本方案利用电穿孔技术将荧光标记的蛋白质导入小鼠肌纤维并使其表达。电穿孔后经恢复，分离肌纤维。随后使用高分辨率共聚焦显微镜对单根纤维进行成像，以观察肌肉结构。
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摘要
摘要
成熟的肌肉具有独特的结构，适合进行活细胞成像。本文描述了在趾短屈肌（flexor digitorum brevis, FDB）中表达荧光标记蛋白的实验方案。该方法的条件已优化，可在最小化肌肉损伤的同时，获得大量高质量表达电穿孔质粒的肌纤维。本方法采用多种蛋白的荧光标记技术，结合高分辨率共聚焦显微镜，可实现活细胞成像，包括激光诱导损伤后的成像。荧光染料与荧光标记蛋白成像相结合，可提供关于肌肉基本结构及其对刺激反应的信息。
引言
单个肌纤维是体积大且高度有序的合胞体细胞。目前存在一些用于肌肉研究的细胞培养模型，但这些模型的主要局限性在于无法完全分化为成熟的肌纤维。例如，C2C12 和 L6 细胞系分别来源于小鼠和大鼠 1-4在血清饥饿条件下，单核 "成肌细胞样" 细胞停止增殖，退出细胞周期，并启动成肌程序，形成具有肌节的多核细胞，称为肌管。在长期培养条件下，肌管可能表现出收缩特性。 "抽搐" 在培养中。人类细胞系也已建立 5除了这些永生化细胞系外，还可从肌肉组织中分离单核成肌细胞，在类似的血清饥饿条件下可形成肌管。这些细胞系和原代成肌细胞培养物具有很高的研究价值，因其可转染质粒或通过病毒转导，用于研究基本的细胞生物学过程。然而，这些细胞即使在诱导形成肌管后，仍缺乏成熟肌肉组织的许多显著特征。具体而言，肌管远小于成熟的单个肌纤维，且不具备肌纤维的正常形态。更重要的是，肌管缺乏横行（T-）小管系统，而T-小管是实现高效Ca²⁺2+ 在整个肌浆中释放。
一种替代原代成肌细胞或成肌细胞系的方法是使用成熟的肌纤维。可通过转基因技术实现标签蛋白的表达，但该方法成本较高且耗时较长。 体内 小鼠肌肉电穿孔已成为一种首选方法，因其具有快速和可靠的特点 6-10.
方法 体内 电穿孔及肌纤维的高效分离已针对小鼠趾短屈肌（FDB）进行优化 6方法操作简便，且对诱导过程的侵入性极小 体内 质粒表达。该方法现已结合高分辨率成像技术，包括激光破坏肌膜后的成像。 6,7荧光染料与荧光标记蛋白的表达相结合，可用于监测成熟肌纤维中的细胞生物学过程。
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方案
本研究中的方法均按照西北大学范伯格医学院机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准的指南，以符合伦理的方式进行。已尽一切努力将动物痛苦降至最低。
1. 实验步骤 体内 小鼠足底短屈肌（FDB）肌束的电穿孔
- 设计质粒 体内 使用已知可在哺乳动物细胞中表达的启动子进行表达（例如， 巨细胞病毒（cytomegalovirus, CMV）或肌肉中（例如， 肌酸激酶（肌肉型），MCK 6,7较大的质粒可能表达水平较低。CMV 启动子已被广泛使用 6,7.
