我们介绍了一种分离成年耳蜗柯蒂器官的方法，可获得完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）。同时，我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作步骤。结合这些技术，可对耳蜗中的毛细胞、支持细胞及其他细胞类型进行研究。
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本文内容
摘要
摘要
耳蜗内的柯蒂氏器包含机械感觉毛细胞及其周围的支持细胞，这些细胞呈螺旋状排列，并具有声音检测的音调定位梯度。小鼠耳蜗长约6毫米，通常分为三个转（顶转、中转和底转）进行分析。为了研究细胞丢失、细胞分裂或嵌合基因表达，耳蜗的整体封片或表面制备方法非常有用。该解剖方法结合免疫染色和共聚焦显微镜成像，可观察柯蒂氏器中z轴不同平面上的所有细胞。此外，还可从这些z轴堆叠图像中获得多个光学横截面。同时，整体封片解剖法也可用于扫描电子显微镜观察，但需要采用不同的固定方法。本文介绍一种将柯蒂氏器分离为三个完整耳蜗转（顶转、中转和底转）的方法。该方法适用于从出生一周至成年的小鼠，与新生小鼠样本所用技术不同，因后者耳蜗尚未完全钙化。稍作修改后，该方法也可用于大鼠耳蜗的解剖。我们还展示了使用荧光标记抗体进行免疫染色的操作流程。
引言
内耳中位于颞骨内的耳蜗呈螺旋形，其内部包含柯蒂氏器，这是哺乳动物的听觉感觉终器。耳蜗具有音调拓扑结构，通常分为顶回、中回和底回，分别对应不同的频率区域，其中高频声音的感知位于底部，低频感知位于顶部1。作为柯蒂氏器的机械感受细胞，毛细胞沿耳蜗全长分布，在小鼠中耳蜗长度约为6 mm2,3。这些细胞将通过充满液体的膜迷路传导的声波机械能转化为神经信号，并由中枢听觉结构进行处理。本文所述技术提供了一种在耳蜗骨化完成后制备柯蒂氏器整体装片的方法（适用于从出生后一周至成年阶段的样本）。我们还介绍了一种对整体装片耳蜗组织进行免疫染色的方法。耳蜗整体装片对于在天然空间排列中可视化所有毛细胞及其周围的支持细胞至关重要，并可借助共聚焦显微镜实现三维分析。
Hans Engstrom 博士和 Harlow Ades 博士于 1966 年首次描述了一种耳蜗整体铺片解剖方法。他们详细介绍了一种技术，可快速固定并解剖浸没在液体中的多种哺乳动物钙化耳蜗，以保留柯蒂氏器的短段完整结构，用于显微分析4。未固定的钙化大鼠耳蜗的解剖方法也已在教学视频中展示5。华盛顿大学的 Barbara Bohne 博士和 Gary Harding 博士对该方法进行了多项重要改进。在其耳蜗整体铺片法版本中，颞骨经脱钙处理后包埋于塑料介质中，并解剖出五个半圈或十个四分之一圈的结构6,7。马萨诸塞州眼耳医院伊顿皮博迪实验室的....
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方案
伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得南伊利诺伊大学医学院机构动物护理和使用委员会的批准。
1. 颞骨的提取
- 在小鼠颅底识别颞骨13，并使用标准纹状镊子刮除颅 神经。
- 将标准纹状镊子置于耳囊的尖端，用另一只手的拇指按压后半规管，以松动包裹的耳蜗。
- 用拇指和食指手动或使用10.5 cm精细剪刀将颞骨下半部分从颅骨上分离。
2. 固定后颞骨
- 将颞骨放入含有250–500 µl 4%多聚甲醛（PFA）的2 ml微量离心管中，PFA用pH 7.4的10 mM磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，室温孵育2–20小时。
注意：无需打开顶盖或向圆窗或卵圆窗注射PFA。 建议使用无甲醇、超纯、电子显微镜（EM）级的PFA，该试剂可购得16%浓度的玻璃安瓿装产品。将安瓿中的PFA用PBS按1:4稀释成4%溶液后，若储存于4 oC，可在2周内使用 （某些抗体需要短时间固定，而另一些则可耐受过夜（O/N）固定） 。
3. 脱钙颞骨
- 固定后，用移液器吸除PFA，并加入略多于2 ml的120 mM乙二胺四乙酸（EDTA）。确保完全充满2 ml微量离心管....
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结果
我们介绍一种从发生钙化的耳蜗组织中分离出完整的三个耳蜗回（顶回、中回和底回）的耳蜗柯蒂氏器的方法，关键解剖步骤见图1。在出生后第一周的发育阶段，小鼠耳蜗的钙化尚不完全，此时可采用较为简单的解剖方法13。若将新生小鼠整体封片解剖法用于P7及更年长小鼠的耳蜗组织，会导致柯蒂氏器撕裂和破碎。此时螺旋韧带/侧壁已更牢固地附着，无法在不造成损伤的情况下从感觉上皮剥离。因此，对于P6以后的样本，必须采用“成年”整体封片解剖法。本文展示了P15小鼠耳蜗中回的一个示例，该样本经解剖后使用毛细胞和支持细胞标记物进行免疫染色（图2）。利用整体封片技术还可获得光学横截面图像（图3）。
在整体耳蜗铺片解剖或在载玻片上安装耳蜗螺旋结构的过程中，可能会出现多种问题。在去除螺旋韧带/侧壁时，切除过多或不足之间存在一个狭窄的操作窗口。若切口位置靠近最外一列毛细胞.......
