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方法文章

利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能

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DOI：

10.3791/53552

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2016年4月2日

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1Department of Cell and Systems Biology, University of Toronto

本文内容

摘要

通过功能缺失分析是验证增强子活性的最佳方法。本文介绍了一种高效方案，利用CRISPR/Cas9介导的缺失技术，在含有杂合基因组（Mus musculus129 × Mus castaneus）的F1胚胎干细胞中研究基因转录的等位基因特异性调控。

摘要

增强子通过以位置和方向无关的方式调控组织特异性基因表达来控制细胞身份。这些增强子通常位于被调控基因远端的基因间区域，甚至位于另一个基因的内部。增强子活性的位置无关性使得将增强子与其所调控的基因进行匹配变得困难。删除增强子区域可为增强子活性提供直接证据，并且是揭示增强子在内源性基因转录中作用的金标准。基于传统同源重组的删除方法已被近年来基因组编辑技术的进步所超越，后者能够对多种模式生物的基因组进行快速且精确定位的修改。由于Cas9可通过定制表达质粒中的向导RNA轻松靶向基因组，CRISPR/Cas9介导的基因组编辑可快速、低成本地在多种细胞类型和生物体中实现基因组操作。对关键基因调控元件进行纯合删除可能导致致死性或改变细胞表型，而对转录增强子进行单等位基因删除则可在避免此类混杂因素的情况下研究基因表达的cis调控。本文介绍了一种在F1小鼠胚胎干细胞（ES细胞）（Mus musculus129 × Mus castaneus）中进行CRISPR/Cas9介导的删除的实验方案。由于这两种等位基因之间平均每125 bp就存在一个单核苷酸多态性（SNP），因此可利用这些SNP实现单等位基因删除后的筛选与表达分析。

引言

转录调控元件在发育过程中对基因表达进行时空精细调控至关重要1，这些元件的改变可因基因异常表达而导致疾病2。全基因组关联研究鉴定出的许多疾病相关区域位于非编码区，并具有转录增强子的特征3-4。由于增强子通常位于其所调控基因数千碱基之外，且可能以组织特异性方式被激活，因此识别增强子并将其与靶基因匹配具有较大挑战性5-6。增强子的预测通常基于组蛋白修饰标记、中介复合物-黏连蛋白复合体以及细胞类型特异性转录因子的结合情况7-10。对预测增强子的验证通常通过基于载体的检测方法进行，即增强子激活报告基因的表达11-12。这些数据可提供关于候选增强子序列调控潜力的重要信息，但无法揭示其在内源基因组环境中的功能，也无法确定其所调控的基因。基因组编辑技术可通过功能缺失分析，成为研究转录调控元件在其内源基因组背景下功能的有力工具。

基因组编辑技术的最新进展，特别是CRISPR/Cas9基因组编辑系统，促进了对基因组功能的研究。CRISPR/Cas9系统操作简便，且适用于多种生物体系。Cas9蛋白通过向导RNA（gRNA）被靶向至基因组中的特定位点13。SpCas9/gRNA复合物在基因组中扫描其靶序列，该序列必须位于原间隔序列邻近基序（PAM）序列NGG的5'端14-15。gRNA与其靶序列（一段与gRNA互补的20个核苷酸（nt）序列）发生碱基配对后，激活SpCas9的核酸酶活性，从而在PAM序列上游3个碱基对（bp）处产生双链断裂（DSB）。特异性主要依赖于gRNA种子区域（即紧邻PAM的6–12 nt区域）的完全碱基配对；相反，种子区域5'端的错配通常可被容忍16-17。所产生的DSB可通过非同源末端连接（NHEJ）DNA修复或同源定向修复（HDR）机制进行修复。NHEJ DNA修复常在靶位点引入几个碱基对的插入或缺失（indels），从而破坏基因的开放阅读框（ORF）。为了在基因组中产生较大的缺失，可使用两个gRNA，分别位于目标区域的两侧18-19。该策略在研究转录增强子时尤为有用，特别是那些成簇分布于位点控制区或超级增强子中的增强子，其规模大于传统的增强子9,18,20-22。

单等位基因缺失是研究的宝贵模型 顺式转录调控。在单等位基因增强子缺失后观察到的转录水平变化，能够反映该增强子在基因调控中的作用，同时避免了双等位基因转录同时受影响可能带来的细胞适应性干扰。然而，若无法区分缺失等位基因与野生型等位基因，则难以评估表达水平的降低情况。此外，在无法区分两个等位基因的情况下，对每个等位基因进行缺失基因分型具有挑战性，尤其是对于大片段缺失而言。 >10 kb 至 1 Mb23 难以通过PCR扩增整个野生型区域。使用通过杂交产生的F1胚胎干细胞 Mus musculus129 与 Mus castaneus 通过等位基因特异性PCR可区分两个等位基因18,24这些细胞中的杂合基因组有利于进行等位基因特异性缺失筛选和表达分析。这两个基因组之间平均每125个碱基对就存在一个单核苷酸多态性（SNP），为表达分析和基因分型分析中的引物设计提供了灵活性。单个SNP的存在可能影响引物的熔解温度（Tm以及在实时定量PCR（qPCR）扩增中实现目标特异性，从而能够区分两个等位基因25此外，引物3'端的错配会极大影响DNA聚合酶从引物延伸的能力，从而阻止非目标等位基因的扩增26以下方案描述了利用CRISPR/Cas9基因组编辑系统对F1胚胎干细胞进行等位基因特异性增强子删除（删除片段大于1 kb）及后续表达分析的方法图1).

