一种新生小鼠脊髓压迫性损伤模型

摘要

本文介绍了一种在新生小鼠中建立可重复性脊髓压迫损伤（SCI）的方法。该模型为研究自发性功能恢复背后的适应性可塑性机制提供了一个有利的平台。

摘要

脊髓损伤（SCI）通常会导致严重的神经功能缺损，尤其是由于从大脑下行至脊髓的神经纤维受损所致。当前一个重要的研究领域是探索SCI后自发性或诱导性功能恢复所依赖的适应性可塑性机制。据报道，生命早期的功能恢复能力更强，这引发了一个有趣的问题：随着脊髓的发育，适应性可塑性如何发生变化？为了促进对此动态过程的研究，我们建立了一种新生小鼠的SCI模型。该模型对儿科脊髓损伤具有重要意义，而后者目前研究尚少。由于成年期神经可塑性涉及的部分机制与生命早期的神经可塑性机制相同¹，因此该模型也可能对成年期脊髓损伤具有一定参考价值。本文详细描述了在出生后（P）第1天即可建立的新生小鼠可重复性脊髓压迫（SCC）损伤的完整操作流程。通过在特定脊髓节段（本文描述为胸段9–11节）实施椎板切除术，随后使用改良的Yasargil动脉瘤微型夹迅速压迫并释放脊髓，从而实现SCC损伤。如先前所述，受伤的新生小鼠可用于行为学缺陷检测，或用于离体（ex vivo）生理学分析，以评估突触连接性，方法包括电生理记录和高通量光学记录技术¹。此前及正在进行的研究通过行为学和生理学评估表明，损伤后小鼠后肢运动功能出现显著的急性障碍，但在2周内即可实现完全的功能恢复，并首次提供了在明确的下行突触连接水平上功能性神经环路发生改变的证据¹。

引言

近十年来，来自不同脊髓损伤（SCI）模型的越来越多证据表明，脊髓神经网络能够自发地重新组织，从而促进功能恢复^1-9。因此，适应性可塑性已成为SCI研究中的一个重要课题。研究表明，可塑性包括残存轴突的再生、新轴突侧支的出芽以及新型突触连接的形成。这些知识大多来源于成年动物的行为学或解剖学研究。成年脊髓研究的一个重要局限在于难以进行高通量的生理学评估，而这一问题在新生动物标本中更容易解决¹。其中一个主要差异是，成年脑干和脊髓的完整离体（ex vivo）标本存活率较低；另一个差异是，由于成年脊髓组织更厚且具有髓鞘，对光的通透性较差。尽管近年来在活体（in vivo）成像技术方面取得了进展（例如，参见^10-12），可在一定程度上克服这些问题，但目前仅在新生动物中，才有可能在同一个脑干-脊髓标本的多个位点上，对任意背腹深度进行高通量成像。新生脊髓中轴突髓鞘化尚未成熟的状态，有利于实现高通量的离体（ex vivo）光学记录，从而实现对功能性突触连接的动态评估^13-17。结合基因编码的钙指示剂、光遗传学刺激以及药理学工具，光学方法有助于更深入地理解适应性可塑性背后的机制。

据估计，所有脊髓损伤中有1%至10%发生在婴幼儿和儿童中^18-22。与成人脊髓损伤（SCI）相比，小儿脊髓损伤的发病机制及自发恢复潜力研究较少。因此，采用新生儿SCI模型可更深入地了解小儿SCI，并有助于更好地理解其中涉及的致病机制和恢复机制。此外，SCI后支持成人脊髓功能恢复的可塑性被认为至少部分涉及调控中枢神经系统发育的相同机制，例如轴突生长、分支以及新突触的形成^23-26。因此，使用新生儿SCI模型可能为这些在成人脊髓中同样起作用的机制提供重要见解，或揭示未来可能在成人脊髓中重新激活的机制（例如通过移植胎儿细胞或组织，或由多能干细胞从头构建的组织），以促进功能恢复。

因此，新生小鼠为研究脊髓损伤后适应性可塑性提供了一个整合性的多方法学研究平台，可方便地结合行为学、生理学、解剖学、分子生物学和遗传学等多种方法。建立标准化的新生期损伤模型是开展此类研究的重要步骤。

