需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

11.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53528

⸱

2016年3月13日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Molecular and Cellular Neuroscience, Nencki Institute of Experimental Biology, 2Department of Biochemistry, Nencki Institute of Experimental Biology, 3Neurobiology Centre, Nencki Institute of Experimental Biology

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry 的腺相关病毒。这些技术可实现对压后皮层中依赖于经验的结构可塑性的长期监测。

摘要

本视频展示了允许对小鼠后压部皮层（RSC）神经元进行慢性成像的开颅手术操作 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠品系中进行双光子显微成像。该方法为研究行为干预与神经元形态变化之间的相关性提供了可能 体内.

颅窗植入手术以往被认为仅限于桶状区等易于接近的皮层区域。我们的方法实现了对高度血管化的压后皮层（RSC）中神经元的可视化观察。RSC 是负责空间记忆的脑环路中的重要组成部分，此前被认为难以进行此类研究。 体内 双光子成像

在压后皮层（RSC）上方植入颅窗的同时，将表达mCherry的重组腺相关病毒（rAAVmCherry）注射至背侧海马。表达的mCherry会沿海马至RSC的轴突投射扩散，从而实现对皮层中突触前轴突终扣和突触后树突棘变化的可视化观察。

该技术可实现对后扣带皮层（RSC）中依赖经验的结构可塑性的长期监测。

引言

双光子显微镜彻底改变了在活体且行为正常的动物中观察脑活动的方式。自1990年引入以来，该技术迅速获得广泛认可，现已成为体内研究脑活动多个方面的最重要且最具创新性的方法之一in vivo1,2。这些应用包括血流测量、神经元激活（例如，利用钙离子水平指示剂或即早基因表达）以及神经元细胞的形态学研究。越来越多的实验室正在使用双光子显微镜，使该技术在全球范围内成为in vivo脑成像的新标准。

标准方法包括在小鼠脑的桶状皮层或视觉皮层上方植入颅窗（颅骨上覆盖盖玻片的圆形开孔）3。随后，根据实验方案，小鼠将经历一系列成像和行为训练过程，从而实现对脑活动和神经元形态随时间变化的监测4,5。在这两种情况下，开颅仅影响顶骨，不跨越颅缝。目前普遍认为，该技术的主要缺点是其应用局限于桶状皮层或视觉皮层等易于接近的皮层区域。在其他脑区植入颅窗会面临诸多困难，主要由于出血过多和/或空间阻碍所致。

本文提出将颅窗植入后压部皮层（RSC）上方，作为双光子成像的另一个可能感兴趣区域 体内 显微镜技术 6RSC 是负责空间记忆形成的大脑回路中的一个重要组成部分。从解剖学上看，RSC 是连接大脑皮层、海马和丘脑区域的神经网络的一部分。 7它广泛参与多种行为过程，例如空间学习、消退以及空间导航 6.

为了观察神经元的形态学变化，我们使用了一种转基因小鼠品系，该品系在thy1启动子驱动下表达绿色荧光蛋白（GFP）。在这些小鼠中，大脑约10%的神经元表达GFP，从而可通过双光子显微镜清晰地观察皮层轴突和树突8。我们提出的另一项创新是将携带红荧光蛋白（mCherry）基因的重组腺相关病毒血清型2/1（rAAV2/1），在神经元特异性camkii启动子驱动下9，注射到向压后皮层（RSC）投射的深部脑区（如海马体）中。在Thy1-GFP小鼠的海马体中表达rAAV2/1mCherry，可实现海马-皮层突触的突触前和突触后结构的同步可视化10。rAAV驱动的mCherry表达需要两到三周时间，才能使蛋白在轴突末梢达到足够水平。这一时间段与开颅手术后通常所需的恢复时间一致。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