- 从质粒中纯化 E. coli 按照制造商说明，在无内毒素条件下操作。将质粒溶解于无菌、无内毒素的TE缓冲液中，浓度为2–5 µg质粒/µl。
- 将质粒稀释并分装，每份加入无菌微量离心管中，每管含20 µg DNA溶于10 µl无菌无内毒素TE缓冲液（2 µg/µl），每次注射准备一份。
- 将透明质酸酶储备液用不含钙和镁的无菌磷酸盐缓冲液（PBS-/-）稀释至1倍浓度，使终浓度为8单位。将稀释后的透明质酸酶每10 µl分装至无菌微量离心管中，用于每次注射。
- 使用2.5%异氟烷麻醉小鼠，直至其进入镇静状态，对尾部或足趾夹捏无反应。将动物仰卧置于加热垫或加热台上，以维持正常体温。
- 用聚维酮碘消毒液和酒精交替擦拭小鼠足垫，从针刺部位开始向外周呈放射状进行，共重复三次。该操作技术可保持针刺部位的无菌状态，最大限度减少病原体的引入。
- 向小鼠足垫注射 10 µl 的 1x 透明质酸酶溶液（2 mg/ml = 使用无菌1 ml注射器在皮肤与肌肉之间注射8单位的透明质酸酶。透明质酸酶可降解细胞外基质成分，从而促进质粒更高效地进入肌纤维。进针部位位于足跟底部，将针头朝向脚趾方向推进。在回撤针头过程中缓慢释放液体。皮下注射部位会逐渐隆起并开始呈现粉红色。
- 在对侧足部重复步骤 1.6 和 1.7。
- 断开麻醉装置，将小鼠放回笼中。让小鼠完全从麻醉状态中恢复。
- 等待2小时。
- 重复麻醉和足部消毒步骤，即步骤1.5和1.6。
- 以与注射透明质酸酶相同的方式将稀释后的质粒DNA注射至足垫。确保最大注射体积不超过20 µl。对于双质粒共表达，每种质粒注射20 µg，总体积不超过20 µl。
- 在对侧足垫重复质粒注射，或使用对侧足垫进行对照注射。
- 在最初注射的足部，用精细镊子将皮肤从下方肌肉上轻轻提起，在靠近脚趾的皮球处，沿足跟到脚趾连线的垂直方向插入一根27 G针头。取第二根无菌的27 G针头，从足跟处水平穿过皮肤。将两根针头平行放置，间距约为1 cm。
- 使用鳄鱼夹将电极夹在平行的针上，确保针之间不相互接触。可使用模型黏土固定夹子的位置。
- 将电极连接到电刺激器上。
- 通过施加20个脉冲（每个持续20毫秒，频率1 Hz，电压100 V/cm）对肌肉进行电穿孔。刺激时脚趾可能会出现抽动。
- 如有需要，对对侧足部重复进行刺激操作。
- 移除针头。用聚维酮碘擦洗足垫。
- 关闭麻醉。将小鼠放回恢复笼中并监测其活动情况。若操作按预期进行，动物应在30分钟内恢复正常的行走能力，且行走能力或活动水平与注射前行为无差异。因此，无需术后镇痛处理。待小鼠恢复后，将其送回动物饲养室。
注意：电穿孔后最早可在48小时检测蛋白表达。然而，为使电穿孔后的肌纤维更充分恢复，我们更倾向于在电穿孔后7至14天进行肌纤维的分离与研究。 10电穿孔后长达4周仍可进行表达检测。
2. 分离趾短屈肌（FDB）纤维的实验步骤
- 解冻胶原酶。为每束FDB肌肉准备12孔细胞培养板中的两个孔：在一个孔中加入1 ml预热的含牛血清白蛋白的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM + BSA），在另一个孔中加入1 ml预热的林格氏液。此外，在35 mm Sylgard培养皿中加入10 ml新鲜的1×林格氏液。
- 通过吸入CO2或麻醉气体处死动物，随后进行颈椎脱位或其他确保死亡的方法。
- 使用干净的剃须刀片在踝关节上方切除后足，并将其浸入35 mm Sylgard培养皿中的1× 林格氏液中。
- 用30 G针头将一只足底朝上紧密固定在Sylgard培养皿上，针头穿过五个脚趾尖端及踝部。
- 从踝部开始，沿足侧毛发分界线垂直剪开皮肤至脚趾，注意不要损伤皮下肌肉。在足的另一侧重复此操作。
- 用精细镊子夹住踝部基底的皮肤，横向剪断足跟处的皮肤。
- 用镊子提起皮肤瓣，将剪刀尖朝向皮肤方向，避免损伤肌肉。剪断下方结缔组织，从而完整去除皮肤。
- 为分离FDB肌束，先剪断足跟处的大肌腱以使其脱离骨骼。用镊子夹住肌腱，小心使用剪刀将FDB肌束从白色主肌腱上分离，并去除附着在FDB上的任何结缔组织。若操作正确，肌束可轻松从下方肌腱上剥离，暴露出通向各脚趾的亮白色肌腱。在靠近脚趾的肌腱处切断FDB，使肌束完全脱离足部。
- 将整个肌束放入含有DMEM + BSA的孔中。
- 在对侧足重复上述步骤。
- 所有FDB肌肉分离完成后，在每孔含DMEM + BSA和肌肉的溶液中加入100 µl胶原酶。
- 在消化前，使用倒置荧光显微镜检查电穿孔效果。若操作得当，转染效率可高达90%以上。
- 将培养板置于湿度控制、37 °C、10% CO2的培养箱中孵育约1小时。孵育时间可能因疾病模型、遗传背景及胶原酶批次不同而有所变化。
- 1小时后，小心将FDB肌束转移至仅含林格氏液的孔中。
- 使用1 ml移液器在含林格氏液的孔中吹打FDB肌束。用干净剃须刀片切去移液器吸头末端，使肌束能顺利通过吸头。轻柔吹打肌肉约15次，使肌束沿吸头方向上下移动。完整的肌纤维将逐渐从肌束脱落进入林格氏液中。若肌纤维不易脱落，可将肌肉重新放回胶原酶溶液中继续消化。
- 将分离的肌纤维接种至培养皿中，每皿约500 µl。
- 让肌肉在孔中继续消化15分钟。
- 重复步骤2.15至2.17，直至肌束体积明显缩小且大部分肌纤维已从肌束解离（通常共需2–3次）。解离完全后，肌肉可轻松通过1 ml移液器吸头。
- 让肌纤维在培养皿中贴壁至少15分钟。可根据时间安排向培养皿中添加新鲜林格氏液以稀释残留胶原酶，或更换溶液。
注意：肌纤维现已准备好用于成像。
3. 使用共聚焦显微镜观察激光诱导膜损伤的实验步骤
- 成像前立即用300 µl含2.5 µM FM 1-43或FM 4-64染料的Ringer溶液孵育肌纤维。通常在分离后15分钟至2小时内对肌纤维进行成像。 然而，分离后最长可在24小时内进行成像。
- 将玻璃底培养皿置于配备紫外激光器和60X/63X物镜的共聚焦显微镜上。