方案

本实验方案已获得挪威国家动物研究管理局（Forsøksdyrutvalget，本地实验批准编号 12.4591）的批准，符合欧盟动物护理法规（欧洲实验动物科学协会联合会）。已采取措施尽量减少所用动物数量及其遭受的痛苦。本文描述的是对出生后（P）第1天的野生型ICR（印记控制区）小鼠（Jackson，美国）进行的操作步骤，但该方法也可用于后续发育阶段。

1. 为新生小鼠构建气体麻醉系统（图1）

1. 使用注射器的尖端制作一个鼻罩。用塑料管将鼻罩连接至三通旋塞（图1 - 红色管路 和 图2A1）。
2. 在鼻罩侧面钻一个小孔，并连接塑料管以排出面罩内多余的气体。将管路末端连接至设定为轻微负压的真空泵，或置于通风橱内（图1 - 亮绿色管路）。
3. 使用一个150 mm × 25 mm的塑料培养皿制作麻醉室（图2A2）。
   1. 在一侧开一个足够大的孔，以容纳小鼠头部和鼻罩。
   2. 在相对的另一侧开两个较小的孔，用于插入连接鼻罩的进气和出气塑料管（图1 - 分别为红色和亮绿色管路）。
   3. 在盖子顶部开第三个孔，并连接第三根塑料管，管路末端接至真空泵（图1 - 深绿色管路）。该第三根管路的作用是确保任何未被鼻罩出口捕获的过量气体均被清除。
4. 制作一个恢复室：在任意类型的实验培养皿底部打一个孔，该培养皿需足够大以容纳小鼠，且边缘平整光滑（培养皿开口必须与台面齐平，以防止气体泄漏）。用塑料管将恢复室的孔连接至三通旋塞（图1 - 棕色管路）。将恢复室置于通风橱下方。
5. 将一个三通旋塞连接至挥发器的出口管路（图1 - 黄色管路 和 图2A3）。
6. 将挥发器的进气口连接至氧气供应源（图1 - 蓝色管路）。

2. Yasargil 临时动脉瘤微型夹的改良以制备压缩工具（图2 和表1）

1. 用夹子将夹具牢固地固定在支架上。在双目放大镜下进行视觉控制，使用安装在钻头上的磨石将每个夹具刀片的尖端外表面磨至最终厚度约为 150 µm（图 2B 和 C）。
2. 在体视显微镜下，使用微型刀片（表 1）切割一小段聚乙烯毛细管（表 1），制成夹具的限位塞，并将其放置在其中一个刀片上（图 2A4 和 图 2B 和 C）。该限位塞可防止夹具完全闭合，从而形成标准化的压缩尺寸。当夹具闭合时，两刀片之间的距离约为 230 µm。由于聚乙烯材料在使用过程中可能发生压缩，从而改变刀片间距，因此每次实验均需制作新的限位塞。
   注意：夹具的弹簧张力会随着时间推移而减弱，大约经过 80 次压缩后，夹具将无法完全闭合至限位塞位置，此时需要更换夹具。

3. 手术前准备

1. 将小鼠放入睡眠室（图1），使用蒸发器（图2A3 和 表1）在纯氧中汽化4%异氟烷（图2A5）以启动麻醉。
2. 使用细塑料镊子轻轻夹住小鼠脚趾间蹼状皮肤，测试其缩足反射。操作时需格外小心，因为新生小鼠极易受伤。用力过大会立即导致瘀伤。在镇静开始时进行此项测试可触发反射，有助于判断所需施加的适当力度。
3. 一旦反射消失，立即将小鼠从睡眠室中取出，并使其俯卧于手术台上，鼻部插入鼻罩，通过鼻罩持续供给含4%异氟烷的纯氧（图1）。确保加热垫已开启并设定在37–38 °C，因为在手术期间低体温可能是致命的。
4. 为实现完全镇痛，于手术部位（本研究中为胸段（T）9–T11水平）皮下注射50 µl局部麻醉药布比卡因（2.5 mg/ml，图2A6）。使用胰岛素注射器（300 µl，30 G，图2A7 和 表1）进行注射。
5. 将输送至鼻罩的异氟烷浓度降低至1–2%。

