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方法文章

成年小鼠耳蜗的全组织解剖与免疫荧光染色

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DOI：

10.3791/53561

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2016年1月1日

 , 
1Department of Surgery, Division of Otolaryngology, Southern Illinois University, School of Medicine, 2Department of Pharmacology, Southern Illinois University, School of Medicine

本文内容

摘要

我们介绍了一种分离成年耳蜗柯蒂器官的方法，可获得完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作步骤。结合这些技术，可对耳蜗中的毛细胞、支持细胞及其他细胞类型进行研究。

摘要

耳蜗内的柯蒂氏器包含机械感觉毛细胞及其周围的支持细胞，这些细胞呈螺旋状排列，并具有声音检测的音调定位梯度。小鼠耳蜗长约6毫米，通常分为三个转（顶转、中转和底转）进行分析。为了研究细胞丢失、细胞分裂或嵌合基因表达，耳蜗的整体封片或表面制备方法非常有用。该解剖方法结合免疫染色和共聚焦显微镜成像，可观察柯蒂氏器中z轴不同平面上的所有细胞。此外，还可从这些z轴堆叠图像中获得多个光学横截面。同时，整体封片解剖法也可用于扫描电子显微镜观察，但需要采用不同的固定方法。本文介绍一种将柯蒂氏器分离为三个完整耳蜗转（顶转、中转和底转）的方法。该方法适用于从出生一周至成年的小鼠，与新生小鼠样本所用技术不同，因后者耳蜗尚未完全钙化。稍作修改后，该方法也可用于大鼠耳蜗的解剖。我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作流程。

引言

内耳中位于颞骨内的耳蜗呈螺旋形，其内部包含柯蒂氏器，这是哺乳动物的听觉感觉终器。耳蜗具有音调拓扑结构，通常分为顶回、中回和底回，分别对应不同的频率区域，其中高频声音的感知位于底部，低频感知位于顶部1。作为柯蒂氏器的机械感受细胞，毛细胞沿耳蜗全长分布，在小鼠中耳蜗长度约为6 mm2,3。这些细胞将通过充满液体的膜迷路传导的声波机械能转化为神经信号，并由中枢听觉结构进行处理。本文所述技术提供了一种在耳蜗骨化完成后制备柯蒂氏器整体装片的方法（适用于从出生后一周至成年阶段的样本）。我们还介绍了一种对整体装片耳蜗组织进行免疫染色的方法。耳蜗整体装片对于在天然空间排列中可视化所有毛细胞及其周围的支持细胞至关重要，并可借助共聚焦显微镜实现三维分析。

Hans Engstrom 博士和 Harlow Ades 博士于 1966 年首次描述了一种耳蜗整体铺片解剖方法。他们详细介绍了一种技术，可快速固定并解剖浸没在液体中的多种哺乳动物钙化耳蜗，以保留柯蒂氏器的短段完整结构，用于显微分析4。未固定的钙化大鼠耳蜗的解剖方法也已在教学视频中展示5。华盛顿大学的 Barbara Bohne 博士和 Gary Harding 博士对该方法进行了多项重要改进。在其耳蜗整体铺片法版本中，颞骨经脱钙处理后包埋于塑料介质中，并解剖出五个半圈或十个四分之一圈的结构6,7。马萨诸塞州眼耳医院伊顿皮博迪实验室的 Charles Liberman 博士及其同事进一步改进了该技术，使其无需塑料包埋步骤8。此后，圣犹大儿童研究医院 Jian Zuo 博士实验室对该技术进行了进一步优化9-12，这些改进为本文所介绍的解剖方法提供了依据。我们采用了一种不同于 Bohne 和 Liberman 的策略来暴露柯蒂氏器，从而能够分离出完整的顶回、中回和底回。因此，所获得的解剖组织更大，且在解剖或免疫染色过程中更不易丢失或受损。此外，当前方法便于测量从顶端尖端或底端钩部的距离，以确定特定频率区域。

尽管许多实验室都进行耳蜗组织的免疫染色，但该方法的起源尚不明确。因此，不同实验室在封闭缓冲液和抗体孵育缓冲液的配方上存在多种方案，这可能会影响各种一抗的染色效果。本文介绍一种适用于听觉研究领域中大多数常用抗体的荧光标记抗体免疫染色方法。