以下所述所有实验程序均经波兰科学院实验生物学奈恩基研究所当地伦理委员会批准。

注意：相关视频中的某些画面已加速。这些画面会标明加速倍数。

1. 手术准备

  1. 将所有工具、盛装液体的玻璃容器和棉签在高压灭菌器中灭菌。使用一次性手套。用70%乙醇清洁手术台、立体定位仪及周围区域。使用无菌手术垫为所有已灭菌设备创建无菌操作空间。将明胶海绵切成小块，并浸泡于无菌生理盐水中。
    注意：根据《实验动物护理与使用指南》，乙醇既不是灭菌剂，也不是高效消毒剂。它仅可用于已灭菌表面的清洁/去脂处理。
  2. 将动物放入诱导室，设置异氟烷浓度为5%，氧气流速为2 L/min。此过程应持续约3分钟。
  3. 将动物从诱导室中取出，通过夹捏尾部或脚趾来确认动物是否已完全麻醉。
  4. 使用精密修剪器将动物头部后方（耳间区域）至眼睛之间的毛发剃净。
  5. 将动物固定于立体定位仪中，并使用耳杆稳定头部。
  6. 将麻醉水平调整为1.5–2%异氟烷和0.3 L/min氧气。
  7. 涂抹眼膏以保护角膜。
  8. 皮下注射托尔法啶（Tolfedine，4 mg/kg）、布托米多（Butomidor，2 mg/kg）和拜菌素（Baytril，5 mg/kg），分别用于预防炎症、疼痛和感染。
  9. 肌肉注射地塞米松（Dexamethasone，0.2 mg/kg）以预防脑肿胀。
    注意：也可选择皮下或腹腔注射地塞米松，以避免肌肉损伤。
  10. 使用浸有聚维酮碘的无菌棉签清洁皮肤，随后用70%乙醇擦拭。
  11. 更换手套并用70%乙醇喷洒手套表面。
    注意：使用一次性手套时，切勿触碰无菌区域。仅可使用无菌手术器械尖端和无菌棉签接触动物。

2. 颅窗手术

  1. 用镊子提起皮肤，使用显微剪刀沿头部基部水平剪开皮肤，然后斜向剪至两眼之间的前点。移除皮肤瓣。
  2. 用无菌棉签将利多卡因软膏涂抹于骨膜上，以防止过度出血和疼痛。
  3. 使用无菌棉签或手术刀去除骨膜。用无菌棉签将颅骨表面擦干。
  4. 用无菌针头将浓稠的氰基丙烯酸酯胶水涂在皮肤边缘，以固定皮肤并防止其与牙科水泥接触。等待胶水完全干燥。
  5. 将一片无菌的3 mm盖玻片置于人字缝前方的颅骨上。将盖玻片中心定位在RSC坐标处：前后方向（AP），前囟后2.8 mm；内外方向（ML），前囟0。用无菌针头在颅骨表面划痕标记盖玻片的边缘。随后将盖玻片放回含70%乙醇的无菌容器中。
  6. 使用带小直径钻头的高速牙科钻，在颅骨上刻画出一个直径3 mm的圆形轮廓。用蘸有无菌生理盐水的棉签清除钻孔区域的骨屑。使用明胶海绵和棉签止住偶尔出现的出血，并清洁骨面。
  7. 在钻孔过程中，用精细镊子轻轻触碰骨环，检查其活动度，以评估骨厚度。请注意，缝线区域的骨质较厚。当骨环已可活动，且周围仅剩一层均匀而薄的骨质时，停止钻孔。用蘸有生理盐水的棉签彻底清除手术区域残留的所有骨屑。
  8. 在钻孔区域滴加无菌生理盐水，覆盖已钻出的圆形区域。用精细镊子小心撬起骨环，然后向上轻柔而稳固地将其完全取出。提起骨环时需注意避免倾斜，以防损伤硬脑膜。
  9. 将浸有无菌生理盐水的明胶海绵轻轻贴附于硬脑膜表面，以帮助止血。等待直至所有出血完全停止。小心移除明胶海绵，避免干扰凝血过程。
    注意：缝线区域血管丰富，此处出血可能较为严重。必须留出足够时间，确保出血彻底停止。将浸有生理盐水的明胶海绵置于冰上冷却，有助于控制出血。

3. 病毒注射

  1. 将输注泵连接到立体定位仪塔架上，并连接控制器。
  2. 将35G针头插入注射器中。用乙醇冲洗注射器10次以进行消毒，再用无菌生理盐水冲洗10次以去除乙醇残留。排除注射器中的气泡。将注射器插入泵中。
    注意：可考虑使用其他消毒剂。
  3. 解冻单剂量的rAAV2/1mCherry制剂（推荐使用1012 pfu），并置于冰上保存。用病毒溶液填充注射器。
  4. 将针头对准前囟中心，然后使用以下坐标轻柔地插入海马：前后（AP）-2，内外（ML）+/- 1.0，上下（DV）-1。这些坐标将位于颅骨开窗边缘附近。等待5 min 使组织稳定。
  5. 以50 nl/min的速度注射0.7 µl的rAAV2/1mCherry溶液。等待10 min 使病毒充分吸附。轻柔地拔出针头。若出现出血，用明胶海绵轻压止血。对对侧位点重复上述操作。

