利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

摘要

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus¹²⁹ × Mus castaneus）的F1胚胎干细胞中研究基因转录的等位基因特异性调控。

摘要

增强子通过以位置和方向无关的方式调控组织特异性基因表达来控制细胞身份。这些增强子通常位于被调控基因远端的基因间区域，甚至位于另一个基因的内部。增强子活性的位置无关性使得将增强子与其所调控的基因进行匹配变得困难。删除增强子区域可为增强子活性提供直接证据，并且是揭示增强子在内源性基因转录中作用的金标准。基于传统同源重组的删除方法已被近年来基因组编辑技术的进步所超越，后者能够对多种模式生物的基因组进行快速且精确定位的修改。由于Cas9可通过定制表达质粒中的向导RNA轻松靶向基因组，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑可快速、低成本地在多种细胞类型和生物体中实现基因组操作。对关键基因调控元件进行纯合删除可能导致致死性或改变细胞表型，而对转录增强子进行单等位基因删除则可在避免此类混杂因素的情况下研究基因表达的cis调控。本文介绍了一种在F1小鼠胚胎干细胞（ES细胞）（Mus musculus¹²⁹ × Mus castaneus）中进行CRISPR/Cas9介导的删除的实验方案。由于这两种等位基因之间平均每125 bp就存在一个单核苷酸多态性（SNP），因此可利用这些SNP实现单等位基因删除后的筛选与表达分析。

引言

转录调控元件在发育过程中对基因表达进行时空精细调控至关重要¹，这些元件的改变可因基因异常表达而导致疾病²。全基因组关联研究鉴定出的许多疾病相关区域位于非编码区，并具有转录增强子的特征^3-4。由于增强子通常位于其所调控基因数千碱基之外，且可能以组织特异性方式被激活，因此识别增强子并将其与靶基因匹配具有较大挑战性^5-6。增强子的预测通常基于组蛋白修饰标记、中介复合物-黏连蛋白复合体以及细胞类型特异性转录因子的结合情况^7-10。对预测增强子的验证通常通过基于载体的检测方法进行，即增强子激活报告基因的表达^11-12。这些数据可提供关于候选增强子序列调控潜力的重要信息，但无法揭示其在内源基因组环境中的功能，也无法确定其所调控的基因。基因组编辑技术可通过功能缺失分析，成为研究转录调控元件在其内源基因组背景下功能的有力工具。

基因组编辑技术的最新进展，特别是CRISPR/Cas9基因组编辑系统，促进了对基因组功能的研究。CRISPR/Cas9系统操作简便，且适用于多种生物体系。Cas9蛋白通过向导RNA（gRNA）被靶向至基因组中的特定位点¹³。SpCas9/gRNA复合物在基因组中扫描其靶序列，该序列必须位于原间隔序列邻近基序（PAM）序列NGG的5'端^14-15。gRNA与其靶序列（一段与gRNA互补的20个核苷....

方案

1. 设计与构建gRNA

1. 要删除转录增强子区域，需使用两个gRNA，分别位于目标区域的5'端和3'端。利用张实验室生成的小鼠UCSC基因组浏览器轨迹来鉴定唯一的gRNA序列（http://www.genome-engineering.org¹⁵）。接下来，使用桑格研究所提供的在线工具（www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211）检查这些gRNA及其相邻的PAM序列中的SNP和indel^27-28为实现对两个等位基因的同等编辑效率，应避免选择包含单核苷酸多态性（SNP）或插入缺失突变（indel）的gRNA/PAM序列。
   1. 选择gRNA时，需确认是否能够设计出用于基因分型检测缺失的等位基因特异性引物。有关等位基因特异性引物设计，请参见第5节。
2. 根据 Mali 描述的方案组装两个 gRNA 质粒 等 2013¹⁵将选定的20 bp特异性靶序列整合到61mer寡核苷酸中，如下所示 表7 （序列以5'至3'方向显示，加粗的碱基为20 bp的靶序列，彼此互为反向互补序列）。
   1. 将10 µl 10 µM gRNA Primer_F与10 µl 10 µM互补Primer_R加入同一离心管中混合。
   2. 通过将引物混合物在100 °C孵育5分钟，....