基因编辑过程；Cas9-gRNA，DNA双链断裂；示意图和PCR结果；CRISPR方法。
图1. 利用CRISPR/Cas9删除增强子以研究cis-调控基因表达。(A) 通过Mus musculus129与Mus castaneus杂交获得的F1胚胎干细胞（ES细胞），可用于实现等位基因特异性的删除。(B) 使用两种向导RNA（gRNA）诱导Cas9介导的大片段增强子区域删除。(C) 使用多组引物鉴定大片段的单等位基因和双等位基因缺失。橙色引物为内侧引物，紫色引物为外侧引物，绿色引物为gRNA侧翼引物。(D) 通过等位基因特异性qPCR监测基因表达变化。RFU表示相对荧光单位。请点击此处查看该图的放大版本。

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方案

1. 设计与构建gRNA

  1. 要删除转录增强子区域，需使用两个gRNA，分别位于目标区域的5'端和3'端。利用张实验室生成的小鼠UCSC基因组浏览器轨迹来鉴定唯一的gRNA序列（http://www.genome-engineering.org15）。接下来，使用桑格研究所提供的在线工具（www.sanger.ac.uk/sanger/Mouse_SnpViewer/rel-1211）检查这些gRNA及其相邻的PAM序列中的SNP和indel27-28为实现对两个等位基因的同等编辑效率，应避免选择包含单核苷酸多态性（SNP）或插入缺失突变（indel）的gRNA/PAM序列。
    1. 选择gRNA时，需确认是否能够设计出用于基因分型检测缺失的等位基因特异性引物。有关等位基因特异性引物设计，请参见第5节。
  2. 根据 Mali 描述的方案组装两个 gRNA 质粒 等 201315将选定的20 bp特异性靶序列整合到61mer寡核苷酸中，如下所示 表7 （序列以5'至3'方向显示，加粗的碱基为20 bp的靶序列，彼此互为反向互补序列）。
    1. 将10 µl 10 µM gRNA Primer_F与10 µl 10 µM互补Primer_R加入同一离心管中混合。
    2. 通过将引物混合物在100 °C孵育5分钟，然后以1 °C/秒的速率降温至25 °C，使引物退火。此步骤可使用PCR仪，或将试管置于沸水中，随后自然冷却至室温。
    3. 向退火引物混合物中加入以下反应体系，并在72 °C孵育30分钟以延伸各引物：18.5 µl 水、10 µl 5x HF缓冲液、1 µl 10 mM dNTP混合物和0.5 µl高保真DNA聚合酶。
    4. 在2%琼脂糖凝胶上电泳10 µl目标片段，以确认已生成100 bp的引导片段。
    5. 线性化gRNA载体（由George Church惠赠；Addgene质粒# 41824）15 与 AflII，使用以下反应体系：5 µl gRNA 载体骨架（2-4 µg）、5 µl 10x 缓冲液、3 µl AflII（20 单位/µl）和 32 µl 水。将反应混合物在 37 °C 下孵育 3 小时。
    6. 在1%琼脂糖凝胶上电泳跑胶，使用凝胶回收试剂盒按照生产商说明书纯化对应于3.5 kb线性化gRNA载体的DNA条带。
    7. 设置Gibson组装反应29-30 使用线性化的gRNA载体和第1.2.3步获得的目标片段进行如下反应：线性gRNA载体1 µl（50 ng/µl），目标片段1 µl，2x Gibson组装预混液10 µl，水8 µl。在50 °C孵育反应体系60分钟。
  3. 转化 E.coli gRNA 载体构建完成的细胞
    1. 将1.2.7中构建的gRNA载体1 µl与50 µl DH5α混合大肠杆菌 将菌株细胞加入离心管中。采用热激法转化DH5α细胞，即将细胞置于42 °C下45秒。
    2. 将离心管在冰上快速冷却5分钟；然后加入400 µl SOC培养基，在37 °C摇床培养箱中孵育45分钟。
    3. 将100 µl DH5α细胞涂布于含卡那霉素（50 µg/ml）的LB平板上，用于转化细胞的阳性筛选，并于37 °C过夜培养。
  4. 筛选阳性 E.coli gRNA插入用菌落。
    1. 挑取一个卡那霉素抗性菌落，重悬于3 ml含有50 µg/ml卡那霉素的LB培养基中。对6–8个菌落重复相同操作，将所有试管置于37 °C摇床中过夜培养。
    2. 使用质粒小提试剂盒，按照生产商说明书从过夜培养的菌液中提取质粒。
    3. 制备一种 EcoRI 消化反应体系以检测质粒中gRNA序列的插入情况。每个样品的反应体系配制如下：2 µl 酶缓冲液，1 µl EcoRI，15 µl 水。将反应混合物分装至1.5 ml离心管中，每管加入2 µl质粒。37 °C孵育2小时。
    4. 将消化产物在1.5%琼脂糖凝胶上电泳。
      注意：含有插入片段的样品将显示一条475 bp的条带，比无插入片段的克隆大100 bp。
      注意：也可使用 Sp6（正向）和 T7（反向）引物通过菌落 PCR 筛选阳性克隆（表7）与载体序列结合，在存在gRNA插入片段时产生642 bp大小的片段。当存在以下情况时，菌落PCR方法具有优势： EcoRgRNA序列中的I型限制性位点
  5. 使用T7引物通过DNA测序确认gRNA插入片段的序列。