耳蜗的复杂形态、柯蒂氏器的精细结构以及骨性包被为组织学和生物化学分析带来了挑战。目前听觉研究领域采用多种技术来克服这些困难，以观察柯蒂氏器内的细胞，每种技术各有其优缺点。本文所述方案可实现成年小鼠耳蜗的全耳蜗铺片解剖，稍加修改后，还可能用于检查该研究领域中其他多种模式生物耳蜗内的关键结构。

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方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得南伊利诺伊大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 颞骨的提取

  1. 在小鼠颅底识别颞骨13，并使用标准纹状镊子刮除颅 神经。
  2. 将标准纹状镊子置于耳囊的尖端，用另一只手的拇指按压后半规管，以松动包裹的耳蜗。
  3. 用拇指和食指手动或使用10.5 cm精细剪刀将颞骨下半部分从颅骨上分离。

2. 固定后颞骨

  1. 将颞骨放入含有250–500 µl 4%多聚甲醛（PFA）的2 ml微量离心管中，PFA用pH 7.4的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，室温孵育2–20小时。
    注意：无需打开顶盖或向圆窗或卵圆窗注射PFA。 建议使用无甲醇、超纯、电子显微镜（EM）级的PFA，该试剂可购得16%浓度的玻璃安瓿装产品。将安瓿中的PFA用PBS按1:4稀释成4%溶液后，若储存于4 oC，可在2周内使用 （某些抗体需要短时间固定，而另一些则可耐受过夜（O/N）固定）  。

3. 脱钙颞骨

  1. 固定后，用移液器吸除PFA，并加入略多于2 ml的120 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。确保完全充满2 ml微量离心管，以防止关闭管盖时产生气泡。
    1. 若不立即进行脱钙，可将PFA替换为10 mM PBS（pH 7.4），并将样本在4 oC下保存。
      注意：固定后，根据所检测抗原的不同，颞骨可在脱钙前保存不同时间。
  2. 将离心管置于翻转摇床（end-over-end rotator）上，在室温下以4 rpm速度旋转。每天使用移液器更换EDTA溶液。脱钙所需时间取决于样本年龄及操作者偏好。
    1. 根据以下孵育时间建议，在EDTA中孵育颞骨：
      出生后第（P）8至P15天样本：2–4小时；P15至P21天样本：过夜（O/N）；P21至P30天样本：2个过夜（2 O/N）；大于P30天的样本：3个或更长时间的过夜（3或更多O/N）。
      注意：脱钙时间可根据使用者偏好调整，必要时可延长。通过每天更换两次EDTA溶液（间隔约8小时），可缩短脱钙时间。若脱钙时间超过3天，部分实验室会在EDTA溶液中添加1% PFA以防止污染。
  3. 为判断样本是否已充分脱钙，将颞骨置于涂有硅弹性体的解剖皿上，用镊子轻轻按压蜗牛状的耳蜗。若组织呈海绵状，则表明脱钙已完成。
  4. 脱钙完成后，用移液器吸除EDTA，并加入500–1,000 µl的10 mM PBS（pH 7.4）。将样本在4 oC下保存，直至准备进行解剖。

4. 制备硅酮弹性体包被的解剖皿

  1. 根据制造商的说明，将硅胶弹性体封装剂套件的固化剂和基础剂混合，并充分搅拌。
  2. 加入约2至3汤匙的粉末状活性炭，直至溶液变为黑色，并充分混合。 
    注意：液体墨水或液体活性炭无法与溶液混合，不可使用。 可购买黑色的硅胶弹性体封装剂套件，从而省略步骤4.2。
  3. 将溶液倒入60 mm的玻璃或塑料培养皿中，用量足以覆盖底部即可。若存在气泡，可用空气轻轻吹拂表面。在室温下静置至少24小时以固化。
    注意：硅胶弹性体涂层的培养皿可重复使用多年。但请勿使用乙醇进行清洗，否则会导致硅胶弹性体开裂。