结果

本方案使用F1 ES细胞进行研究 cis-利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术生成的单等位基因增强子缺失细胞中基因表达的调控图1）。基因分型和基因表达分析中的gRNA及等位基因特异性引物设计是该方法的关键因素。每对等位基因特异性引物均需通过qPCR验证其等位基因特异性。理想情况下，等位基因特异性引物应仅扩增其对应的基因组DNA靶标（图2）。理想情况下，这些引物在其3'端应包含一个SNP。若引物对等位基因的特异性较低，则需确保其在扩增正确基因型与错误基因型时的Ct值差异至少达到5个循环。²⁵. 引物的SNP位点位于更偏5'端的位置^th 从3'端起始的引物通常无法表现出等位基因特异性，会以相同的效率扩增两种基因型，这凸显了SNP在引物中位置的重要性³⁴此外，研究表明，嘌呤/嘌呤或嘧啶/嘧啶替换对结果具有更大的影响 T_m 两种引物之间的差异相较于嘌呤/嘧啶替换

讨论

CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术为基因组修饰提供了一种简便、快速且经济的方法。本文详述的方法利用 F1 小鼠细胞中的 SNP 来生成并分析单等位基因增强子缺失，以实现对功能增强子的表征。该方法的优势包括：1）单等位基因增强子缺失不会导致关键增强子在两个等位基因上同时缺失所引发的混杂效应，i.e.，靶基因蛋白表达水平大幅降低，进而引起细胞致死或表型改变；2）若单等位基因缺失频率较低，则获得纯合缺失的可能性较小；然而，通过在基因表达分析中使用等位基因特异性引物，仍可对携带单等位基因缺失的克隆进行分析；3）使用四对引物筛选单等位基因缺失，可排除含有部分缺失或大片段缺失的克隆，避免对后续分析造成干扰。

等位基因特异性引物设计对于基因分型单等位或双等位CRISPR缺失以及以等位基因特异性方式分析其对基因表达的影响至关重要。当所使用的F1细胞含有更频繁的SNP时，这种区分两个等位基因的操作更容易实现。本文使用由Mus musculus¹²⁹与Mus castaneus杂交产生的胚胎干细胞（ES细胞）；然而，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Phusion高保真DNA聚合酶	NEB	M0530S	用于gRNA组装的高保真DNA聚合酶
Gibson Assembly Master Mix	NEB	E2611L
gRNA_克隆载体	Addgene	41824	将目标序列克隆到该载体中以构建gRNA质粒
pCas9_GFP	Addgene	44719	密码子优化的 SpCas9 与 EGFP 共表达质粒
AflII	NEB	R0520S
EcoRI	NEB	R3101S
Neon 转染系统 100 µL 型试剂盒	Life Technologies	MPK10096	微孔电穿孔转染技术
prepGEM	ZyGEM	PT10500	基因组DNA提取试剂
Nucleo Spin Gel &和 PCR 产物纯化	Macherey-Nagel	740609.5
高速质粒小提试剂盒	Geneaid	PD300
内毒素去除型大提质粒试剂盒	Geneaid	PME25
SYBR select mix for CFX	Life Technologies	4472942	qPCR 试剂
iScript cDNA合成试剂盒	伯乐（Bio-rad）	170-8891	逆转录试剂
含EDTA的0.25%胰蛋白酶	Life Technologies	25200072
不含 Ca/Mg 的 PBS2+	Sigma	D8537
0.5 M EDTA	Bioshop	EDT111.500
HBSS	Life Technologies	14175095
1 M HEPES	Life Technologies	13630080
BSA 第 V 组分（7.5%）	Life Technologies	15260037
Max Efficiency DH5α 感受态细胞	Invitrogen	18258012
FBS	ES细胞鉴定合格		FBS需在小鼠ES细胞中进行多能性预测试
DMSO	Sigma	D2650
Glutamax	Invitrogen	35050
DMEM	Life Technologies	11960069
青霉素/链霉素	Invitrogen	15140
丙酮酸钠	Invitrogen	11360
非必需氨基酸	Invitrogen	11140
β-巯基乙醇	Sigma	M7522
96孔板	Sarstedt	83.3924
封口胶带	Sarstedt	95.1994
CoolCell LX	Biocision	BCS-405	无酒精细胞冻存容器
CHIR99021	Biovision	1748-5	F1 ES细胞培养抑制剂
PD0325901	Invivogen	inh-pd32	F1 ES细胞培养抑制剂
LIF	Chemicon	ESG1107	F1 ES细胞培养抑制剂