。为了优化纳米颗粒的治疗效果及其应用潜力，对粒径的控制和生物相容性的调控至关重要^7,8。脂质^9-13、聚合物^14,15、金属^16,17以及碳纳米管^18,19已被普遍用作多种生物医学和药学应用中的纳米载体。

此外，基于脂质自组装纳米结构的纳米载体在食品和化妆品工业等多个其他学科中也具有广泛的应用意义^20,21例如，它们被用于蛋白质结晶²²生物分子分离²³，作为食品稳定剂 例如， 在甜点中²⁴，以及在递送营养物质、风味物质和香精等活性分子方面的应用^25-31自组装脂质纳米结构不仅能够以可控且靶向的方式释放生物活性分子^32-38 但它们也能保护功能分子免受化学和酶降解^39,40尽管平面流体双分子层是两亲性脂质分子在水存在下形成的最常见纳米结构，但六方相和立方相等其他结构也常被观察到。^20,41,42形成的纳米结构类型取决于脂质的分子形状结构、脂质在水中的组成，以及所采用的物理化学条件，如温度和压力。⁴³非平面脂质纳米结构（尤其是立方相）的应用受到其高黏度和非均一相区一致性的限制。通过将脂质纳米结构分散于大量水中形成水包油（O/W）乳液，乳液中包含微米或亚微米级的脂质颗粒，可克服上述问题。以此方式，可在保持分散颗粒内部原始脂质自组装结构的同时，制备出黏度适宜的制剂。这些内部自组装颗粒（简称ISAsomes）的形成⁴⁴ 例如， 从立方相制备的立方相纳米颗粒（cubosomes）和从六方相制备的六方相纳米颗粒（hexosomes）通常需要结合高能量输入步骤以及添加稳定剂（如表面活性剂或聚合物）。近期相关研究展示了多种固体颗粒的应用⁴⁵ 包括二氧化硅纳米颗粒⁴⁶，黏土^47-49 和碳纳米管⁵⁰ 用于上述乳液的稳定，该乳液适当地称为Pickering乳液⁵¹ 或拉姆斯登-皮克林乳液⁵².

近年来，单壁碳纳米管（SWCNTs）、多壁碳纳米管（MWCNTs）和富勒烯等碳基纳米结构作为新型生物材料受到了广泛关注^53,54主要问题是其毒性^55-58，水不溶性⁵⁹ 因此其生物相容性⁵⁶一种解决这些问题的有效方法是使用无毒且生物相容性的分子（如脂质）对表面进行功能化修饰。在水的存在下，脂质以一种使碳纳米管（CNTs）的疏水表面被屏蔽于极性水环境之外的方式与碳纳米管相互作用，同时脂质的亲水头部基团有助于其在水中的溶解性或分散性。^60,61脂质是细胞器以及某些食物成分的固有组成成分，因此对其修饰应理想地减少 体内 碳纳米管的毒性。基于碳纳米管的独立生物医学应用^18,19 和脂质纳米结构^9-13 正处于广泛开发中，但尚未充分探索将两者特性结合的应用。

在本研究中，我们采用了两种不同类型的脂质以及三种类型的碳纳米管（CNTs），其中单壁碳纳米管（SWCNTs）为原始形态，而多壁碳纳米管（MWCNTs）则分别以羟基和羧基官能团进行修饰。我们使用了极低浓度的碳纳米管来制备分散液，其稳定性取决于多种因素，例如，所用脂质的类型、碳纳米管的类型、脂质与碳纳米管的比例，以及超声处理的参数（如功率和时间）。本视频方案提供了利用多种碳纳米管稳定剂对脂质纳米颗粒进行动力学稳定的方法的技术细节。

方案

注意：本工作中使用的碳纳米管（CNTs）为纳米颗粒形态，相较于其块体形式可能存在额外的危害。吸入天然或合成的石墨粉尘均可导致尘肺病⁶²，类似于煤矿工人尘肺病。此外，碳基纳米结构的毒性问题已引起关注，一些先前的研究表明，吸入碳纳米管可能引起急性和慢性毒性^63-68。因此，应避免吸入细小的碳纳米管粉末，并务必谨慎操作。若不慎吸入，请立即转移至空气新鲜处；若呼吸困难，应给予纯氧并及时就医。碳纳米管的溶液或分散液形式相对安全，可放心操作。