4. 背侧椎板切除术

1. 在显微镜控制下进行手术。
2. 用氯己定葡萄糖酸盐清洁手术区域后（表1 #19）至少持续 30 秒，使用显微刀在 T9-T11 水平做 1-2 mm 的横向皮肤切口图 2A8).
   注意：在ICR新生小鼠中，当胃内含有乳汁时可见的胃前部，对应于T12-T13椎体水平图3）。另一个解剖标志是胸段皮下脂肪组织聚集物的头侧部分，其末端位于约T8-9水平。该标志仅在皮肤切开后可见。
3. 使用镊子（图 2A9 和 A10以横向扩大皮肤切口 通过轻轻向头侧和尾侧牵拉皮肤，将切口方向控制在8-9毫米（皮肤易撕裂，从而形成平滑且笔直的伤口）。这可为脊柱提供足够的侧向暴露。
4. 通过插入无菌的止血明胶海绵片，将皮肤切口边缘与下方结构分离图 2A11 和 表1在切口的头侧和尾侧皮下注射。这可以扩大切口开口，并防止皮肤回缩而遮挡手术区域。止血明胶海绵使用前无需用生理盐水浸泡。
5. 为了暴露脊柱，使用细剪刀解剖椎旁肌肉（图 2A12，以及 表1）。切断肌肉与脊柱的附着处，暴露椎板（图4A）。还需注意，此时脊突尚未充分发育。
6. 确定中线，使用细剪刀在两片软骨性板层之间横向剪开图4B）。小心地将薄镊子的一个镊尖插入硬脑膜与软脑膜之间（图4C），用镊子夹住椎板，小心向上抬起，直至有一块断裂脱落，而硬脑膜保持完整（图 4D）。重复此操作2-3次，以获得长度为1-2个节段的椎板切除。
7. 使用持针器作为咬骨钳，双侧去除部分关节突关节，以在椎管内获得足够的空间放置夹子。用小块止血明胶海绵清理手术区域并控制出血。

5. 脊髓压迫性损伤

1. 将改良的动脉瘤微型夹打开并置于夹持器中（图 2A13 和 图 2B），并将夹片放置于脊髓两侧、关节突关节与脊髓之间的空隙中。确保夹片插入足够深度，以影响脊髓腹侧部分。若无法实现，可进一步去除部分关节突关节。
2. 迅速释放微型夹，同时用夹持器固定其位置，防止滑动。维持压迫状态 15 秒。
3. 迅速打开微型夹并将其取出。为实现对称性压迫，将微型夹调转方向，并以前一次压迫所致出血性水肿形成的清晰可见标记为参考，将夹子以相反方向重新定位，进行第二次 15 秒压迫（先前实验表明，此方法可产生对称性的组织学和生理功能缺损，而单次压迫则不能¹）。压迫过程中不应损伤硬脊膜。
4. 清理术区，并使用止血明胶海绵碎片维持止血。
5. 移除手术开始时置于皮肤切口边缘下方的止血明胶海绵碎片，使用无菌 6.0 缝线 和持针器关闭皮肤切口（图 2A14 和 15）。
6. 使用胰岛素注射器（300 µl，30 G）在皮下注射经无菌 PBS 稀释的布托啡诺，剂量为 0.75 mg/kg 体重（图 2A16）。

6. 术后护理

1. 将小鼠从鼻罩中取出，并置于设定为 30 °C 的温控舱内，直至麻醉作用消退且小鼠恢复清醒（通常 1–3 小时即可）。
2. 向母鼠腹腔注射地西泮（图 2B17）（8 g/kg 体重）。该处理可诱导嗜睡状态，从而降低产后首夜（风险最高时期）发生食仔行为的风险。
3. 将手术后的小鼠放回同窝幼崽中。
4. 若同窝幼崽数量较多（>12 只），应移除部分未手术的幼崽，优先选择体型较大者（若存在体型差异），以减少对乳汁的竞争 。对于 ICR 品系母鼠，当每窝幼崽数量约为 9 只时，其对术后幼崽的哺育效果最佳。
5. 为进行疼痛管理，在术后初期每天皮下注射一次丁丙诺啡（0.75 mg/kg 体重），使用胰岛素注射器（300 µl，30 G）。皮下注射的适宜体积为 30–50 µl。在新生小鼠中，发声和躁动是 疼痛的良好指征。
6. 每日使用评分表对受伤小鼠进行检查，评估其 营养状况、体重、 脱水情况、疼痛程度、 伤口愈合情况、 尿潴留以及 感染状态。根据评分结果提供特殊护理，例如在营养异常时注射无菌儿科营养液（表 1 #18）。评分表还 规定了 人道终点标准。不排斥受伤幼崽的母鼠是最佳的照料者。
7. 在极少数出现膀胱功能障碍的情况下，每日进行两次膀胱按摩，直至功能恢复。操作时将小鼠仰卧置于一手掌中，并用指尖轻轻沿头尾方向按摩下腹部。