- 定位一条肌纤维。通过轻敲显微镜底座确保肌纤维牢固贴附于培养皿表面。排除在解离过程中受损的肌纤维。受损肌纤维可能表现出膜出泡、大量摄取FM染料、严重卷曲或弯曲等现象。
- 为在肌纤维上诱导膜损伤，将肌膜置于成像视野中央，并选择无细胞核干扰的区域。使用FM染料通道对肌膜进行聚焦，使其图像极为清晰。
- 利用FM 4-64通道将感兴趣区域（ROI）十字光标定位在肌膜上。
- 以80%功率照射1个像素点，持续3秒（约350 nm × 350 nm区域）。FM染料将在损伤部位进入细胞。可根据需要调整功率和照射时间，以增大或减小损伤范围。
- 在损伤前、损伤瞬间、损伤后每2秒以及随后每10秒采集肌纤维图像，持续至多5分钟。可根据实验需求调整时间间隔。单张图像可在Image J中转换为时间序列视频。
- 在每皿最多3条肌纤维上重复步骤3.3至3.7。
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结果
电穿孔是一种微创技术，可高效地将纯化的质粒DNA导入趾短屈肌（FDB）肌束（图1A）。转染后7天，可在分离的肌纤维中观察到荧光标记的蛋白（图1B）。随后将分离的纤维接种并制备用于共聚焦显微镜成像。纤维可接受激光诱导的损伤。FM染料可用于识别细胞膜损伤部位（图1C）
在消化过程中，少数肌纤维可能会受到损伤（白色箭头）（图2A）。受损的肌纤维可通过肌膜（肌纤维细胞膜）上出现的膜出泡现象进行识别（黑色箭头）。受损纤维不适合进一步实验，不应使用。代表性共聚焦图像显示了荧光融合蛋白在分离得到的肌纤维中的表达情况（图2B）。使用CMV启动子可在肌纤维中驱动最佳的蛋白表达水平。DIC成像显示一条状态良好的肌纤维。在损伤发生前，FM 4-64在膜上的信号水平较低（图2C
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讨论
利用电穿孔技术研究荧光标记蛋白 体内 非常适合用于肌肉研究，因为目前尚无能够真实再现肌肉完整细胞结构的合适细胞系模型。本方案描述了如何利用电穿孔和高分辨率共聚焦显微镜技术，对激光损伤后蛋白质的定位与转位进行详细成像。该方法可进一步拓展用于研究其他细胞过程，包括细胞骨架重组、物质运输及细胞融合。
采用本方案，FDB肌束中最多可达90%的肌纤维表达质粒，无论在肌纤维解离前还是解离后，均可通过荧光显微镜轻松观察到。通常表达呈梯度分布，靠近注射部位的区域表达水平较高。由于存在表达梯度，因此可在单次实验中监测不同蛋白表达水平的影响。与所有转染方法一样，该方法受限于过表达相关的问题。值得注意的是，在高水平表达时可能发生蛋白质聚集。根据我们的经验，mCherry荧光标签比增强型绿色荧光蛋白（eGFP）标签更容易发生聚集，导致蛋白结构域的分辨率和清晰度下降（例如参见7中的图4）。此外，mTurquise2和Venus荧光标签均能实现足够的荧光表达，但两者的荧光亮度均低于eGFP。
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致谢
本工作得到了美国国立卫生研究院基金 NS047726、NS072027 和 AR052646 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11995-073 | 解剖介质 稀释方法：50 ml +100 g BSA |
| 胶原酶 II 型 | Life Technologies | 17101-015 | 肌纤维消化 稀释方法：160 mg / 4 ml DMEM（储存液为 40 mg/ml 分装） |
| Falcon 12 孔板 | Fisher Scientific | 877229 | 肌纤维消化 |
| Ringers 溶液 | 肌纤维消化与成像 稀释方法：146 mM NaCl 5 mM KCl 2 mM CaCl2 1 mM MCl2 10 mM HEPES pH7.4 in H2O | ||
| 1 ml 移液器 | Axygen | T-1000-C-R | 消化 |
| 剃须刀片 | Personna | 94-120-71 | 消化 |
| Precision Glide 30 G 针头 | BD Biosciences | 305128 | 解剖 |
| 1x PBS (-/-) | Life Technologies | 14190-250 | 解剖 |
| Sylgard 184 | Fisher Scientific | 50-366-794 | 解剖 |
| 镊子 | FST by Dumont | #5/45 | 解剖 |
| 镊子 | Roboz | RS-4913 | 解剖 |
| 剪刀 | World Precision Instruments | 500260 | 解剖 |
| BSA | Sigma | A7906 | 解剖介质 稀释方法：100 mg/50 ml DMEM |
| Falcon 60 mm 培养皿 | Fisher Scientific | 08772B | 解剖——用于盛放 Sylgard |
| 黏土 | 电穿孔 | ||
| 刺激器 | Grass | s88x | 电穿孔 |
| 夹子 | Radio Shack | 270-356 | 电穿孔 |
| 三碘季胺酚（Triadine） | Aplicare | 82-220 | 电穿孔 |
| Precision Glide 27 G 针头 | BD Biosciences | 305136 | 电穿孔 |
| 模拟器 | Grass | SIU-V | 电穿孔 |
| 纱布 | Covidien | 2146 | 电穿孔 |
| 透明质酸酶 | Sigma | H4272 | 注射 稀释方法：将 160 µl PBS (1x) 加入 40 µl 5x 储存液中 |
| 1 cc U-100 胰岛素注射器 (28G1/2) | BD Biosciences | 329420 | 注射 |