注意：本研究中使用的脂质和表面活性剂为食品级材料，通常无毒，但对眼睛和皮肤具有刺激性，且高度易燃。因此，在处理或制备纳米颗粒样品时，请务必采取所有适当的安全措施，例如使用工程控制设备（通风橱）和个人防护装备（护目镜、手套、实验服、长裤、封闭式鞋）。若接触皮肤或眼睛，请立即用大量清水冲洗皮肤或眼睛至少15分钟。如有需要，请寻求医疗建议。

1. 脂质/水体相的制备

注意：将脂质在 4 °C 冰箱中保存。纯度较高的脂质应保存在冷冻柜中（-20 °C）。分装至小型玻璃小瓶中，以避免整批样品污染并便于操作。包括碳纳米管（CNTs）和表面活性剂在内的其他化学品可在室温下保存，但需远离直射阳光。

1. 保留脂质， 即， 在打开瓶盖/小瓶盖之前，将Dimodan U (DU)和植烷三醇（Phytantriol, PT）于室温下放置15–20分钟，以避免水分冷凝。
   （注：DU 是一种蒸馏甘油酯，包含 96% 的单甘油酯，其余为二甘油酯和游离脂肪酸。DU 中两种主要的单甘油酯成分为亚油酸酯（62%）和油酸酯（25%）。因此，DU 的疏水部分主要含有 C18 碳链（91%），其确切组成为：C18:2（61.9%）、C18:1（24.9%）和 C18:0（4.2%），其中 C18 表示 18 个碳原子的碳链，冒号后的数字表示碳碳双键的数量。PT 是 3,7,11,15-四甲基-1,2,3-十六烷三醇光学异构体的混合物。PT 不含酯键功能基团，而是由高度支链化的植烷基尾部和一个三羟基头部基团组成。DU 和 PT 在过量水存在下均可形成立方相，这一特性同样适用于稳定化脂质颗粒的核心结构。）^{13, 45}).
2. 将装有脂质的小瓶置于热水浴或盛有水的烧杯中加热，使脂质融化，水温需保持在60 °C以上（可使用加热磁力搅拌器：230 V，50 Hz，630 W 或类似设备加热烧杯中的水）。
3. 也可使用金属浴加热小瓶。为避免温度梯度及脂质降解，切勿将含脂质的小瓶直接置于加热板上加热。
4. 使用带有乳胶吸头的巴斯德玻璃移液管，将500 mg熔融脂质加入预先称重的微量离心管（带锥形螺旋盖，1.5 ml）中称重。
5. 向上述微量离心管中加入500 ml超纯水（水的电阻率=18.2 MΩ·cm）。
6. 使用小型（自制）刮刀手动混合各组分，持续15分钟。可通过钳子将注射针头（0.9 mm × 40 mm 套管长度）的尖端压平，制成该刮刀。
7. 将脂质/水混合物在2,000 × g条件下离心10分钟。再次手动搅拌混合物10分钟，然后平衡24小时。在表征样品前，先搅拌5分钟，随后置于室温下静置。
8. 为确保整个试管内形成平衡的脂质相，进行约10次冻融循环，并按上述定义间歇性地进行离心步骤。DU和PT均形成高黏度的块状脂质相，难以手动操作。图1).
   注意：上述方案（第1部分）仅在需要将分散颗粒的纳米结构行为（自组装的晶格类型和尺寸）与体相脂质相进行比较，和/或将其作为对照以确认原始纳米结构得以保留时才必需。

图 1. 利用高能量输入（超声处理）将高黏性脂相制备成具有流动性的水包油型颗粒乳液，并使用不同的碳纳米管（CNT）稳定剂，包括单壁碳纳米管（SWCNT）、羟基化多壁碳纳米管（MWCNT-OH）和羧基化多壁碳纳米管（MWCNT-COOH）（图示经英国皇家化学学会许可转载自参考文献[50]）。 请点击此处查看该图的放大版本。