结果

脊髓压迫性损伤与功能丧失

如前所述，通过优化术前、手术及术后操作，可建立一种在新生小鼠中可重复的脊髓压迫损伤模型¹。将聚乙烯止动器放置于夹子的一侧刀片上（图2B 和 C），可防止夹子完全闭合，并使两刀片间距离稳定保持在约230 µm。在两次压迫之间调换夹子的方向，可产生对称性损伤，这一点可通过组织学后遗症进行判断（图5A 和 ¹）。微型夹子移除后，受压迫的脊髓组织会因出血性挫伤和水肿而迅速变暗。损伤后仅一天，对经伊红-苏木精染色的损伤脊髓连续切片进行观察，即可发现接近损伤中心区域时组织逐渐恶化（图5A）。损伤部位出现脊髓内空腔或血液并不罕见。

行为学评估，例如在手术后数小时、非负重条件下追踪后肢运动轨迹，显示与仅接受椎板切除术的假手术对照小鼠相比，脊髓挫伤（SCC）小鼠的后肢运动能力显著受损（图5B 和 ¹）。该测试可重复进行，直至小鼠能够完成其他需要承受自身体重的行为学测试¹。

手术后的死亡率与恢复情况

术中死亡主要由于需要高浓度异氟烷以达到充分麻醉，从而引发呼吸暂停和心脏骤停所致。在手术方案中引入局部麻醉药布比卡因，可降低异氟烷的使用浓度，从而显著减少术中死亡率。在最近一项包含20多只动物的实验系列中，术中死亡率为零。相比之下，术后存活率主要受母鼠对术后幼鼠接受程度的影响。在将手术后的幼鼠放回窝内前，对母鼠单次注射地西泮（腹腔注射，8 g/kg体重），可有效减轻其焦虑和攻击性，从而显著改善母鼠对幼鼠的接受情况¹。可通过观察幼鼠胃内是否存在乳汁来监测其接受程度和术后恢复情况。P1-P7阶段已摄入乳汁的小鼠，其胃部因充盈乳汁而呈现明显白色，透过腹部皮肤清晰可见（图3）。比较手术组、假手术对照组及未手术小鼠的哺乳情况，有助于评估损伤小鼠的营养状态。通过比较手术组与未手术小鼠的生长情况可知，尽管术后第一天存在轻微体重下降，但手术小鼠的生长曲线随后迅速恢复正常（图6）。即使在长达7周的观察期内，也从未观察到与膀胱功能障碍或感染相关的死亡情况。

