一种用于激光诱导脉络膜新生血管形成的动物模型

摘要

本文介绍了小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）实验方案，该模型可重现新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的血管特征。掌握该技术后，可稳定有效地诱导CNV，作为测试多种实验干预措施的模型系统。

摘要

小鼠激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型一直是新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）研究中的关键核心模型。通过向视网膜色素上皮（RPE）和布鲁赫膜施加靶向激光损伤，该操作可诱导血管生成，模拟新生血管性AMD中观察到的典型病理特征。

最初在非人灵长类动物中建立的激光诱导脉络膜新生血管（CNV）模型，现已逐步应用于多种其他物种，其中最近的是小鼠。小鼠实验具有成本效益高、实验周期更短以及可利用多种转基因模型等优势。然而，由于小鼠眼球体积微小，在操作过程中带来了特殊挑战。观察视网膜时对眼球的操作需要熟练掌握精细的灵巧技能，并同时具备手-眼-脚协调能力以操控激光设备。但一旦掌握，该模型可用于研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）的多个方面，包括分子机制、基因操作的影响以及药物治疗效果。

尽管激光诱导的CNV模型具有一定的应用价值，但它并非该疾病的理想模型。野生型小鼠的眼睛本身是健康的，其脉络膜-视网膜环境并不能模拟人类年龄相关性黄斑变性（AMD）中的病理改变。此外，由损伤诱导的血管生成并不反映与AMD这种年龄相关且呈慢性病程的疾病中所发生的血管生成相同的通路。

尽管存在一些局限性，激光诱导的脉络膜新生血管（CNV）模型仍是目前研究新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）致残性病理机制的最佳方法之一。该模型的应用不仅加深了人们对AMD发病机制的理解，还推动了多种现有AMD疗法的开发。

引言

年龄相关性黄斑变性（AMD）是50岁以上人群失明的主要原因之一^1-3。AMD可分为两种类型：萎缩性（“干性”）AMD和新生血管性（“湿性”）AMD。前者表现为视网膜色素上皮（RPE）、脉络膜毛细血管和光感受器的地理样萎缩，而后者则以异常血管从脉络膜侵入视网膜外层为特征，导致渗漏、出血和纤维化，最终引起失明^1,2。在两种类型中，新生血管性AMD是造成大多数视力丧失的原因¹。幸运的是，该类型目前有多种有效的药物治疗方案，而其萎缩性类型目前尚无经过验证的医学治疗方法³。此外，由于新生血管性AMD可在动物模型中较容易地重现，因此在基础AMD研究中更易于开展，有助于探索其潜在的病理机制，从而开发新的治疗方法⁴。

首个实验性脉络膜新生血管（CNV）动物模型由 Ryan et al. 在非人灵长类动物中建立⁵。该模型通过激光光凝诱导布鲁赫膜破裂，引发局部炎症反应，从而导致血管生成，类似于新生血管性年龄相关性黄斑变性（AMD）中的表现。激光诱导后血管生成的组织病理学进展被发现与新生血管性 AMD 相似，证实了该模型的有效性⁶。非人灵长类动物的解剖结构与人类最为接近，但遗憾的是，其饲养成本高昂，难以进行基因操作，且疾病进展过程缓慢⁷。相比之下，啮齿类动物模型饲养成本显著更低，易于进行基因改造，且疾病进展....