| Eppendorf 管 | Fisher Scientific | 02-682-550 | 注射 |
| 35 mm 玻底小培养皿 | MaTek | P35G-1.5-14-C | 显微成像 |
| FM 4-64 | Life Technologies | T-13320 | 显微成像 稀释方法：终浓度 2.5 µg/ml |
| FM 1-43 | Life Technologies | T-35356 | 显微成像 稀释方法：终浓度 2.5 µg/ml |
| 无内毒素质粒大提试剂盒 | Qiagen | 12362 | 质粒纯化 |
参考文献
- Blau, H. M., et al. Plasticity of the differentiated state. Science. 230, 758-766 (1985).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270, 725-727 (1977).
- Richler, C., Yaffe, D. The in vitro cultivation and differentiation capacities of myogenic cell lines. Dev Biol. 23, 1-22 (1970).
- Yaffe, D. Retention of differentiation potentialities during prolonged cultivation of myogenic cells. Proc Natl Acad Sci USA. 61, 477-483 (1968).
- Mamchaoui, K., et al. Immortalized pathological human myoblasts: towards a universal tool for the study of neuromuscular disorders. Skelet muscle. 1, 34(2011).
- DiFranco, M., Quinonez, M., Capote, J., Vergara, J. DNA transfection of mammalian skeletal muscles using in vivo electroporation. J Vis Exp: JoVE. , (2009).
- Swaggart, K. A., et al. Annexin A6 modifies muscular dystrophy by mediating sarcolemmal repair. Proc Natl Acad Sci USA. 111, 6004-6009 (2014).
- Kerr, J. P., et al. Dysferlin stabilizes stress-induced Ca2+ signaling in the transverse tubule membrane. Proc Natl Acad Sci USA. 110, 20831-20836 (2013).
- Anderson, D. M., et al. A micropeptide encoded by a putative long noncoding RNA regulates muscle performance. Cell. 160, 595-606 (2015).
- Roche, J. A., et al. Physiological and histological changes in skeletal muscle following in vivo gene transfer by electroporation. Am J Physiol Cell Physiol. 301, C1239-1250 (2011).
- Reddy, A., Caler, E. V., Andrews, N. W. Plasma membrane repair is mediated by Ca(2+)-regulated exocytosis of lysosomes. Cell. 106, 157-169 (2001).
- Wang, B., et al. Membrane blebbing as an assessment of functional rescue of dysferlin-deficient human myotubes via nonsense suppression. J Appl physiol. 109, 901-905 (2010).
- Cai, C., et al. MG53 nucleates assembly of cell membrane repair machinery. Nat Cell Biol. 11, 56-64 (2009).
- Marg, A., et al. Sarcolemmal repair is a slow process and includes EHD2. Traffic. 13, 1286-1294 (2012).
- Bansal, D., et al. Defective membrane repair in dysferlin-deficient muscular dystrophy. Nature. 423, 168-172 (2003).
- Defour, A., et al. Dysferlin regulates cell membrane repair by facilitating injury-triggered acid sphingomyelinase secretion. Cell Death Dis. 5, e1306(2014).
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