图2中的编号	名称	制造商/供应商	参考编号#	链接			评论
1	塑料注射器（30 或 50 ml）
2	塑料培养皿（150 × 25 mm）
3	Fortec 异氟烷蒸发器	Cyprane		http://www.mssmedical.co.uk/products/new-vaporisers/			我们使用一款已停产的旧设备，有关新款设备请查看链接
4a	Yasargil 临时动脉瘤微型夹	艾斯康	FE681K	http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
4b	内径0.58 mm、外径0.96 mm的细孔聚乙烯毛细管	史密斯医疗	800/100/200	http://www.smiths-medical.com/industrialproducts/8/39/
5	异氟烷（Forene）	Abbott GmbH & Co. KG		http://www.life-sciences-europe.com/product/forene-abbott-gmbh-wiesbaden-group-narcotic-germany-west-2001-1858.html
6	马卡因（布比卡因）	阿斯利康		http://www.astrazeneca.co.uk/medicines01/neuroscience/Product/marcaine
7	胰岛素注射器 0.3 ml 30 G × 8 mm	VWR	80086-442	https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4646138
8	超精细微型刀具，5 mm 切割刃	Fine Science Tools	10315-12	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat&suchkatalog=0019900000&reloadmenu=1
9	超细格雷夫镊 — 0.5 mm 尖端	Fine Science Tools	1153-10	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat&suchkatalog=0055700000&reloadmenu=1			并非必需，通常牙齿过大
10	直型强力镊	Fine Science Tools	00632-11	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat&suchkatalog=0053500000&reloadmenu=1			需要两把镊子
11	Spongostan Special 70 x 50 x 1 mm	Ferrosan
12	Vannas弹簧剪——2 mm直头刀刃	Fine Science Tools	15000-03	http://www.finescience.de/katalog_ansicht.asp?Suchtyp= Kat&suchkatalog=0012800000&reloadmenu=1
13	Vario Clip 施加钳	Aesculap	FE502T	http://www.aesculapusa.com/assets/base/doc/DOC697_Rev_C-Yasargil_Aneurysm_Clip.pdf
14	Vicryl 6–0（Ethicon）	强生	J105G
15	Diethrich显微持针器		11-510-20	http://trimed-ltd.com/Products/Suture-Instruments/Micro-Needle-Holders-With-Tungsten-Carbide-Inserts/Ref-11-29.html
16	丁丙诺啡（Temgesic）	Schering-Plough
17	Stesolid（地西泮）	Actavis					也称为 Valium
18	Pedamix	Fresenius Kabi		http://www.helsebiblioteket.no/retningslinjer/pediatri/mage-tarm-lever-ernæring/parenteral-ernæring
19	氯己定葡萄糖酸盐溶液（chlorhexidine gluconate）	Fresenius Kabi	D08A C02	http://www.felleskatalogen.no/medisin/klorhexidinsprit-fresenius-kabi-klorhexidinsprit-farget-fresenius-kabi-fresenius-kabi-560639

表1. 用于在新生小鼠中建立夹闭式脊髓压迫损伤的工具与设备清单。

图1. 麻醉装置示意图。 该示意图展示了为新生小鼠设计的麻醉装置，包括用于初始麻醉的睡眠舱和在手术期间持续麻醉用的鼻罩装置。

图2. 主要器械和压迫夹。（A）手术过程中使用的器械。数字对应表1中所用的注释。（B 和 C）Yasargil 临时动脉瘤微型夹，其每个夹臂的尖端经手工修整至约 150 µm 厚度。在其中一个夹臂上安装由聚乙烯管切片制成的限位器（表1），以防止夹子完全闭合。比例尺：2 mm。App：夹子施加器（A 中 #12）；St：限位器。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 新生ICR小鼠术前评估脊髓节段的解剖标志。（A）P1期ICR小鼠的侧视图，胃内含有白色乳汁。胃的头侧部分对应于T12-T13脊髓节段。（B）处于俯卧位并接受麻醉的P1期ICR小鼠。尽管较（A）图更难观察，但仍可识别出充满乳汁的胃。胃的头侧部分指示T12-T13脊髓节段。比例尺：0.5 cm。

图 4. 背侧椎板切除术。 （A）椎旁肌的分离。注意在此年龄段，棘突发育尚不完全。（B）使用细剪刀横向切断椎板。（C）将细镊子的一侧刀片插入椎板与硬脊膜之间。箭头所示为进入点。（D）椎板的移除。比例尺：2 mm。

图 5. P1 期脊髓压迫损伤后的组织学与行为学结果。 （A）受伤小鼠脊髓切片的伊红-苏木精染色（损伤后 1 天），显示距离损伤中心不同位置的组织形态。（B）损伤后 6 小时或假手术对照组椎板切除后观察到的前肢和后肢运动轨迹的代表性记录。上方的轨迹表示从动物侧面观察的视图；下方的轨迹表示从动物腹面观察的视图。另见 ¹。比例尺：250 µm。DH：背角；L：左侧；R：右侧；SCC：脊髓压迫；VH：腹角。请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 生长曲线比较。 柱状图显示未手术组与脊髓损伤（SCC）小鼠从出生后第1天至第9天的体重增长情况。