2. 转染

注意：电穿孔是一种将质粒转染到胚胎干细胞中的高效方法。此处描述的方法采用微孔电穿孔转染技术。

  1. 在含有10 ml ES细胞培养基（表1）的10 cm明胶包被培养皿中，于37 °C、5% CO2条件下培养F1 ES细胞。当细胞融合度达到85%时，吸除培养基，加入2 ml胰蛋白酶。在CO2培养箱中37 °C孵育5分钟。
    注意：F1 ES细胞由Barbara Panning24提供，可根据要求获取。
  2. 加入10 ml离心培养基（表2）以中和胰蛋白酶。反复吹打，使细胞完全脱离。
  3. 将所有细胞收集至15 ml离心管中，在300 × g条件下离心5分钟。用3 ml PBS重悬细胞，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪进行细胞计数。
  4. 在1.5 ml离心管中，以300 × g离心5分钟收集1 × 106个ES细胞，然后用试剂盒厂商提供的100 µl R（重悬）缓冲液重悬细胞。
  5. 分别加入5 µg的pCas9_GFP质粒（由Kiran Musunuru惠赠；Addgene质粒# 44719）31以及用于删除目标区域的5'和3' gRNA质粒，用移液器轻轻混匀，避免产生气泡。
  6. 使用电子移液器吸头吸取100 µl电穿孔混合液，注意避免吸头中产生气泡。
  7. 设置电穿孔的电压、脉宽和脉冲次数。对于F1 ES细胞，使用1,400 V、10毫秒，共3次脉冲。
  8. 在电穿孔过程中观察吸头，注意溶液中是否出现火花。火花表明存在气泡，会影响转染效率。
  9. 将转染后的ES细胞滴加至含有10 ml ES细胞培养基（表1）的10 cm明胶包被培养皿中，于37 °C、5% CO2条件下孵育。

3. FACS 分选转染细胞

  1. 48 小时后，加入 2 ml 胰蛋白酶使细胞脱落，并在 CO2 培养箱中 37 °C 下孵育 5 分钟。
  2. 加入 10 ml 收集缓冲液（表 3）中和培养板。将细胞收集至 15 ml 离心管中，以 300 × g 离心 5 分钟。
  3. 弃去上清液，将细胞重悬于 1 ml 分选缓冲液（表 4）中。计数细胞，并根据分选平台要求进行稀释。若将细胞分选至 15 ml 离心管中，稀释至 0.5–1 × 106 个细胞/ml；若将单个细胞直接分选至 96 孔板中，则稀释至 2–5 × 106 个细胞/ml。
  4. 使用 FACS 流式细胞仪32 分选 Cas9-GFP+ ES 细胞。将大量细胞收集至含 2 ml 恢复培养基（表 5）的离心管中，并按照步骤 3.5 所述进行铺板以用于克隆挑取；或直接将单个细胞分选至包被明胶的 96 孔板中，每孔含 100 µl ES 细胞培养基（表 1）。
  5. 在含 10 ml ES 细胞培养基（表 1）的 10 cm 明胶包被培养皿中接种 1–1.5 × 104 个 GFP+ ES 细胞。以如此低密度铺板有助于挑取单个 ES 细胞克隆。