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讨论
要成功进行整体封片解剖和免疫染色，有几个关键步骤。但在进行这两种方法之前，必须对耳蜗组织进行适当的固定。我们建议使用无甲醇、超纯、电镜级的多聚甲醛（PFA）。由粉末配制的PFA可能残留微量甲醇，并存在pH不稳定的问题，这会降低免疫荧光的质量。其他研究团队也已证明，使用不含甲醛的固定剂同样可以完成类似的解剖14-16。固定时间同样重要，且因抗体而异。某些抗体可耐受过夜（O/N）固定，而另一些抗体则在仅使用1小时PFA固定时效果不佳（不过这种情况较为罕见）。固定不足的组织在解剖过程中容易出现结构解体，给操作带来困难。 根据我们的经验，3至4小时的固定时间足以实现充分固定，且不会干扰听觉研究领域中常用的大多数一抗的染色效果。
EDTA 也可能干扰一抗；因此某些抗体在新生组织中效果良好，但在经过脱钙处理的 P7 或更年长动物的组织中则可能无效。固定后，颞骨在脱钙前可储存的时间长短不一，具体取决于所检测的抗原。某些抗原要求在固定后的数天至数周内完成脱钙和解剖，而另一些抗原则可在脱钙前或脱钙后储存数年，且不会降低免疫染色的质量。我们建议将样本以颞骨形.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究部分得到了美国海军研究办公室（N000141310569）资助项目的支持。南伊利诺伊大学医学院研究影像设施的设备由美国国家研究资源中心-卫生（S10RR027716）资助支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 标准 模式镊子 | Fine Science Tools | 11000-12 | 可从其他供应商处购买 |
| 10.5 cm 精细剪刀 | Fine Science Tools | 14060-11 | 可从其他供应商处购买 |
| 2 ml 微量离心管 | MidSci | AVSS2000 | 可从其他供应商处购买 |
| 16% 甲醛，无甲醇，超纯，电子显微镜级 | Polysciences | 18814 | 有毒——需佩戴手套，不可倒入水槽处理。可从其他供应商处购买。 |
| PBS pH 7.4 | Sigma | P3813-10PAK | 可从其他供应商处购买 |
| EDTA | Fisher | BP118-500 | 可从其他供应商处购买 |
| 滚轴混合仪（端对端旋转） | Fisher | 05-450-127 | 可从其他供应商处购买 |
| 60 mm 培养皿 | Fisher | 50-202-037 | 可从其他供应商处购买 |
| Dow Corning Sylgard 184 硅胶封装试剂盒 | Ellsworth Adhesives | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| 活性炭 | Fisher | AC134372500 | 可从其他供应商处购买 |
| 体视解剖显微镜 | Zeiss | Stemi 2000 | 可从其他供应商处购买 |
| Dumont #4 珠宝匠镊子 | Fine Science Tools | 11241-30 | |
| Dumont #5 珠宝匠镊子 | Fine Science Tools | 11251-20 | |
| 2.5 mm Vannas 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15001-08 | 弯曲型 |
| 5 mm Vannas-Tubingen 弹簧剪刀 | Fine Science Tools | 15003-08 | 直型 |
| 48 孔板 | Fisher | 08-772-52 | 可从其他供应商处购买 |
| 8 孔腔室载玻片 | Fisher | 1256518 | 可从其他供应商处购买 |
| Triton X-100 | Sigma | X100-500 | 可从其他供应商处购买 |
| BSA，第五组分 | Fisher | BP1605 | 可从其他供应商处购买 |
| NGS | Vector labs | S-1000 | 可从其他供应商处购买 |
| NHS | Vector labs | S-2000 | 可从其他供应商处购买 |
| 三维旋转仪 | Midsci | R3D-710 | 可从其他供应商处购买 |
| Western blot 孵育盒 XL | Licor | 929-97401 | |
| Hoechst 33342 | Life Technologies | H3570 | 可从其他供应商处购买 |
| Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂 | Life Technologies | P36930 | 可从其他供应商处购买，但不同封片剂在防止光漂白方面的效果存在差异 |
| Superfrost Plus 载玻片 | Fisher | 12-550-15 | 可从其他供应商处购买 |
| 盖玻片 22 x 22 x 1 | Fisher | 12-548-B | 可从其他供应商处购买 |
| 透明指甲油 | 本地药店 | 可从其他供应商处购买 | |
| 纸板载玻片存放夹 | Fisher | 12-587-10 | 可从其他供应商处购买 |
| 塑料载玻片盒 | Fisher | 03-448-10 | 可从其他供应商处购买 |
参考文献
- Robles, L., Ruggero, M. A. Mechanics of the mammalian cochlea. Physiol Rev. 81 (3), 1305-1352 (2001).
- Ehret, G., Frankenreiter, M. Quantitattive analysis of cochlear structures in the house mouse in relation to mechanisms of acoustical information process....
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重印与许可
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