讨论

本文描述了在P1小鼠中通过夹片法诱导脊髓挫伤（SCC）的实验步骤。相同的操作也可在后续发育阶段实施。该方法已在P5、P7、P9和P12小鼠中成功实施脊髓压迫损伤（Züchner, 等，正在准备中的手稿）。在所有出生后阶段，均通过纯氧中汽化的异氟烷实现全身麻醉，但麻醉效果在很大程度上依赖于动物年龄。在最初对P1-P4阶段小鼠的尝试中，由于在引入局部麻醉之前，麻醉方案尚未优化，难以实现深度且持久的镇静，原因在于镇静不足与药物过量之间的剂量-效应窗口较窄。此外，已有研究对异氟烷在新生动物中可能存在的神经毒性效应提出担忧^27-30异氟烷与局部麻醉药布比卡因联合使用可产生更深且更稳定的麻醉效果，同时可将异氟烷剂量减少2至3倍。已有多种麻醉方法被用于新生啮齿类动物，包括低温麻醉。^31,32，但冷冻麻醉的一个潜在缺点是其神经保护作用（由 ^33,34），这可能会使高效且可重复的损伤造模变得复杂。由于新生小鼠的血清白蛋白和体脂含量低于成年小鼠，巴比妥类麻醉剂在其体内的麻醉效果被认为较低^35,36.

尽管该手术具有较强的侵入性和创伤性，但一旦操作流程建立，术中死亡率较低。然而，手术过程中存在若干关键步骤，需特别注意以提高手术小鼠的恢复率和存活率。其中一个重要问题是选择最有可能成功存活的仔鼠。当一窝仔鼠数量较多时，个体之间的营养状态存在差异。除了手术过程中不可避免的出血外，经过手术的仔鼠还需长时间离开母鼠，且通常在次日早晨之前无法进食乳汁。因此，优先选择胃内已含有一定量乳汁的仔鼠将更具优势。从出生后第0天（P0）到第7天（P7），胃内乳汁可通过腹部皮肤清晰观察到。

术后幼鼠在第一个晚上极易被母鼠同类相食。在该模型最初建立阶段，超过一半的手术小鼠在次日早晨失踪，并且笼内有明显的血迹。啮齿类动物的食尸行为、同类相食及 infanticide（杀婴行为）已数十年来被广泛研究^37-40。本研究中仅直接观察到一次同类相食现象，但由于术后放回笼中的幼鼠通常状态良好，夜间因自然原因死亡的可能性较低，因此认为同类相食比食尸行为更可能是幼鼠失踪的原因。这一推断促使研究者考虑使用可逆性药理学手段，例如地西泮（Diazepam），以降低母鼠的焦虑和攻击性（详见文献⁴¹综述）。腹腔注射地西泮显著改善了这一情况，使术后第一晚的死亡率从60%以上降至20%以下。

术后返回后，通过减少窝仔数量并尽可能减少对窝仔的干扰，是可进一步改善手术动物状况的额外措施。然而，仅将手术后的仔鼠与母鼠同笼并非有益做法。手术仔鼠与未手术仔鼠的最佳比例可能因品系而异，但对于ICR和SCID-ICR小鼠，将4-5只手术仔鼠（损伤或假手术）与3-4只未手术仔鼠共同饲养可获得最佳效果。

从广义上讲，这种新生期脊髓损伤（SCI）模型的主要局限性在于，新生期脊髓在许多方面与成年脊髓存在差异，因此可能无法提供与成年SCI模型可比的实验结果。这些差异包括脊髓的整体大小和体积、细胞数量、少突胶质细胞等特定细胞类型的数量不足、免疫反应不成熟以及神经元环路未成熟。因此，从该模型实验中得出的结论必须谨慎对待。另一方面，该模型适用于研究相对较少被关注的儿童期SCI情况。此外，相对于成年SCI模型的这一明显弱点，也可能成为潜在优势，因为它有助于阐明某些可塑性机制——这些机制在成年脊髓中可能仅微弱存在，但若能重新激活，则可能成为治疗干预的基础。通过移植发育程度较低的细胞或组织，或使用能够使成年组织重现早期发育特征的试剂，有可能实现新生期甚至胚胎期状态的重建。利用酶降解神经元周围网即为后一种策略的实例^42,43。