4. 用于基因分型、表达分析及冻存细胞株的克隆培养

  1. 分选后第4-5天，对直接分选的96孔板中每一孔进行胚胎干细胞（ES细胞）克隆形成情况评分。
    1. 移除培养基，加入30 µl胰蛋白酶，使ES细胞克隆解离。在37 °C孵育5分钟。加入170 µl ES细胞培养基（表1）中和胰蛋白酶，并反复吹打使克隆完全解离为单细胞。将细胞在37 °C/5% CO2条件下培养，直至大多数孔的细胞融合度超过70%（通常为2-3天）。
  2. 或者，在倒置显微镜下从10 cm培养皿中挑取单个ES细胞克隆。将克隆吸入移液枪头后，参照步骤4.1.1，将每个克隆放入经明胶预处理并含有30 µl胰蛋白酶的96孔板的一个孔中。
    注意：在挑取整行克隆期间，克隆可在室温下暂时保存于胰蛋白酶中。
  3. 待所有克隆均被挑取并解离至培养基中后，将细胞在CO2培养箱中37 °C条件下继续培养，直至大多数孔的细胞融合度超过70%（通常为2天）。
  4. 当96孔板准备进行传代时，吸除培养基，每孔加入30 µl胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。每孔加入180 µl ES细胞培养基（表1）中和胰蛋白酶，并反复吹打使细胞完全解离为单细胞。
  5. 从所得的210 µl细胞悬液中，取70 µl接种至三个经明胶包被的96孔板中，每孔预先加入130 µl ES细胞培养基（表1）。这些板分别用于后续的基因型鉴定、表达分析以及每个克隆的细胞冻存。
  6. 当基因型鉴定板的细胞融合度达到70-85%时，按照第6节"基因型鉴定缺失"中的描述处理该板。
  7. 当表达分析板的细胞融合度达到70-85%时，吸除培养基，用封板膜密封，并在-80 °C保存，直至完成克隆的基因型鉴定。
    注意：表达分析板可用于分析克隆早期传代时基因表达的变化。虽然可直接从96孔板进行基因表达分析，但由于细胞数量较少，建议使用RNA微量提取试剂盒。
  8. 96孔板细胞冻存的制备：
    1. 当用于冻存的96孔板（stock-1）细胞融合度达到70-85%时，吸除培养基，每孔加入30 µl胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。
    2. 每孔加入100 µl ES细胞培养基（表1）中和胰蛋白酶，并反复吹打使细胞完全解离为单细胞。
    3. 将每孔15 µl细胞悬液转移至两个经明胶包被的96孔板中，每孔预先加入185 µl ES细胞培养基（表1），并在37 °C/5% CO2条件下培养。
      注意：此为stock-2和stock-3板，作为stock-1细胞复苏失败时的备用备份克隆。
  9. 同时，向96孔板（stock-1）中剩余的100 µl细胞悬液中加入100 µl 2倍冻存液（表6）。用封板膜密封板子，并迅速倒置4-5次以充分混匀。将板子置于-80 °C保存，直至完成克隆的基因型鉴定。
  10. 当stock-2和stock-3板准备进行冻存时，吸除培养基，每孔加入30 µl胰蛋白酶，在37 °C孵育5分钟。每孔加入70 µl ES细胞培养基（表1）中和胰蛋白酶，并反复吹打使细胞完全解离为单细胞。
  11. 每孔加入100 µl 2倍冻存液，用封板膜密封板子，并迅速倒置4-5次以充分混匀。将板子置于-80 °C保存，直至需要使用这些板时。