4. 颅窗植入

  1. 将无菌干燥的盖玻片放置在颅骨钻孔框架内硬脑膜的表面。用镊子夹住盖玻片，轻轻压平硬脑膜，并使盖玻片边缘贴近颅骨表面。
    注意： 盖玻片可能会破坏血凝块并导致再次出血。若发生此情况，请抬起盖玻片，将其放入酒精中，干燥后返回步骤 2.9。
  2. 使用无菌针头将浓稠的氰基丙烯酸酯胶水涂抹在盖玻片边缘，以将其固定于颅骨上。等待胶水完全干燥。
  3. 在颅骨前部放置一个固定杆（M2 螺母或定制设计）。将氰基丙烯酸酯胶水涂在固定杆的边缘上。等待胶水干燥。
    1. 放置固定杆时应确保其位置可在成像过程中实现颅窗的水平定位。应尽可能将其置于远离颅窗的位置。若固定杆过于靠近颅窗，则其本身及连接定制夹持器的螺钉可能在成像过程中阻碍物镜。
  4. 制备牙科水泥，并将其涂抹于盖玻片周围的颅骨表面。围绕颅窗形成类似火山口的结构较为有利，以便在后续使用水浸物镜成像时容纳滴加的液体。
  5. 使用牙科水泥制作一个覆盖帽，包裹手术区域其余部分、皮肤边缘、固定杆，并加固颅窗周围的火山口结构。等待牙科水泥完全硬化。
  6. 将动物从立体定位仪中取出，并放入恢复舱内。
  7. 在动物术后恢复期间持续监测其生理功能。
  8. 术后给予镇痛处理（卡洛芬，10 mg/kg）和抗生素治疗（拜耳灵，5 mg/kg），持续 48 小时。

5. 成像

  1. 启动钛宝石激光器，开启显微镜电源。本实验所用系统配备双光子激光器、OPO系统和双GaAsP PMT检测器。
  2. 将动物放入诱导室中进行麻醉诱导。
  3. 将动物从诱导室中取出，置于显微镜下的气体麻醉面罩中。将氧气流速降至0.3 L/min，异氟烷浓度调至1.5–2%。
  4. 使用M2螺丝（或其他定制系统）将动物固定在定制的显微镜框架上，并调平颅窗。
    注意：也可使用显微镜制造商提供的头部固定系统，但特定的定制框架效果更佳（在慢性实验的多次成像过程中可提供更好的头部稳定性与位置一致性）。
  5. 使用宽场显微镜设置和低倍物镜，将视野中心对准压后皮层一侧，并聚焦于盖玻片表面。
  6. 在杯状丙烯酸井内滴加一滴水。切换至长工作距离水浸物镜，将物镜缓慢移向颅窗，直至水的弯月面连接样品与物镜。
  7. 切换至双光子成像模式，使用最低放大倍数从上至下开始扫描样品。硬脑膜的穿过位置会表现为强烈的非特异性信号闪光。
  8. 根据荧光细胞的信号强度，调整两个通道（GFP和mCherry）的显微镜采集参数，以覆盖整个动态范围。
  9. 找到合适的神经元（其树突结构与其他细胞分离）后，仅使用GFP滤光片组进行初始扫描，设置最低放大倍数和5微米的z轴步进距离。
  10. 对扫描获得的图像序列生成最大强度投影图，并打印用于标注（使用反色显示）。
  11. 设定合适的放大倍数，以便成像所需的形态学细节。以最大强度投影图为引导，在GFP和mCherry通道中完整成像整个树突树。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

Thy1-GFP 报告小鼠中部分神经元表达 GFP，使得 体内 RSC中皮层树突及局部轴突投射的成像 图 1A 显示一系列图像的最大强度投影，可见多条GFP阳性树突。细胞体被一条动脉遮挡。 图 1B 显示的是1A中标记的树突分支的单平面放大图像（数码放大3倍）。树突形态的细节（如树突棘、丝状伪足）清晰可见。GFP通道通过使用500-550 nm带通发射滤光片采集。

将rAAV2/1mCherry注射至背侧海马体，可实现海马体轴突及终止于压后皮层（RSC）的突触小结的可视化观察。这些终末结构可通过mCherry荧光通道（带通发射滤光片570-610 nm）进行检测。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

本文中，我们介绍了一种用于同步双光子 体内 通过颅窗对RSC中的突触输入和突触后靶点进行成像。植入手术包括以下几个关键步骤：首先，将动物深度麻醉并固定于立体定位仪中，随后沿标记的圆形线用钻头磨薄RSC上方的颅骨，并移除圆形骨片。止血后，注射rAAV2/1mCherry 注射到海马体中，盖玻片固定在钻孔区域的颅骨上。最后将固定杆固定在动物头部，将动物置于恢复室中48小时。经过约2至3周的病毒表达期后，可观察到压后皮层（RSC）。成像流程包括以下步骤：首先，将动物麻醉并固定在显微镜下；然后使用宽场显微镜调焦，将系统切换至双光子模式，并观察目标通道（GFP和mCherry）。

所介绍的技术相较于先前描述的方案具有显著改进。在标准方法中，仅能检测一种类型的标记物，可用于成像局部轴突投射和树突结构，但无法进行长距离连接性研究。通过结合两种荧光蛋白，我们实现了对突触前和突触后结构的同步示踪，从而允许长期 体内 假定突触连接的监测