方案

所有动物的处理均遵循《实验动物护理和使用指南》（2013年版）、视力与眼科研究中动物使用国际研究协会（ARVO）声明，并经西北大学机构动物护理和使用委员会批准。

注意：以下步骤可由一名操作人员独立完成；但若由两名操作人员分工协作，则效率会显著提高。

1. 准备激光器和预激光处理工作站

1. 将激光器和裂隙灯放置在便于操作的位置。打开激光器并设置为预设参数（例如 75 µm 光斑大小、100 mW 功率、100 msec 持续时间）。
   警告：确保操作人员佩戴所有必要的动物和激光安全个人防护装备，并在手术室外显眼位置张贴相应的激光安全警示标识。
   1. 在使用任何实验动物之前，应先使用一只用于校准的非实验小鼠确定最佳参数。激光参数取决于所使用的激光设备。理想参数定义为：当激光聚焦准确时，能够持续产生“气泡”现象的最低激光功率设置。参见视频示例，了解具有适当“气泡”形成的病灶表现。
2. 准备激光前操作台，确保麻醉设备、动物保温装置、组织擦拭用品以及所有眼药水（托吡卡胺、丁卡因和人工泪液）均处于操作者易于取用的位置。
   1. 在对第一只小鼠注射麻醉剂之前，确保动物保温装置已预热至正确温度（37 °C），以避免麻醉诱导的低体温。
3. 将小鼠载物台置于保温装置上，使....

结果

通过免疫荧光染色标记脉络膜新生血管（CNV）血管，可对平铺的脉络膜组织进行CNV病灶的定量分析。组织制备最常用的两种方法分别为：在动物处死前通过灌注进行FITC-葡聚糖标记，或死后使用内皮细胞标志物进行免疫染色。这两种方法此前已有详细描述。^13,14,21; 图1 和 2 分别展示各自的示例。共聚焦显微镜图像采集后，可使用 ImageJ 软件或 Volocity 对面积（二维）或体积（三维）进行计算和可视化。除了定量分析外，OCT 成像还可用于可视化 CNV 病变 体内显示脉络膜新生血管（CNV）的视网膜横断面图像示例如下所示 图3.

讨论

在成功进行激光诱导后，有多种因素可能影响激光的递送以及脉络膜新生血管（CNV）病灶的形成。为了获得最可靠的结果，应对这些因素进行控制并实现标准化。其中最重要的因素包括小鼠的选择（基因型、年龄和性别）、麻醉剂的选择以及激光参数的设置。

所使用的特定小鼠模型可能对脉络膜新生血管（CNV）形成过程产生显著影响。目前最广泛使用的基因型是C57BL/6小鼠。实验动物的供应商来源也会影响最终CNV病灶的大小。Poor等人的研究显示，来自Jackson、Charles River和Taconic实验室的C57BL/6小鼠在最终CNV病灶大小上存在显著差异，其中来自Taconic的小鼠形成的CNV明显大于另两家供应商的小鼠⁴。因此，从同一家公司购买并统一使用同一供应商的小鼠，有助于最大限度地减少CNV病灶大小的外部差异。小鼠的年龄和性别在设计实验时也是需要考虑的重要因素。同龄雌性小鼠比雄性小鼠产生更多的CNV，而无论性别，年老小鼠均比年轻小鼠产生更多的CNV^22,23。根据实验参数的不同，操作者应充分考虑这些因素。例如，若操作者采用激光诱导CNV模型用于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
532 nm（绿色）氩离子眼科激光器	IRIDEX	GLx	任何532 nm（绿色）氩离子眼科激光器均可使用
裂隙灯	Carl Zeiss	30SL-M	只要与激光器兼容，任何裂隙灯均可使用
三溴乙醇	Sigma	T48402-25G	用于制备麻醉剂
叔戊醇	Sigma	152463-1L	用于制备麻醉剂
棕色玻璃小瓶 + 隔垫	Wheaton	WH-223696	三溴乙醇储存
擦拭纸巾	VWR	82003-820	杂项
1% 托吡卡胺	Falcon Pharmaceuticals	RXD2974251	瞳孔散大
0.5% 盐酸四甲卡因	Alcon	0065-0741-12	表面麻醉
人工泪液	Alcon	58768-788-25	保湿
热疗泵（用于动物保温）	Kent Scientific	HTP-1500	用于维持动物体温
加热垫	Kent Scientific	TPZ-0510EA	维持动物体温
30 G 胰岛素针头	BD	328418	腹腔注射麻醉
电子天平	American Weigh Scale	AWS-1KG-BLK	小鼠称重
盖玻片（25 mm × 25 mm）	VWR	48366089	压平角膜以观察小鼠视网膜
赛拉嗪	由机构提供	由机构提供	麻醉
氯胺酮	由机构提供	由机构提供	麻醉
Volocity	PerkinElmer		用于三维体积重建
ImageJ	美国国立卫生研究院		用于图像分析