5. 等位基因特异性引物设计

  1. 设计4组引物（图1C）以筛选具有目标缺失的克隆：内侧引物、外侧引物以及分别针对5'和3' gRNA靶位点的gRNA侧翼引物，具体步骤如下：
    1. 在 http://labs.csb.utoronto.ca/mitchell/crispr.html 获取对应于129和Cast基因型的SNP轨道。所提供的轨道显示了在mm9小鼠基因组组装坐标中129与Cast之间的碱基替换。
      注意：上述网站的链接将重定向至UCSC基因组浏览器，并添加一个包含129与Cast基因组之间SNP的自定义轨道。
    2. 输入待删除区域的坐标。在目标缺失区域中间约500 bp的范围内放大，该区域应包含>3个SNP。
    3. 在选项栏中选择“view>DNA”，然后点击“get DNA”以下载全大写格式的目标序列。
    4. 创建两个FASTA序列：分别对应129和Cast，通过在SNP位置进行碱基替换获得。使用小写字母标记SNP位点。
    5. 访问Primer3 Plus（http://www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi/），粘贴经过SNP替换的129序列，并使用默认设置设计引物。
    6. 为设计内侧等位基因特异性引物，在任务下拉菜单中选择“Primer_List”，然后点击“Pick Primers”。选择一个正向或反向引物，其3'端或距3'端4个碱基内含有一个SNP，并且位于待删除区域内。
      注意：在qPCR中，3'端含有SNP的引物表现出更高的等位基因特异性。
    7. 为选择第二个引物，返回主页面，在任务下拉菜单中选择“Detection”，并将第一个引物序列粘贴到页面底部相应的输入框中。在“General Settings”选项卡中，将产物大小范围设置为80–200 bp，然后点击“Pick Primers”。从列出的引物对中选择一组，这将作为129内侧等位基因特异性引物。
    8. 重复步骤5.1.5至5.1.7，为Cast等位基因设计引物。
    9. 返回UCSC基因组浏览器，输入待删除区域的坐标。在选项栏中选择“view>DNA”，在“Sequence Retrieval Region Options”中添加上下游各1,000 bp，然后点击“get DNA”以下载目标序列。
    10. 用括号标记gRNA靶序列。在继续操作前保存整个序列。
    11. 为设计外侧引物，移除两个gRNA靶序列之间的序列。重复步骤5.1.4至5.1.8以设计外侧等位基因特异性引物，但将产物大小范围改为400–800 bp。
    12. 将步骤5.1.10中获得的序列分为两个序列，每个序列分别包含gRNA靶序列5'和3'端各500 bp。重复步骤5.1.5至5.1.7，设计非等位基因特异性的gRNA侧翼引物，但将产物大小范围设为400–800 bp。
      注意：对于非等位基因特异性引物，可使用129或Cast序列，应选择不包含SNP的引物。建议将外侧引物和gRNA侧翼引物的产物大小设为400–800 bp，以便即使存在小的插入或缺失（indel）也能实现扩增。
  2. 使用纯化的129和Cast品系基因组DNA（浓度为2 ng/µl）通过qPCR检测内侧引物的等位基因特异性。按照步骤6.2–6.4设置qPCR反应。
    注意：如果目标区域的129基因型与C57BL/6J相同，可用C57BL/6J DNA替代129 DNA。等位基因特异性引物在正确与错误基因型之间的Ct值（循环阈值）应至少相差5个循环。可分别使用Cas9/gRNA转染的ES细胞和F1代基因组DNA作为阳性和阴性对照，验证外侧引物是否能扩增出缺失片段。外侧引物的等位基因特异性可在鉴定出单等位基因克隆后进一步测试。

6. 扩增子基因分型

  1. 使用第4.6步菌落扩增后获得的96孔板，从中提取基因分型用的基因组DNA。
    1. 配制基因组DNA提取混合液：89 µl 水、10 µl 10x缓冲液和1 µl 提取试剂（由生产商提供）。向每孔加入100 µl 基因组DNA提取混合液，并用封板膜密封。
    2. 将培养板在75 °C孵育5分钟，随后在95 °C孵育5分钟。
    3. 将培养板置于冰上孵育数分钟以冷却，随后短暂离心，使冷凝液沉降至孔底。此即作为缺失筛选的模板DNA板。
  2. 为每个克隆设置两个重复的qPCR反应，具体如下：加入5 µl的2x SYBR qPCR混合液，上下游引物（3 µM）各1 µl，以及1 µl水。使用多通道移液器向384孔板的每孔中先加入2 µl模板DNA，再加入8 µl反应混合液。
  3. 用封板膜密封反应板，600 × g 离心 2 分钟以混匀内容物。将 384 孔板放入实时荧光定量 PCR 仪中。
  4. 将实时循环仪程序设置为两步法PCR，随后进行熔解曲线分析，检测条件如下：95 °C 预变性10 min，1个循环；95 °C 变性15 s、62 °C 退火延伸30 s并读板，40个循环；95 °C 10 s，然后从65 °C 升至95 °C，每5 °C 增幅保持5 s并读板。
    注意：除了引物设计之外，qPCR 反应体系和扩增循环参数也会影响引物的特异性。上述参数及材料列表中所列试剂更常能够获得等位基因特异性扩增。
  5. 分析qPCR结果
    1. 使用内侧等位基因特异性引物检测每个等位基因的扩增情况。若其中一个等位基因无扩增，或Ct值差异较大（>5个循环）之间的等位基因差异表明，这些克隆携带一个Ct值较高或无Ct值的等位基因的杂合缺失。若两个等位基因均无扩增，则表明它们携带纯合缺失。
    2. 使用外侧等位基因特异性引物检测每个等位基因的扩增情况。当目标缺失大于1 kb时，仅在缺失存在的情况下才能使用外侧引物扩增出产物，Ct值为22–28可确认缺失。对于小于1 kb的目标缺失，需通过电泳确认扩增产物的大小。
      注意：如果外侧引物仅表现出中等程度的等位基因特异性（参见 图2)，由于外侧引物的脱靶扩增，单等位基因克隆中可能使用两套等位基因特异性引物均获得扩增子。此时，若两个等位基因之间的Ct值差异至少为五个循环，则可根据内侧引物的检测结果确认Ct值较低的等位基因（即正确靶向的等位基因）已被删除。如果靶向与脱靶等位基因之间的Ct值差异小于五个循环，应重新设计新的等位基因特异性外侧引物。
    3. 在单等位基因缺失克隆中，使用二次筛选的gRNA侧翼引物检测未缺失等位基因的完整性。
      注意：插入缺失突变（Indels）的 >在qPCR中，通过观察400-800 bp扩增子的熔解曲线变化，可识别gRNA靶位点周围约25 bp范围内的序列差异。或者，可通过测序gRNA侧翼引物扩增的产物，以检测小片段插入或缺失（indels） <25 bp
      1. 使用两组gRNA侧翼引物进行qPCR 即，用于生成CRISPR缺失的5'和3' gRNA。若使用这些引物组合未出现扩增产物，表明在单等位基因缺失克隆的非缺失等位基因gRNA靶位点处存在大于qPCR扩增片段的插入缺失（indel）。请弃除含有此类大片段插入缺失的克隆，以免因无法明确缺失范围而导致结果难以解读。
  6. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书纯化由外侧引物qPCR反应获得的扩增子。
  7. 通过DNA测序对上一步纯化的PCR产物进行测序，以确认缺失等位基因的序列。使用qPCR扩增引物进行正向和反向测序。
    注意：在此阶段，扩增子内的SNP可作为缺失等位基因基因型的二次确认依据。