在建立脊髓损伤（SCI）动物模型时，一个主要问题是如何获得标准化的损伤。这是多个SCI模型中均已关注的重要方面， 例如横断，半横断，撞击器，球囊压迫，镊子夹伤，静态重物压迫 等等。 关于 影响装置，此方向上的努力已在成年啮齿类动物中建立了脊髓损伤（SCI）模型，其中可调控冲击的多个参数，如速度、力度和持续时间（详见综述于 ⁴⁴）。另一种方法所需设备较少，采用了一种改良的Kerr-Lougheed动脉瘤夹^45,46这两种方法具有互补性，因为撞击器模拟的是挫伤性损伤，而夹闭器模拟的是伴有一定程度缺血的压迫性损伤。由于新生小鼠体型较小、更为脆弱，长时间手术会导致较高死亡率，同时研发小型化设备的成本也较高，因此选择开发由夹闭器产生的压迫性损伤模型，而非由撞击器产生的挫伤性损伤模型。该方法通过改装一种 commercially available aneurysm mini-clip（商品化动脉瘤微型夹），使其适用于新生小鼠脊柱的尺寸而实现。¹加入止动塞可确保压缩宽度的标准化，只要夹子的张力压缩至止动塞的极限位置，在最小宽度处的静态压缩阶段，其压缩力的差异应较小。未实现标准化的是动态压缩阶段的压缩速度，因为夹子张力在其使用寿命内会发生变化，导致压缩速度随之改变。由于静态压缩阶段持续时间远长于动态阶段，且几乎没有证据表明脊髓组织会对微型夹片产生明显的反作用力，因此损伤严重程度很可能主要取决于静态压缩阶段。然而，这一点仍有待验证。损伤严重程度可能受多种因素影响，包括静态压缩力及其持续时间、压缩与减压速度、微型夹的位置，以及在同一部位进行压缩的次数。因此，这些参数的组合变化可能导致从轻度到重度的一系列不同程度的损伤。尽管存在变异的可能，在我们先前已发表的研究中¹ 我们在组织学、生理学和行为学水平上获得了 consistent 的结果，因此几乎没有证据表明可接受的标准化难以实现。我们注意到，在该研究中，我们在每个水平上都采用了多种验证方法，包括行为学测试，例如如图所示的踏空行走实验 图5.

在此新生小鼠脊髓损伤模型中，损伤保留了一定比例的轴突，从而为通过保留通路的重塑及新环路的形成来诱导适应性可塑性提供了有利条件。此外，由于新生小鼠适用于多种实验方法，可利用该模型采用整合性研究方法，包括行为学测试、逆行与顺行轴突示踪、免疫组织化学、电生理记录以及高通量光学成像，系统研究功能恢复与适应性可塑性¹以一个实例为例，我们利用这种整合性方法，结合高通量钙成像技术，证明了特定下行输入层面的神经网络重塑。 离体 脑干和损伤脊髓的全组织制备¹这可以通过使用神经光遗传学和光遗传药理学工具，进一步评估脊髓神经元特定亚群之间突触连接的重塑情况。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
塑料注射器（30 或 50 毫升
塑料培养皿（150 × 25） mm
Fortec 异氟烷蒸发器	Cyprane		我们使用一款已停产的旧设备，有关新型设备请查看链接
Yasargil 临时动脉瘤微型夹	Æsculap	FE681K
细孔聚乙烯管，内径 0.58 毫米，光密度 0.96 毫米	史密斯医疗	800/100/200
异氟烷（Forene）	Abbott GmbH & Co. KG
马卡因（布比卡因）	阿斯利康
胰岛素注射器 0.3 毫升 30 G × 8 毫米	VWR	80086-442
超精细微型刀 5 毫米级切割边缘	Fine Science Tools	10315-12
超细格雷夫镊 – 0.5 毫米尖端	Fine Science Tools	1153-10	并非必需，通常牙齿过大
直型超握力镊子	精细科学工具	00632-11	需要两把镊子
Spongostan Special 70 x 50 x 1 毫米	Ferrosan
万纳斯弹簧剪 – 2 毫米直刀片	Fine Science Tools	15000-03
Vario Clip 施加钳	Aesculap	FE502T
Vicryl 6–0（Ethicon）	强生公司	J105G
Diethrich 微型持针器		11-510-20
丁丙诺啡（Temgesic）	Schering-Plough
Stesolid（地西泮）	艾维特		也称为 Valium
Pedamix	Fresenius Kabi
氯己定葡萄糖酸盐溶液（chlorhexidine gluconate）	Fresenius Kabi	D08A C02