双光子同步 在体 内 小鼠压后皮层突触输入与突触后靶标的成像

摘要

本视频展示了开颅手术操作，该手术可实现对小鼠压后皮层神经元的长期成像 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠中进行双光子显微成像，并结合向背侧海马注射表达 mCherry 的腺相关病毒。这些技术可实现对压后皮层中依赖于经验的结构可塑性的长期监测。

摘要

本视频展示了允许对小鼠后压部皮层（RSC）神经元进行慢性成像的开颅手术操作 体内 在 Thy1-GFP 转基因小鼠品系中进行双光子显微成像。该方法为研究行为干预与神经元形态变化之间的相关性提供了可能 体内.

颅窗植入手术以往被认为仅限于桶状区等易于接近的皮层区域。我们的方法实现了对高度血管化的压后皮层（RSC）中神经元的可视化观察。RSC 是负责空间记忆的脑环路中的重要组成部分，此前被认为难以进行此类研究。 体内 双光子成像

在压后皮层（RSC）上方植入颅窗的同时，将表达mCherry的重组腺相关病毒（rAAV^mCherry）注射至背侧海马。表达的mCherry会沿海马至RSC的轴突投射扩散，从而实现对皮层中突触前轴突终扣和突触后树突棘变化的可视化观察。

该技术可实现对后扣带皮层（RSC）中依赖经验的结构可塑性的长期监测。

引言

双光子显微镜彻底改变了在活体且行为正常的动物中观察脑活动的方式。自1990年引入以来，该技术迅速获得广泛认可，现已成为体内研究脑活动多个方面的最重要且最具创新性的方法之一in vivo^1,2。这些应用包括血流测量、神经元激活（例如，利用钙离子水平指示剂或即早基因表达）以及神经元细胞的形态学研究。越来越多的实验室正在使用双光子显微镜，使该技术在全球范围内成为in vivo脑成像的新标准。

标准方法包括在小鼠脑的桶状皮层或视觉皮层上方植入颅窗（颅骨上覆盖盖玻片的圆形开孔）³。随后，根据实验方案，小鼠将经历一系列成像和行为训练过程，从而实现对脑活动和神经元形态随时间变化的监测^4,5。在这两种情况下，开颅仅影响顶骨，不跨越颅缝。目前普遍认为，该技术的主要缺点是其应用局限于桶状皮层或视觉皮层等易于接近的皮层区域。在其他脑区植入颅窗会面临诸多困难，主要由于出血过多和/或空间阻碍所致。

本文提出将颅窗植入后压部皮层（RSC）上方，作为双光子成像的另一个可能感兴趣区域 体内 显微镜技术 ⁶RSC 是负责空间记忆形成的大脑回路中的一个重要组成部分。从解剖学上看，RSC 是连接大脑皮层、海马和丘脑区域的神经网络的一部分。 ⁷它广泛参与多种行为过程，例如空间学习、....

方案

以下所述所有实验程序均经波兰科学院实验生物学奈恩基研究所当地伦理委员会批准。

注意：相关视频中的某些画面已加速。这些画面会标明加速倍数。

1. 手术准备

1. 将所有工具、盛装液体的玻璃容器和棉签在高压灭菌器中灭菌。使用一次性手套。用70%乙醇清洁手术台、立体定位仪及周围区域。使用无菌手术垫为所有已灭菌设备创建无菌操作空间。将明胶海绵切成小块，并浸泡于无菌生理盐水中。
   注意：根据《实验动物护理与使用指南》，乙醇既不是灭菌剂，也不是高效消毒剂。它仅可用于已灭菌表面的清洁/去脂处理。
2. 将动物放入诱导室，设置异氟烷浓度为5%，氧气流速为2 L/min。此过程应持续约3分钟。
3. 将动物从诱导室中取出，通过夹捏尾部或脚趾来确认动物是否已完全麻醉。
4. 使用精密修剪器将动物头部后方（耳间区域）至眼睛之间的毛发剃净。
5. 将动物固定于立体定位仪中，并使用耳杆稳定头部。
6. 将麻醉水平调整为1.5–2%异氟烷和0.3 L/min氧气。
7. 涂抹眼膏以保护角膜。
8. 皮下注射托尔法啶（Tolfedine，4 mg/kg）、布托米多（Butomidor，2 mg/kg）和拜菌素（Baytril，5 mg/kg），分别用于预防炎症、疼痛和感染。
9. 肌肉注射地塞米松（Dexame....