7. 使用等位基因特异性引物分析表达

  1. 将存放于 -80 °C 的 96 孔细胞冻存板（步骤 4.9 中的 stock-1）置于温热的金属珠浴中解冻。当板中超过一半的孔已解冻时，在 300 × g 条件下离心 5 分钟。
  2. 小心移除封板膜，并迅速将阳性缺失孔中的细胞转移至含 1 ml ES 细胞培养基（表 1）的明胶包被 12 孔板中，于 37 °C、5% CO2 条件下培养。
  3. 当细胞融合度达到 70–85% 时，传代细胞并将其分种至明胶包被的 6 孔板中的三个孔，每孔加入 2 ml ES 细胞培养基（表 1）。使用其中两个孔制备两管冻存细胞，用于长期保存于液氮中（见步骤 8），第三个孔用于 RNA 提取。
  4. 使用 RNA 提取试剂盒提取 RNA。
  5. 取 100–500 ng RNA，按照 cDNA 合成试剂盒的说明书进行逆转录（RT）反应，将其转化为 cDNA。每个 RNA 样本均需设置一个无逆转录酶的阴性对照反应，以检测 RNA 样本中可能存在的基因组 DNA 污染。
  6. 根据目标基因在 ES 细胞中的表达水平，将 cDNA 在 qPCR 前按 1:2 至 1:4 的比例稀释。
  7. 按照前述方法设置 qPCR 反应，包含 F1 基因组 DNA 作为标准曲线（从 250 至 0.08 ng/µl 的 5 倍梯度稀释），用于转录本水平的绝对定量。将每个经确认的缺失克隆中目的基因各等位基因的表达水平与合适的对照基因（例如 Gapdh，引物列于 表 7）进行比较。
    注意：对照基因引物无需具有等位基因特异性。等位基因特异性引物的设计原则与基因分型引物相同，唯一区别在于扩增的目标区域应基于基因序列；若使用针对单个外显子或外显子-内含子边界的引物（用于检测初级转录本），则可使用 F1 基因组 DNA 构建标准曲线。有关 RT-qPCR 的更多细节，请参见 Forlenza et al. 201233。

8. 胚胎干细胞长期保存用冻存菌种的制备

  1. 向每个6孔板（来自步骤7.3）中加入300 µl胰蛋白酶，于37 °C孵育5分钟。加入2 ml离心培养基（表2）以中和胰蛋白酶，并反复吹打数次，使细胞解离为单细胞悬液。
  2. 将细胞转移至15 ml离心管中，在300 × g下离心5分钟。
  3. 吸除上清液，加入500 µl ES细胞培养基（表1），通过吹打重悬细胞。
  4. 将细胞悬液转移至1.5 ml冻存管中，加入500 µl 2倍浓缩的ES细胞冻存培养基（表3）。通过轻柔颠倒混匀，将冻存管放入无酒精细胞冻存盒中。将冻存盒置于-80 °C冰箱中至少12小时，之后转移至液氮储存罐中保存。

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结果

本方案使用F1 ES细胞进行研究 cis-利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术生成的单等位基因增强子缺失细胞中基因表达的调控图1）。基因分型和基因表达分析中的gRNA及等位基因特异性引物设计是该方法的关键因素。每对等位基因特异性引物均需通过qPCR验证其等位基因特异性。理想情况下，等位基因特异性引物应仅扩增其对应的基因组DNA靶标（图2）。理想情况下，这些引物在其3'端应包含一个SNP。若引物对等位基因的特异性较低，则需确保其在扩增正确基因型与错误基因型时的Ct值差异至少达到5个循环。25. 引物的SNP位点位于更偏5'端的位置th 从3'端起始的引物通常无法表现出等位基因特异性，会以相同的效率扩增两种基因型，这凸显了SNP在引物中位置的重要性34此外，研究表明，嘌呤/嘌呤或嘧啶/嘧啶替换对结果具有更大的影响 Tm 两种引物之间的差异相较于嘌呤/嘧啶替换