为了在所述操作中获得最佳结果，需注意若干关键步骤。在...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者（K.L.、M.R.、K.R.）对本文所使用的Holder支架拥有待批准专利（PL410001）的权利。

致谢

作者感谢 M. Steczkowski 提供语音录制，M. Borczyk 提供绘图，A. Trąbczyńska 提供病毒制备，M. Ziókowska 提供基因分型，以及 A. Mirgos 在拍摄过程中提供的协助。K.R. 感谢 K. Deisseroth 惠赠在 CaMK 启动子控制下表达荧光蛋白 mCherry 的重组腺相关病毒（rAAV）。本项目在实验生物学奈恩基研究所神经生物学中心的动物模型实验室和组织结构与功能实验室核心设施完成，并使用了由欧洲联盟—欧洲区域发展基金通过运营计划资助的 CePT 基础设施 "创新经济" 2007-2013 年期间的工作得到了波兰国家科学中心资助：K.R. 获得 Sonata Bis 2012/05/E/NZ4/02996、Harmonia 2013/08/M/NZ3/00861 和 Symfonia 2013/08/W/NZ24/00691 项目资助，R.C. 获得 Sonata Bis 2014/14/E/NZ4/00172 项目资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
药物
异氟烷BaxterAErrane 8DG9623术前 5-2%
异氟烷BaxterAErrane 8DG9623术中 1.5-2%
地塞米松Scan VetDexasone 2mg/ml0.2 mg/kg 肌内注射
拜耳动保（Baytril）Bayer2.50%5 mg/kg 皮下注射
托法丁Vetoquinol4%4 mg/kg 皮下注射
布托咪啶Richter Pharma10 mg/ml2 mg/kg 皮下注射
卡洛芬KRKA-PolskaRycarfa 50mg/ml10 mg/kg 皮下注射
利多卡因JelfaLignocainum局部使用
利多卡因Jelfa20 mg/g局部使用
手术材料
明胶海绵EthiconSpongostan dental；货号 MS0005
眼膏DedraLubrithal局部使用
CA 胶Pelikan Daniel20G Huste
牙科丙烯酸树脂SpofaDentalDuracryl Plus
立体定位仪Stoelting51500D
工具
盖玻片Harvard ApparatusHSE-64-0720直径 3 mm
牙科钻SigmedKeystone KVet
固定杆定制N/A可使用 M2 或 M3 螺母
镊子RenexPN-7B-SA
显微剪刀FalconBM.183.180
解剖显微镜KOZOXTL6445T
成像
持镜架定制N/A
双光子显微镜Zeiss直立式 Axio Examiner Z1激光单元：Coherent Chameleon 690-1040nm 激光器，配备光学参量振荡器（1050-1300nm）。物镜：EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 和 LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0。检测系统：Zeiss 带通滤光片 BP 500-550（GFP）和 BP 570-610（mCherry），由 560nm 分光镜分离，并耦合至两个 GaAsP 光电探测器。 
试剂
病毒由 K. Deisseroth 赠送携带 CaMK 启动子驱动的荧光蛋白 mCherry 的重组腺相关病毒（rAAV）

参考文献

  1. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3, 489-496 (2006).
  2. Svoboda, K., Yasuda, R. Principles of two-photon excitation microscopy and its applications to neuroscience. Neuron. 50, 823-839 (2006).
  3. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420, 788-794 (2002).
  4. Holtmaat, A., et al. Imaging neocortical neurons through a chronic cranial window. Cold Spring Harb Protoc. 2012, 694-701 (2012).
  5. Chow, D. K., et al. Laminar and compartmental regulation of dendritic growth in mature cortex. Nat Neurosci. 12, 116-118 (2009).
  6. Czajkowski, R., et al. Encoding and storage of spatial information in the retrosplenial cortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 111, 8661-8666 (2014).
  7. Czajkowski, R., et al. Superficially projecting principal neurons in layer V of medial entorhinal cortex in the rat receive excitatory retrosplenial input. J Neurosci. 33, 15779-15792 (2013).
  8. Feng, G., et al. Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP. Neuron. 28, 41-51 (2000).
  9. Couey, J. J., et al. Recurrent inhibitory circuitry as a mechanism for grid formation. Nat Neurosci. 16, 318-324 (2013).
  10. Miyashita, T., Rockland, K. S. GABAergic projections from the hippocampus to the retrosplenial cortex in the rat. European Journal of Neuroscience. 26, 1193-1204 (2007).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

双光子成像颅窗植入AAV注射Thy1-GFP小鼠mCherry表达海马投射树突棘成像突触可塑性监测活体显微成像
双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。