微流控双乳液的生成通常涉及具有图案化润湿性的装置或定制制造的玻璃部件。本文介绍了一种全聚二甲基硅氧烷（PDMS）双乳液发生器的制备与测试方法，该发生器无需表面处理或复杂的制造工艺，能够生成低至14 µm的双乳液。
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摘要
摘要
双重乳液在多种生物和工业应用中具有重要作用，尤其适用于需要水相载体的场合。本文介绍了一种聚二甲基硅氧烷（PDMS）微流控装置，该装置采用同轴流聚焦结构，能够通过全软光刻技术制备，并生成水/油/水双重乳液。与使用玻璃毛细管的乳液装置类似，该装置可在具有均匀润湿性的微通道内形成双重乳液，且液滴尺寸远小于通道尺寸。三维流聚焦结构通过两层软光刻技术分别制备两块PDMS板，随后将两块板以蛤壳式结构对合而成。PDMS板上模制的互补锁合结构可实现各板表面特征的精确对准。装置测试结果表明，在使用抗污染和抗堵塞能力较强的大型通道时，可成功生成直径在14 µm至50 µm范围内的双重乳液。
引言
双重乳液由液滴组成，这些液滴通过一层中间不混溶流体与连续相分隔开来，因其在工业、制药和生物应用中的潜在用途而备受关注1。在某些情况下，能够在双重乳液核心中包封高价值化合物，使得材料得以保护并以可控方式释放。例如，药物可在不适合外部载体液体的溶解条件下被包封2。此外，中间油层可作为胶囊模板，用于药物、化妆品和营养物质的包封与递送3。在生物学领域，双重乳液还适用于高通量筛选，因为它们能够进行大量亚纳升级别的实验，并可通过荧光激活细胞分选仪（FACS）进行检测和分选4,5。
设计具有理想性能特征的双重乳液需要对双重乳液的尺寸、组成和均一性进行精确控制。尽管工业上使用膜乳化等批量乳化工艺，但所得乳液高度多分散，表现出广泛的功能特性1。液滴微流控领域天然适用于生成组分精确可控的单分散乳液6。微流控双重乳液的生成主要通过两种策略实现：逐级液滴生成和玻璃毛细管流动聚焦。可在平面PDMS器件中采用两步液滴生成工艺制备双重乳液。首先，在具有疏水通道壁的装置中，利用水包油液滴生成区域制备油包水乳液；随后，可将该乳液流动或重新注入具有亲水壁面、适用于油包水液滴生成的液滴生成区域4。然而，PDMS的亲水表面处理需要额外的加工步骤，且通常不具备持久性7。目前最可控且可重复的双重乳液制备方法是同轴流动聚焦技术，该技术最初由玻璃毛细管微流控系统实现，其原理是使包含三相的同心射流通过一个小孔口，在剪切作用下生成单分散液滴8。该技术能够产生远小于通道尺寸的液滴，双重乳液的精确尺寸和组成取决于各相的流速。由于液滴尺寸与通道尺寸之间存在显著差异，并且外层保护性鞘流可防止液滴接触通道壁，因此无需进行表面处理。然而，此类玻璃器件需要定制锥形毛细管尖端，并需精细组装和密封。先前的研究者曾利用3D软光刻技术基于流动聚焦原理生成双重乳液，但这些器件产生的乳液直径> 150 µm 9,10，大约比通常用FACS分选的物体大一个数量级。一种理想的替代方案应结合玻璃毛细管同轴流动聚焦的高稳定性和小液滴生成能力，以及PDMS软光刻易于制造的优点。
本文介绍一种使用同轴流聚焦技术生成≤ 50 µm乳液的双重乳液发生器，该装置完全采用三维软光刻技术制造11。我们的设备采用蛤壳式结构来制备装置，其中包含一个微小的剪切通道（图1），以模拟在拉制玻璃毛细管喷嘴中形成的乳液过程。更重要的是，这些装置无需特定的表面处理，全聚合物结构使得制造过程简便、可重复，并可大规模复制生产。本文概述了该双重乳液发生器的设计、制造和测试过程。实验表明，双重乳液的生成具有良好的稳定性和重复性，液滴直径可小至14 µm。该装置将功能性和易制造性相结合，为开发新型双重乳液应用提供了极具吸引力的选择。
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方案
1. SU8 模板制作
- 使用 AutoCAD 软件设计用于双层制作的微流控结构，并将设计图送至供应商以 10 µm 分辨率打印在电路板薄膜上。设备设计的详细信息见所附参考文献11 以及通道几何结构如图所示 图1各层应包含对准标记，以帮助对齐每层制造特征12.