5. 耳蜗整体解剖（适用于P7及更年长样本）

  1. 分离耳蜗底回与中回/顶回
    1. 将一个脱钙的颞骨置于盛有三分之二体积、pH 7.4 的 10 mM PBS 的硅胶弹性体包被解剖皿中，并在以下步骤中使用体视解剖显微镜。
    2. 用 #4 或 #5 直头珠宝镊夹住颞骨的前庭区域，使用 5 mm Vannas-Tubingen 弹簧剪刀，沿顶回两侧及上方剪除多余的耳囊组织。
    3. 使用 2.5 mm Vannas 弹簧剪刀，将其中一刃插入卵圆窗，并沿底回的螺旋韧带/侧壁进行数次小切口。
    4. 使用 5 mm Vannas-Tubingen 弹簧剪刀，将其中一刃插入刚刚切割的区域，另一刃置于颞骨外侧、卵圆窗内侧。此切口可将底回与中回和顶回分离。
  2. 完成底回的解剖。
    1. 使用 2.5 mm Vannas 弹簧剪刀，剪断连接至蜗轴的螺旋神经节纤维，以释放底回的张力，并在底回下方进行切割，使其与前庭器官分离。
    2. 使用 2.5 mm Vannas 弹簧剪刀，在柯蒂器上方和下方进行一系列小切口，以去除螺旋韧带/侧壁组织。使用 #4 或 #5 直头珠宝镊引导组织。将螺旋神经节纤维固定在硅胶弹性体包被的解剖皿上，但不要抓握该区域，以免组织撕裂。
    3. 在前述步骤中，部分前庭膜通常已被去除。若仍有残留，使用 #4 或 #5 直头珠宝镊夹住前庭膜，并将其从柯蒂器上轻轻拉离。
      注：盖膜通常不可见，一般会自行漂离，无需专门步骤去除。
    4. 最后进行数次切割，以减薄螺旋神经节轴突的厚度，使耳蜗回尽可能平坦；使用 #4 或 #5 直头珠宝镊夹住残留的螺旋神经节轴突，将解剖完成的底回转移至含有约 500 µl、pH 7.4 的 10 mM PBS 的 48 孔板（或腔室载玻片）中。
  3. 分离中回与顶回
    1. 将剩余的耳蜗三分之二部分，顶回朝下放置。
    2. 使用 2.5 mm Vannas 弹簧剪刀，将其中一刃插入中回原先连接底回处的中阶位置，并沿中回的螺旋韧带/侧壁进行数次小切口。
    3. 使用 5 mm Vannas-Tubingen 弹簧剪刀，将其中一刃插入刚刚切割的区域，使中回位于刀刃上方，另一刃置于骨迷路外侧，与顶回尖端呈 90o 角。此操作可将中回与顶回分离。
  4. 以与底回类似的方式完成中回的解剖（参见步骤 5.2.2 至 5.2.4）。
  5. 完成顶回的解剖。
    1. 使用 2.5 mm Vannas 弹簧剪刀，打开覆盖顶回的帽状结构。以与底回类似的方式完成解剖（参见步骤 5.2.2 至 5.2.4）。
      注：解剖后的耳蜗回可在含有 pH 7.4 的 10 mM PBS 的 48 孔板（或腔室载玻片）中于 4 oC 保存数周后再进行免疫染色。但 PBS 会蒸发，需定期补充；保存超过 2–3 周可能导致组织上出现细菌或真菌生长，从而降低成像质量。建议将样本以未解剖的颞骨形式进行长期保存。