2. 表面活性剂稳定脂质颗粒的制备

1. 将表面活性剂（Pluronic F127）配制成0.2%（w/w）的水溶液。
   1. 取200 mg表面活性剂（白色蓬松粉末）溶于100 ml超纯水中，磁力搅拌20–30分钟（使用磁力搅拌器和磁力搅拌子）。Pluronic F127是一种非离子型表面活性剂，常用于乳液稳定。其为PEO₉₉-PPO₆₇-PEO₉₉三嵌段共聚物，因此在水中溶解较慢。
2. 用巴斯德玻璃移液管取500 mg熔融态的DU或PT，加入玻璃小瓶（20 ml钠钙玻璃闪烁瓶，配带衬箔的脲盖）中。
3. 加入9.5 g 0.2% F127溶液。
4. 将小瓶牢固夹紧在探头式超声仪的铁架台夹具上（铁架台套装包括支架、夹子、底座、杆、橡胶三爪夹头和连接头），确保其能够承受超声过程中产生的振动。
5. 将连接至细胞破碎仪的实心钛合金探头（直径13 mm，长度139 mm）插入小瓶中。调节小瓶的高度和位置，确保瓶壁和瓶底不与探头接触。探头尖端与玻璃小瓶底部保持0.5 cm的距离时效果较佳。
6. 以脉冲模式超声处理10分钟，脉冲时间为1秒，间隔时间为1秒，输出功率为最大功率的35%。由于超声过程中产生热量，小瓶会变得很热，因此在从夹具上取下前需冷却至室温。
7. 将形成的乳白色分散液在室温下静置至少24小时后再进行后续使用，以确保其不发生相分离。
   注意：使用探头前后，需用丙酮清洗，纸巾擦干，再用超纯水冲洗，并再次擦干。

3. 纯碳纳米管水分散液的制备

1. 取两个烧杯，分别称取4 mg的MWCNT-OH粉末和MWCNT-COOH粉末，二者均为黑色。
2. 向每个烧杯中加入500 ml超纯水。使用探头式超声仪，在40%（最大功率）条件下以连续脉冲模式超声处理2分钟。所得MWCNT分散液的浓度为8 µg/ml（储备液）。
3. 用适量超纯水稀释MWCNT储备液，配制浓度分别为6.25、5、4、2 µg/ml的MWCNT分散液。
4. 按照前述方法（见3.2）对这些分散液进行超声处理。
5. 同样地，将3 mg的SWCNT粉末（亦为黑色）分散于500 ml超纯水中，制备成6 µg/ml的SWCNT分散液（储备液）。
6. 按照上述方法（见3.2）稀释SWCNT储备液并进行超声处理，得到0.5、0.4、0.3125、0.2 µg/ml的SWCNT分散液。
   注意：所有分散液在约30分钟内保持澄清，之后碳纳米管开始逐渐沉降至底部。

4. CNT 稳定的纳米结构脂质颗粒的制备（图 1）

1. 称取 500 mg 熔融态 DU 置于玻璃小瓶中。
2. 向小瓶中加入 9.5 ml 浓度为 6 µg/ml 的 SWCNT 分散液。
3. 采用与制备纯 CNT 分散液相同的参数（见 3.2）对 CNT-DU 混合物进行超声处理。冷却至室温后，即可获得具有内部自组装纳米结构且结构保持完整的 CNT 稳定脂质颗粒。
4. 以类似方法，使用浓度为 0.4 µg/ml 和 0.2 µg/ml 的 SWCNT 分散液制备脂质颗粒。
5. 按照 4.1 至 4.4 的方案，使用 MWCNT-OH 和 MWCNT-COOH 制备脂质颗粒，但采用不同的 CNT 浓度，分别为 8、4 和 2 µg/ml。
6. 同样地，使用 4 µg/ml 的 MWCNT-OH 和 MWCNT-COOH 以及 0.4 µg/ml 的 SWCNT 分别制备三种不同的 CNT-PT 分散液。注意，CNT-PT 分散液所需的超声功率较低（最大功率的 35%），但时间更长（15 分钟），需在连续脉冲模式下进行。将分散液冷却至室温后静置 24 小时，再进行表征。
   注意：不同脂质（如本实验中的 DU 和 PT）及不同组分的超声参数可能不同，需优化以获得稳定良好的分散液。

5. 监测碳纳米管稳定的脂质分散体系的稳定性

1. 通过目测观察监测分散体系的稳定性：检查分散体系是否发生失稳，或体系中是否形成团块。
2. 定期拍摄照片（使用数码相机）。例如，在第一周每天拍摄分散体系的照片，第二周每隔一天拍摄一次，随后两周每周拍摄一次，之后根据需要每月拍摄一次。

结果

以下结果包括：a) 分散体系的稳定性，b) 脂质颗粒的粒径分布，c) 自组装类型，以及 d) 碳纳米管（CNTs）表面脂质包覆的证据。分散体系的稳定性（图2）采用带自动对焦和LED闪光灯的500万像素相机进行监测。

图 2. 碳纳米管类型示意图：(A) MWCNT-OH，(B) MWCNT-COOH，(C) SWCNT，以及相应乳液的照片。 仅在某一特定区域（阴影部分）获得稳定的乳液，该区域中碳纳米管与脂质的比例处于最佳范围；当碳纳米管含量过低或过高时，均无法形成稳定乳液。箭头指示不...