- 将一片预先清洗过的直径3英寸的硅片放置在旋涂仪上，并打开真空使其固定在卡盘上。在硅片中心加入1 ml SU8-3035，先以500 rpm转速旋涂20秒，再以2,000 rpm转速旋涂30秒，形成厚度为50 µm的薄膜层。
- 取出晶圆，在135 °C的加热板上烘烤30分钟。待晶圆冷却至室温后再进行下一步操作。
- 将涂覆好的晶圆暴露于 1st 图层蒙版图2A在准直的190 mW、365 nm LED下照射90秒。曝光后，将晶圆置于135 °C的热板上1分钟，然后冷却至室温，再进行下一步操作。
- 将晶圆放置在旋涂仪上，打开真空使其固定在卡盘上。在晶圆中心加入1 ml SU8-2050，先以500 rpm转速旋涂20秒，再以1,375 rpm转速旋涂30秒，形成厚度增加135 µm的涂层层。
- 取出晶圆，在135 °C的加热板上烘烤30分钟，然后冷却至室温，再进行下一步操作。
- 对齐 2nd 图层蒙版 (图2B) 涂覆到1.3中已进行几何图案化的基底上，并将涂覆后的晶圆置于190 mW、365 nm的平行LED光下照射3分钟。曝光后，将其放置于135 °C的热板上1分钟，然后冷却至室温，再进行下一步操作。
- 将掩模浸入搅拌的丙二醇单甲醚醋酸酯溶液中30分钟以进行显影。用异丙醇清洗晶圆，并在135 °C的热板上烘烤1分钟。将显影后的母模置于100 mm培养皿中，用于PDMS成型。
2. PDMS 装置的制备
- 通过将 50 g 硅胶基质与 5 g 固化剂在塑料杯中混合，配制 10:1 的 PDMS。使用装有搅拌棒的旋转工具混合内容物。将混合物置于干燥器中脱气 30 分钟，或直至所有气泡被完全去除。
- 将 PDMS 倒在模具上，使其厚度达到 3 mm，并重新放入干燥器中进一步脱气。待所有气泡去除后，在 60 °C 下烘烤 2 小时以固化器件。
- 使用解剖刀从模具上切割下器件，并将其图案面朝上放置于清洁表面上。用剃刀片将 PDMS 模具切成两半，以分离 Master 1 与 Master 2（图 3a）。在由 Master 1 印制出 50 µm 流体通道结构的那部分上，使用 0.75 mm 活检打孔器打出流体入口和出口。
- 在 300 W 的等离子清洗机中，以 1 mbar 的 O2 等离子体处理器件 60 秒。在未打孔的 PDMS 片段表面滴加一滴去离子水，以暂时抑制 PDMS-PDMS 键合，并起到润滑作用。在体视显微镜下观察，将 Master 1 放置在 Master 2 的表面，并相对滑动两个表面，直至 图 3A 中的凹陷框架与凸起框架完全嵌合，实现机械锁定。
- 将器件放入 60 °C 烤箱中，将组装好的器件（图 3B）在 60 °C 下烘烤两天，以蒸发水分并完成键合。
3. 试剂的制备
- 用1 ml注射器吸取蒸馏水作为内相。
- 用1 ml注射器吸取含1 wt. %生物相容性表面活性剂的HFE 7500氟化油作为中间相13。
- 用10 ml注射器吸取含10 wt. %聚乙二醇（PEG）的水溶液，并加入1 wt. % Tween 20和1 wt. %十二烷基硫酸钠作为连续相。
4. 系统准备
- 将微流控芯片放置在倒置显微镜的载物台上，该显微镜需配备能够实现 < 100 µsec 快门速度的数字相机。
- 将所有注射器安装到注射泵上，并连接 27 G 针头。在针头上连接约 30 cm 长的 PE-2 管路，并将管路的自由端插入装置中相应预制的孔洞。
- 将一段 10 cm 长的 PE-2 管路插入装置的出口端，并将另一端置于废液收集容器中。
- 通过以较高速度（2,000 µl/min）运行注射泵对装置进行预灌注，直至管路段中的液体到达装置的进样口。
5. 乳液生成
- 将显微镜聚焦于包含50 µm × 50 µm孔口及下游出口通道的区域。
- 设置注射泵，使内相、中相和连续相的流速分别达到250 µl/hr、100 µl/hr和700 µl/hr，向双重乳液发生器输送液体，并等待10分钟以达到平衡。
- 保持内相和中相的流速分别为250 µl/hr和100 µl/hr，将外相流速设定为1,050 µl/hr。在此流速条件下等待3至5分钟，使双重乳液的生成趋于稳定。
- 以30 Hz的帧率采集5秒视频图像，用于后续通过手动图像分析进行离线处理。