6. 使用荧光标记抗体进行免疫染色

  1. 解剖完成后，将每个耳蜗转分别置于48孔板（或腔室载玻片）的不同孔中， 浸入约500 µl的10 mM PBS（pH 7.4）中。在后续每一步操作中，耳蜗转均应完全浸没于液体中，不得漂浮于液面或粘附在孔壁上。 
    注意：在移除各孔中液体时，容易丢失耳蜗转或将组织吸入移液枪头中。使用200 µl移液枪头并在解剖显微镜下更换溶液，有助于避免此类情况发生。
  2. 使用移液器移除各孔中的PBS，每孔加入约200–300 µl封闭/通透化溶液（含1% Triton X-100、1%牛血清白蛋白（BSA）和10%正常山羊血清（NGS），溶于10 mM PBS pH 7.4中）。在3D旋转仪上室温孵育1小时。
    注意：若所使用的任一主抗体为山羊来源，则需使用抗山羊二抗，此时在任何步骤中均不应使用NGS。可用正常马血清替代NGS。
  3. 用移液器移除封闭/通透化溶液，每孔加入约100 µl主抗体溶液（含0.1% Triton X-100、1% BSA和5% NGS，溶于10 mM PBS pH 7.4中）。各主抗体的稀释比例有所不同。在4 oC条件下于3D旋转仪上孵育过夜（至少14小时）。
    注意：若使用多个主抗体，可将它们混合于同一溶液中进行孵育，但需确保各主抗体来源于不同宿主。
  4. 用移液器移除主抗体溶液，使用10 mM PBS（pH 7.4）进行3次洗涤，每孔约500 µl。每次洗涤在3D旋转仪上室温孵育至少5分钟。
  5. 用移液器移除最后一次PBS洗涤液，每孔加入约100 µl二抗溶液（含0.1% Triton X-100、1% BSA和5% NGS，溶于10 mM PBS pH 7.4中）。每种荧光标记二抗的稀释比例通常为1:500或1:1,000。将48孔板放入黑色盒子中以避免荧光标记二抗暴露于光照。在3D旋转仪上室温孵育2–3小时。
    注意：若需使用多个二抗，可将它们混合于同一溶液中进行孵育，但需确保无交叉标记的可能性（例如，避免同时使用山羊抗兔和鸡抗山羊二抗）。
  6. 用移液器移除二抗溶液，使用10 mM PBS（pH 7.4）进行3次洗涤，每孔约500 µl。每次洗涤在3D旋转仪上室温孵育至少5分钟。将48孔板保持在黑色盒子中以避光。
  7. 用移液器移除最后一次PBS洗涤液，每孔加入约100 µl Hoechst 33342溶液（以10 mM PBS pH 7.4按1:2,000稀释）以标记细胞核。在3D旋转仪上室温孵育15–20分钟。将48孔板置于黑色盒子中避光。孵育时间不得超过20分钟。
  8. 用移液器移除Hoechst溶液，使用10 mM PBS（pH 7.4）进行3次洗涤，每孔约500 µl。每次洗涤在3D旋转仪上室温孵育至少5分钟。将48孔板保持在黑色盒子中避光。
  9. 除Hoechst孵育时间外，所有步骤均可根据需要延长数小时。若需在任意阶段暂停实验，只需将样品浸入约500 µl的10 mM PBS（pH 7.4）中，并将48孔板（或腔室载玻片）置于4 oC保存，待数小时或1–2天后继续实验流程。
     

7. 将耳蜗卷曲部分固定在载玻片上

  1. 在载玻片上标注样本及所用抗体的相关信息。
  2. 用移液器吸取约 50 µl 封片剂滴加至每张载玻片上，注意避免产生气泡。将含有封片剂的离心管进行离心，以去除 任何气泡。
  3. 使用 #4 或 #5 直头钟表镊，夹住螺旋神经节的轴突，轻柔地将一个耳蜗转从 48 孔板转移至载玻片，并置于封片剂中。每张载玻片仅放置一个耳蜗转，以防止成像过程中光照导致的光漂白。
  4. 使用体视解剖显微镜检查，确保耳蜗转未发生折叠、扭曲或靠近气泡。 若出现上述任一情况，应使用 #4 或 #5 直头钟表镊重新调整耳蜗转的位置。
  5. 将盖玻片一端先接触载玻片，然后缓慢松开，使盖玻片自然下落。
  6. 使用体视解剖显微镜检查，确保耳蜗转未发生折叠、扭曲或靠近气泡。若出现上述任一情况，可轻缓地前后移动盖玻片以重新定位耳蜗转。
  7. 将载玻片放入玻片夹中，使其平放。在室温下避光静置过夜（O/N），使封片剂充分固化。
  8. 用透明指甲油密封盖玻片，随后在室温或 -20 oC 下保存直至成像。载玻片可存放于玻片夹或玻片盒中。
    注意： 载玻片可长期保存于 -20 oC 或 -80 oC，荧光信号可维持数月。
  9. 根据免疫染色过程中使用的二抗所对应的激发波长，使用共聚焦显微镜对载玻片进行成像。可利用共聚焦显微镜厂商提供的成像软件对亮度和对比度进行调整。

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结果

我们介绍一种从发生钙化的耳蜗组织中分离出完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）的耳蜗柯蒂氏器的方法，关键解剖步骤见图1。在出生后第一周的发育阶段，小鼠耳蜗的钙化尚不完全，此时可采用较为简单的解剖方法13。若将新生小鼠整体封片解剖法用于P7及更年长小鼠的耳蜗组织，会导致柯蒂氏器撕裂和破碎。此时螺旋韧带/侧壁已更牢固地附着，无法在不造成损伤的情况下从感觉上皮剥离。因此，对于P6以后的样本，必须采用“成年”整体封片解剖法。本文展示了P15小鼠耳蜗中回的一个示例，该样本经解剖后使用毛细胞和支持细胞标记物进行免疫染色（图2）。利用整体封片技术还可获得光学横截面图像（图3）。

在整体耳蜗铺片解剖或在载玻片上安装耳蜗螺旋结构的过程中，可能会出现多种问题。在去除螺旋韧带/侧壁时，切除过多或不足之间存在一个狭窄的操作窗口。若切口位置靠近最外一列毛细胞...