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讨论

CRISPR/Cas9 介导的基因组编辑技术为基因组修饰提供了一种简便、快速且经济的方法。本文详述的方法利用 F1 小鼠细胞中的 SNP 来生成并分析单等位基因增强子缺失，以实现对功能增强子的表征。该方法的优势包括：1）单等位基因增强子缺失不会导致关键增强子在两个等位基因上同时缺失所引发的混杂效应，i.e.，靶基因蛋白表达水平大幅降低，进而引起细胞致死或表型改变；2）若单等位基因缺失频率较低，则获得纯合缺失的可能性较小；然而，通过在基因表达分析中使用等位基因特异性引物，仍可对携带单等位基因缺失的克隆进行分析；3）使用四对引物筛选单等位基因缺失，可排除含有部分缺失或大片段缺失的克隆，避免对后续分析造成干扰。

等位基因特异性引物设计对于基因分型单等位或双等位CRISPR缺失以及以等位基因特异性方式分析其对基因表达的影响至关重要。当所使用的F1细胞含有更频繁的SNP时，这种区分两个等位基因的操作更容易实现。本文使用由Mus musculus129与Mus castaneus杂交产生的胚胎干细胞（ES细胞）；然而，...

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披露

作者已阅读 JoVE 关于利益冲突的政策，且无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Mitchell实验室所有成员的有益讨论。本工作得到了加拿大卫生研究院、加拿大创新基金会以及安大略省研究与创新部的支持（JAM持有的运营和基础设施资助）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Phusion高保真DNA聚合酶NEBM0530S用于gRNA组装的高保真DNA聚合酶
Gibson Assembly Master MixNEBE2611L
gRNA_克隆载体Addgene41824将目标序列克隆到该载体中以构建gRNA质粒
pCas9_GFPAddgene44719密码子优化的 SpCas9 与 EGFP 共表达质粒
AflIINEBR0520S
EcoRINEBR3101S
Neon 转染系统 100 µL 型试剂盒Life TechnologiesMPK10096微孔电穿孔转染技术
prepGEMZyGEMPT10500基因组DNA提取试剂
Nucleo Spin Gel &和 PCR 产物纯化Macherey-Nagel740609.5
高速质粒小提试剂盒GeneaidPD300
内毒素去除型大提质粒试剂盒 GeneaidPME25
SYBR select mix for CFXLife Technologies4472942qPCR 试剂
iScript cDNA合成试剂盒伯乐（Bio-rad）170-8891逆转录试剂
含EDTA的0.25%胰蛋白酶Life Technologies25200072
不含 Ca/Mg 的 PBS2+SigmaD8537
0.5 M EDTABioshopEDT111.500
HBSSLife Technologies14175095
1 M HEPESLife Technologies13630080
BSA 第 V 组分（7.5%）Life Technologies15260037
Max Efficiency DH5α 感受态细胞Invitrogen18258012
FBSES细胞鉴定合格FBS需在小鼠ES细胞中进行多能性预测试
DMSOSigmaD2650
GlutamaxInvitrogen35050
DMEMLife Technologies11960069
青霉素/链霉素Invitrogen15140
丙酮酸钠Invitrogen11360
非必需氨基酸Invitrogen11140
β-巯基乙醇SigmaM7522
96孔板Sarstedt83.3924
封口胶带Sarstedt95.1994
CoolCell LXBiocisionBCS-405无酒精细胞冻存容器
CHIR99021Biovision1748-5F1 ES细胞培养抑制剂
PD0325901Invivogeninh-pd32F1 ES细胞培养抑制剂
LIFChemiconESG1107F1 ES细胞培养抑制剂