结果

Thy1-GFP 报告小鼠中部分神经元表达 GFP，使得 体内 RSC中皮层树突及局部轴突投射的成像 图 1A 显示一系列图像的最大强度投影，可见多条GFP阳性树突。细胞体被一条动脉遮挡。 图 1B 显示的是1A中标记的树突分支的单平面放大图像（数码放大3倍）。树突形态的细节（如树突棘、丝状伪足）清晰可见。GFP通道通过使用500-550 nm带通发射滤光片采集。

将rAAV2/1^mCherry注射至背侧海马体，可实现海马体轴突及终止于压后皮层（RSC）的突触小结的可视化观察。这些终末结构可通过mCherry荧光通道（带通发射滤光片570-610 nm）进行检测。

讨论

本文中，我们介绍了一种用于同步双光子 体内 通过颅窗对RSC中的突触输入和突触后靶点进行成像。植入手术包括以下几个关键步骤：首先，将动物深度麻醉并固定于立体定位仪中，随后沿标记的圆形线用钻头磨薄RSC上方的颅骨，并移除圆形骨片。止血后，注射rAAV2/1^mCherry 注射到海马体中，盖玻片固定在钻孔区域的颅骨上。最后将固定杆固定在动物头部，将动物置于恢复室中48小时。经过约2至3周的病毒表达期后，可观察到压后皮层（RSC）。成像流程包括以下步骤：首先，将动物麻醉并固定在显微镜下；然后使用宽场显微镜调焦，将系统切换至双光子模式，并观察目标通道（GFP和mCherry）。

所介绍的技术相较于先前描述的方案具有显著改进。在标准方法中，仅能检测一种类型的标记物，可用于成像局部轴突投射和树突结构，但无法进行长距离连接性研究。通过结合两种荧光蛋白，我们实现了对突触前和突触后结构的同步示踪，从而允许长期 体内 假定突触连接的监测

为了在所述操作中获得最佳结果，需注意若干关键步骤。在.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
药物
异氟烷	Baxter	AErrane 8DG9623	术前 5-2%
异氟烷	Baxter	AErrane 8DG9623	术中 1.5-2%
地塞米松	Scan Vet	Dexasone 2mg/ml	0.2 mg/kg 肌内注射
拜耳动保（Baytril）	Bayer	2.50%	5 mg/kg 皮下注射
托法丁	Vetoquinol	4%	4 mg/kg 皮下注射
布托咪啶	Richter Pharma	10 mg/ml	2 mg/kg 皮下注射
卡洛芬	KRKA-Polska	Rycarfa 50mg/ml	10 mg/kg 皮下注射
利多卡因	Jelfa	Lignocainum	局部使用
利多卡因	Jelfa	20 mg/g	局部使用
手术材料
明胶海绵	Ethicon	Spongostan dental；货号 MS0005
眼膏	Dedra	Lubrithal	局部使用
CA 胶	Pelikan Daniel	20G Huste
牙科丙烯酸树脂	SpofaDental	Duracryl Plus
立体定位仪	Stoelting	51500D
工具
盖玻片	Harvard Apparatus	HSE-64-0720	直径 3 mm
牙科钻	Sigmed	Keystone KVet
固定杆	定制	N/A	可使用 M2 或 M3 螺母
镊子	Renex	PN-7B-SA
显微剪刀	Falcon	BM.183.180
解剖显微镜	KOZO	XTL6445T
成像
持镜架	定制	N/A
双光子显微镜	Zeiss	直立式 Axio Examiner Z1	激光单元：Coherent Chameleon 690-1040nm 激光器，配备光学参量振荡器（1050-1300nm）。物镜：EC-PLAN-NEUFLUAR 10x/0.1 和 LD Plan-APOCHROMAT 20x/1.0。检测系统：Zeiss 带通滤光片 BP 500-550（GFP）和 BP 570-610（mCherry），由 560nm 分光镜分离，并耦合至两个 GaAsP 光电探测器。
试剂
病毒	由 K. Deisseroth 赠送		携带 CaMK 启动子驱动的荧光蛋白 mCherry 的重组腺相关病毒（rAAV）