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讨论

要成功进行整体封片解剖和免疫染色，有几个关键步骤。但在进行这两种方法之前，必须对耳蜗组织进行适当的固定。我们建议使用无甲醇、超纯、电镜级的多聚甲醛（PFA）。由粉末配制的PFA可能残留微量甲醇，并存在pH不稳定的问题，这会降低免疫荧光的质量。其他研究团队也已证明，使用不含甲醛的固定剂同样可以完成类似的解剖14-16。固定时间同样重要，且因抗体而异。某些抗体可耐受过夜（O/N）固定，而另一些抗体则在仅使用1小时PFA固定时效果不佳（不过这种情况较为罕见）。固定不足的组织在解剖过程中容易出现结构解体，给操作带来困难。 根据我们的经验，3至4小时的固定时间足以实现充分固定，且不会干扰听觉研究领域中常用的大多数一抗的染色效果。 

EDTA 也可能干扰一抗；因此某些抗体在新生组织中效果良好，但在经过脱钙处理的 P7 或更年长动物的组织中则可能无效。固定后，颞骨在脱钙前可储存的时间长短不一，具体取决于所检测的抗原。某些抗原要求在固定后的数天至数周内完成脱钙和解剖，而另一些抗原则可在脱钙前或脱钙后储存数年，且不会降低免疫染色的质量。我们建议将样本以颞骨形...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究部分得到了美国海军研究办公室（N000141310569）资助项目的支持。南伊利诺伊大学医学院研究影像设施的设备由美国国家研究资源中心-卫生（S10RR027716）资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
标准 模式镊子Fine Science Tools11000-12可从其他供应商处购买
10.5 cm 精细剪刀Fine Science Tools14060-11可从其他供应商处购买
2 ml 微量离心管MidSciAVSS2000可从其他供应商处购买
16% 甲醛，无甲醇，超纯，电子显微镜级Polysciences18814有毒——需佩戴手套，不可倒入水槽处理。可从其他供应商处购买。 
PBS pH 7.4 SigmaP3813-10PAK可从其他供应商处购买
EDTAFisherBP118-500可从其他供应商处购买
滚轴混合仪（端对端旋转）Fisher05-450-127可从其他供应商处购买
60 mm 培养皿Fisher50-202-037可从其他供应商处购买
Dow Corning Sylgard 184 硅胶封装试剂盒Ellsworth Adhesives184 SIL ELAST KIT 0.5KG
活性炭FisherAC134372500可从其他供应商处购买
体视解剖显微镜ZeissStemi 2000可从其他供应商处购买
Dumont #4 珠宝匠镊子Fine Science Tools11241-30
Dumont #5 珠宝匠镊子Fine Science Tools11251-20
2.5 mm Vannas 弹簧剪刀Fine Science Tools15001-08弯曲型 
5 mm Vannas-Tubingen 弹簧剪刀Fine Science Tools15003-08直型
48 孔板Fisher08-772-52可从其他供应商处购买
8 孔腔室载玻片Fisher1256518可从其他供应商处购买
Triton X-100SigmaX100-500可从其他供应商处购买
BSA，第五组分FisherBP1605可从其他供应商处购买
NGSVector labsS-1000可从其他供应商处购买
NHSVector labsS-2000可从其他供应商处购买
三维旋转仪MidsciR3D-710可从其他供应商处购买
Western blot 孵育盒 XLLicor929-97401
Hoechst 33342Life TechnologiesH3570可从其他供应商处购买
Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36930可从其他供应商处购买，但不同封片剂在防止光漂白方面的效果存在差异
Superfrost Plus 载玻片Fisher12-550-15可从其他供应商处购买
盖玻片 22 x 22 x 1Fisher12-548-B可从其他供应商处购买
透明指甲油本地药店可从其他供应商处购买
纸板载玻片存放夹Fisher12-587-10可从其他供应商处购买
塑料载玻片盒Fisher03-448-10可从其他供应商处购买

参考文献

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