参考文献

  1. Sagai, T., Hosoya, M., Mizushina, Y., Tamura, M., Shiroishi, T. Elimination of a long-range cis-regulatory module causes complete loss of limb-specific Shh expression and truncation of the mouse limb. Development. 132 (4), 797-803 (2005).
  2. Kleinjan, D. A., Lettice, L. A. Long-range gene control and genetic disease. Adv Genet. 61, 339-388 (2008).
  3. Visel, A., Rubin, E. M., Pennacchio, L. A. Genomic views of distant-acting enhancers. Nature. 461 (7261), 199-205 (2009).
  4. Maurano, M. T., et al. Systematic localization of common disease-associated variation in regulatory DNA. Science. 337 (6099), 1190-1195 (2012).
  5. Heintzman, N. D., et al. Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression. Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).
  6. Shen, Y., et al. A map of the cis-regulatory sequences in the mouse genome. Nature. 488 (7409), 116-120 (2012).
  7. Johnson, D. S., Mortazavi, A., Myers, R. M., Wold, B. Genome-wide mapping of in vivo protein-DNA interactions. Science. 316 (5830), 1497-1502 (2007).
  8. Rhee, H. S., Pugh, B. F. Comprehensive genome-wide protein-DNA interactions detected at single-nucleotide resolution. Cell. 147 (6), 1408-1419 (2011).
  9. Whyte, W. A., et al. Master transcription factors and mediator establish super-enhancers at key cell identity genes. Cell. 153 (2), 307-319 (2013).
  10. Chen, C. Y., Morris, Q., Mitchell, J. A. Enhancer identification in mouse embryonic stem cells using integrative modeling of chromatin and genomic features. BMC Genomics. 13 (1), 152(2012).
  11. Patwardhan, R. P., et al. Massively parallel functional dissection of mammalian enhancers in vivo. Nat Biotechnol. 30 (3), 265-270 (2012).
  12. Melnikov, A., et al. Systematic dissection and optimization of inducible enhancers in human cells using a massively parallel reporter assay. Nat Biotechnol. 30 (3), 271-277 (2012).
  13. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  14. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  15. Mali, P., et al. RNA-guided human genome engineering via Cas9. Science. 339 (6121), 823-826 (2013).
  16. Hsu, P. D., et al. DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases. Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).
  17. Cho, S. W., et al. Analysis of off-target effects of CRISPR/Cas-derived RNA-guided endonucleases and nickases. Genome Res. 24 (1), 132-141 (2014).
  18. Zhou, H. Y., et al. A Sox2 distal enhancer cluster regulates embryonic stem cell differentiation potential. Genes Dev. 28 (24), 2699-2711 (2014).
  19. Fujii, W., Kawasaki, K., Sugiura, K., Naito, K. Efficient generation of large-scale genome-modified mice using gRNA and CAS9 endonuclease. Nucleic Acids Res. 41 (20), e187(2013).
  20. Tuan, D. Y., Solomon, W. B., London, I. M., Lee, D. P. An erythroid-specific, developmental-stage-independent enhancer far upstream of the human 'beta-like globin' genes. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (8), 2554-2558 (1989).
  21. Amano, T., et al. Chromosomal dynamics at the Shh locus: limb bud-specific differential regulation of competence and active transcription. Dev Cell. 16 (1), 47-57 (2009).
  22. Li, Y., et al. CRISPR reveals a distal super-enhancer required for Sox2 expression in mouse embryonic stem cells. PLoS One. 9 (12), e114485(2014).
  23. Canver, M. C., et al. Characterization of genomic deletion efficiency mediated by clustered regularly interspaced palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 nuclease system in mammalian cells. J Biol Chem. 289 (31), 21312-21324 (2014).
  24. Mlynarczyk-Evans, S., et al. X chromosomes alternate between two states prior to random X-inactivation. PLoS Biol. 4 (6), e159(2006).
  25. Lefever, S., Pattyn, F., Hellemans, J., Vandesompele, J. Single-nucleotide polymorphisms and other mismatches reduce performance of quantitative PCR assays. Clin Chem. 59 (10), 1470-1480 (2013).
  26. Huang, M. M., Arnheim, N., Goodman, M. F. Extension of base mispairs by Taq DNA polymerase: implications for single nucleotide discrimination in PCR. Nucleic Acids Res. 20 (17), 4567-4573 (1992).
  27. Keane, T. M., et al. Mouse genomic variation and its effect on phenotypes and gene regulation. Nature. 477 (7364), 289-294 (2011).
  28. Yalcin, B., et al. Sequence-based characterization of structural variation in the mouse genome. Nature. 477 (7364), 326-329 (2011).
  29. Gibson, D. G., et al. Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases. Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).
  30. Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nat Methods. 7 (11), 901-903 (2010).
  31. Ding, Q., et al. Enhanced efficiency of human pluripotent stem cell genome editing through replacing TALENs with CRISPRs. Cell Stem Cell. 12 (4), 393-394 (2013).
  32. Basu, S., Campbell, H. M., Dittel, B. N., Ray, A. Purification of specific cell population by fluorescence activated cell sorting (FACS). J Vis Exp. (41), (2010).
  33. Forlenza, M., Kaiser, T., Savelkoul, H. F., Wiegertjes, G. F. The use of real-time quantitative PCR for the analysis of cytokine mRNA levels. Methods Mol Biol. 820, 7-23 (2012).
  34. Wu, J. H., Hong, P. Y., Liu, W. T. Quantitative effects of position and type of single mismatch on single base primer extension. J Microbiol Methods. 77 (3), 267-275 (2009).
  35. Sanyal, A., Lajoie, B. R., Jain, G., Dekker, J. The long-range interaction landscape of gene promoters. Nature. 489 (7414), 109-113 (2012).

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CRISPR Cas9 RNA DNA qPCR
利用CRISPR/Cas9介导的单等位基因缺失研究小鼠胚胎干细胞中增强子功能
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