讨论

脂质颗粒的稳定化
使用三种不同的碳纳米管（CNTs）来稳定脂质分散液；其中两种为经-OH和-COOH基团功能化的多壁碳纳米管，另一种为未经功能化的单壁碳纳米管（原始型）。碳纳米管的尺寸如下（直径 × 长度）：MWCNT-COOH：9.5 nm × 1.5 µm；MWCNT-OH：8–15 nm × 50 µm；SWCNT：1–2 nm × 1–3 µm。将粉末状碳纳米管通过探头超声处理分散于水中。由于超声处理的作用，上述碳纳米管的实际尺寸可能进一步减小，但程度不均。纯水中碳纳米管分散液约20分钟后开始出现相分离，因此后续实验均在此时间内完成 即， 添加脂质并进行第二次超声处理。后者（对脂质-碳纳米管混合物进行的超声处理）有助于将水合过程中形成的较大且不均一的脂质区域熔融并破碎成亚微米级片段。以这种方式分散块状脂质可促进自组装纳米结构的平衡形成，否则该过程需要严格的冻融循环和/或长时间（数天至数周）。块状脂质相断裂为纳米颗粒，而包覆脂质的碳纳米管则可能在其周围形成壳层。超声处理增强了碳纳米管与脂质分子烷基链之间的疏水相互作用，从而使脂质烷基链修饰碳纳米管。由此修饰的碳纳米管稳...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dimodan U	Danisco	15312	4 °C 下保存。非危险品。对眼睛和皮肤有刺激性。
植烷三醇（> 95%，GC）	TCI Europe N.V.	P1674	4 °C 下保存。非危险品。对眼睛和皮肤有刺激性。
单壁碳纳米管（90%）	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc.	1246YJS	室温保存。避免直接光照。对眼睛、皮肤和呼吸系统有刺激性。
多壁羧酸功能化碳纳米管（> 80% 碳含量，> 8% 羧酸功能化）	Sigma-Aldrich Co. LLC	755125	室温保存。避免直接光照。引起严重眼刺激。可能引起呼吸道刺激。
石墨化多壁羟基功能化碳纳米管（99.9%）	Nanostructured & Amorphous Materials, Inc. (NanoAmor)	1224YJF	室温保存。避免直接光照。对眼睛、皮肤和呼吸系统有刺激性。
Pluronic F127	Sigma-Aldrich Co. LLC	P2443	生物试剂，适用于细胞培养。不属于危险物质或混合物。室温保存。
丙酮（99.5%）	Fisher Scientific	10134100	高度易燃液体。引起严重眼刺激。可能引起嗜睡或头晕。
带松动包裹式盖子的广口瓶（375 ml）	VWR International Ltd	216-3308
烧杯，1,000 ml	Fisher Scientific	12942161	耐用型，低型，带倾倒嘴和刻度
巴斯德玻璃移液管（150 mm 长）配乳胶吸头	Fisher Scientific	10006021
锥形盖微型离心管，1.5 ml	Fisher Scientific	11558232
刮勺	Fisher Scientific	11352204
加热磁力搅拌器	Fisher Scientific	11715704
磁力搅拌子（圆柱形，不透明 PTFE，30 mm × 7 mm（长 × 直径））	Fisher Scientific	10011792
针头（0.9 mm × 40 mm 套管长度）	Terumo UK Ltd	MN-2038MQ
铁架台套装 — 含支架、夹子、底座、杆、橡胶三爪夹和连接头	Camlab Ltd, UK	1177157
Millipore 水纯化设备	Barnstead Nanopure, Thermoscientific, USA
Progen Genfuge 24D 数字微型离心机	Progen Scientific	C-2400
探头式超声波破碎仪，配备 13 mm 探头	SONICS, Vibracell,  USA
500 万像素自动对焦带 LED 闪光灯摄像头	Samsung Galaxy Fame 手机摄像头
拉曼光谱仪	Horiba Jobin-Yvon LabRAM HR800 光谱仪
Mastersizer 3000	Malvern Instruments Ltd, Malvern, United Kingdom
小角 X 射线散射（SAXS）	SAXSpace 相机（Anton Paar, Graz, Austria）、X 射线发生装置（ISO-DEBYEFLEX3003, GE Inspection Technologies GmbH）、闭路循环水冷却系统（Chilly 35, HYFRA, Germany）。