- 根据表1中给出的流速，重复步骤5.3和5.4。内相和中相的流速保持不变，通过调节注射泵设置来改变载体相的流速。
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结果
双乳液发生器由使用3D PDMS制造技术制备的同轴流动聚焦装置组成（图1A）。该结构可使三相同轴射流被剪切进入一个50 µm × 50 µm的方形孔口，从而形成水/油/水双乳液（图1B、图1C）。内层水相与中间油相在通道尺寸为10 µm × 50 µm的交汇处汇合（图1D，点“1”）。由于PDMS具有疏水性，氟化油紧贴通道壁，而内相在流体以连续射流形式前进时保持在通道中心，直至到达突然扩张的通道区域（图1D，点“2”）。在此位置，内层两相被注入一个高320 µm的交汇区中心，使水相载流液能够相对同心地引入。三相随后被强制通过一个50 µm × 50 µm的孔口（图1D，点“3”），由于载流相的高流速，内层两相被剪切拉伸成细长的丝状结构，并断裂形成均一的液滴（图1E）。
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讨论
此处所述的双乳液生成结构旨在模拟玻璃毛细管装置的物理特性8. 在这些装置中，使用排列整齐的圆柱形玻璃毛细管产生三相同轴射流，并将其剪切形成均匀的双重乳液液滴。我们所用的3D PDMS装置的功能依赖于通过50 µm高度结构加工形成的微小特征的中心对准，以及总高度为320 µm的载流相通道。由2nd 步骤1.7中，若掩膜未准确对齐，则相对于50 µm高的结构可能出现层间错位。可通过在掩膜上设计对准标记（如同心圆）以辅助实现精确对齐，这些标记在光刻图形化过程中应重叠定位。该器件两个PDMS半片的等离子体键合是可能导致最终器件显著错位的第二个步骤。PDMS与PDMS的等离子体键合通常瞬时完成，因此在步骤2.4中，我们描述了用去离子水润湿器件表面以延缓键合过程，从而便于操作，实现图示对准框架的准确对齐 图3A 可以允许其锁定。如果在润湿不足的情况下进行操作，PDMS表面会在正确对齐前发生不可逆键合，导致装置必须丢弃，并重新制作新的PDMS模具。
双乳液装置的设计利用了能够形成均匀疏水表面特性的制造技术。然而，在本方...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作获得了加州定量生物科学研究所（QB3）研究奖、罗杰斯家族基金会“弥合差距奖”、加州大学旧金山分校/桑德勒基金会突破性生物医学研究计划、巴斯夫公司资助以及美国国家科学基金会通过教师早期职业发展（CAREER）计划（DBI-1253293）提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 光刻掩模 | CadArt Servcies | ||
| 3" 硅片，P型，未使用测试级 | University Wafers | 447 | |
| SU-8 3035 | Microchem | Y311074 | |
| SU-8 2050 | Microchem | Y111072 | |
| Sylgard 184 硅橡胶弹性体试剂盒 | Krayden | 4019862 | |
| 1 ml 注射器 | BD | 309628 | |
| 10 ml 注射器 | BD | 309604 | |
| 27 号针头 | BD | 305109 | |
| PE 2 聚乙烯管 | Scientific Commodities, Inc. | B31695-PE/2 | |
| Novec 7500 | Fisher Scientific | 98-0212-2928-5 | 通常称为 HFE 7500 |
| 生物相容性表面活性剂 | Ran Biotechnologies | 008-FluoroSurfactant | |
| 35,000 MW PEG | Sigma Aldrich | 1546660 | |
| Tween 20 | Sigma Aldrich | P1369 | |
| 十二烷基硫酸钠 | Sigma Aldrich | L3771 |
参考文献
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