一种结合染色体微阵列比较基因组杂交、全外显子组测序的新型策略 子宫内 电穿孔法在啮齿类动物中鉴定脑部畸形的致病基因

摘要

室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.

摘要

涉及大脑皮层的出生缺陷，也称为皮层发育畸形（malformations of cortical development, MCD），是智力障碍的重要病因，占儿童期耐药性癫痫病例的20%–40%。高分辨率脑成像技术已促进了 体内 识别大量MCD表型。尽管脑成像、基因组分析和动物模型构建已取得进展，但仍缺乏一种系统性优先筛选候选基因并检测假定突变功能效应的直接工作流程。为解决这一问题，已开发并验证了一种可识别MCD新致病基因的实验策略。该策略基于通过array-CGH或全外显子组测序鉴定候选基因组区域或基因，并通过在发育中的啮齿类动物大脑中失活这些基因或过表达特定突变，来表征其功能影响 在子宫内 电穿孔。该方法促成了以下发现 C6orf70 基因，编码一种假定的囊泡蛋白，在室周结节状异位（一种由神经元迁移缺陷引起的脑皮质发育畸形）的发病机制中起作用。

引言

大脑皮层在认知和智力过程中起着关键作用，同时参与情绪调控、学习与记忆。因此，许多神经系统和精神疾病都源于皮层发育畸形（MCD）。MCD 的病因复杂，涉及获得性因素和遗传因素。遗传决定的 MCD 累积患病率约为 2%，且大多数为散发病例。例如，先天性脑发育不良在人群中的发病率估计超过 1%，某些类型的 MCD 在所有癫痫患者中占比超过 14%，在重度或难治性癫痫患者中则高达 40%^1,2。

室管膜下结节状异位（Periventricular Nodular Heterotopia, PNH）是最常见的脑皮质发育畸形（MCDs）之一，由神经元从脑室区（VZ）向发育中的大脑皮层迁移异常所致。神经元迁移失败导致异位神经元聚集在侧脑室壁周围，通常可通过磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）观察到。PNH 的临床表现、解剖特征和影像学特征具有异质性。结节可表现为单侧小范围病灶，也可为双侧对称性病灶。常见的临床后遗症包括癫痫和智力障碍³。位于 Xq28 的 Filamin A（即 FLNA）基因突变在所有 X 连锁双侧 PNH 家系中均被发现，在散发患者中检出率为 26%^3,4。位于 20q13 的 ARFGEF2 基因突变可导致一种罕见的隐性遗传型 PNH，已在两个近亲婚配家族中报道⁵。最近，在九名患有包括 PNH 在内的多系统疾病患者中，发现编码钙黏蛋白受体-配体对 DCHS1 和 FAT4 的基因存在双等位基因突变⁶。PNH 还被发现与脆性 X 综合征⁷、威廉姆斯综合征⁸、22q11 微缺失综合征⁹、5p15 重复¹⁰、1p36 缺失¹¹、5q14.3-q15 缺失¹²、6p25 缺失¹³ 以及 6q 末端缺失综合征^{14,15,16,17,18,19} 相关，提示其他致病基因广泛分布于全基因组中。然而，约 74% 的散发性 PNH 患者的遗传基础仍有待阐明¹⁷。

传统的基因定位方法（如阵列比较基因组杂交技术，array-CGH）已被证明是检测亚显微染色体异常的有力工具，然而，通过该方法鉴定出的基因组区域通常较大，且包含大量基因。

大规模并行测序技术的出现（即 全外显子组测序（WES）和全基因组测序（WGS）已显著降低了测序完整人类外显子组或基因组所需的成本和时间。然而，在大多数情况下，WES 和 WGS 数据的解读仍然具有挑战性，因为每位患者在数据过滤后通常会检出数十至数百个（甚至数千个，具体数量取决于分析类型）变异位点。

为了加快鉴定新型MCD致病基因的进程，我们设计了一种结合阵列比较基因组杂交（array-CGH）、全外显子组测序（WES）以及候选基因在体电穿孔（in utero electroporation, IUE）筛选的新型系统性策略。IUE技术可选择性地在啮齿类动物大脑中失活（或过表达）特定基因或突变，从而快速评估其在皮质形成中的作用^18,19。当候选基因与疾病发生相关时，通过RNA干扰介导的基因敲低或过表达一个或多个候选基因，预期会在神经元迁移和/或成熟过程中引起局部缺陷。一旦鉴定出某个基因，其失活（或过表达）可在啮齿类动物中重现患者中观察到的表型，则该基因将成为在散发性MCD患者中进行筛查的重要候选基因。利用该方法，我们近期揭示了C6orf70基因（亦称为ERMARD）在携带6q27染色体缺失的患者中对PNH发病机制的关键作用¹⁶。

方案

伦理声明：Wistar 大鼠在 INMED 动物实验中心进行交配、饲养和使用，符合欧洲联盟和法国的法律法规。

1. 用于阵列比较基因组杂交和全外显子组测序的DNA提取与定量

1. 根据制造商提供的方案，使用自动化DNA提取仪或市售的手动DNA提取试剂盒，从患者的人类血液白细胞中提取基因组DNA（gDNA）。使用分光光度计对所有样本进行定量。

2. 芯片-CGH 实验方案

1. 基因组DNA的限制性消化
   1. 用 RsaI 和 AluI 对来自患者的 500 ng 纯化基因组 DNA 以及商品化的人类对照 DNA 进行双酶切，37 °C 反应 2 小时。每个反应使用 0.5 μl 的 10 U/μL 酶。孵育 20 分钟。 在65 °C下孵育以灭活酶，然后将样本管转移至冰上。
2. 样品标记
   1. 加入适用于当前所用微阵列格式的适量随机引物至各反应管中（例如 5 µl用于1-plex、2-plex和4-plex微阵列。轻轻吹打混匀。
   2. 将样品管转移至热循环仪中，在95 °C下孵育3分钟 然后在 4 °C 下放置 5 分钟。
   3. 在冰上配制一份Cy3标记主混合液和一份Cy5标记主混合液，每份混合液包含以下体积的组分：10.0 µl 5X反应缓冲液、5.0 µl 10x dNTPs、3.0 µl Cyanine 3-dUTP 或 Cyanine 5-dUTP、1.0 µl Exo(-)Klenow酶和2.0 µl无核酸酶水。根据所使用的微阵列规格选择各试剂的相应体积。
   4. 将标记主混合液加入含有基因组DNA的各反应管中，轻轻吹打混匀。
   5. 将样品管转移至热循环仪中，于37 °C孵育2小时，再于65 °C孵育10分钟 然后将样品在 4 °C 下保存。
3. 标记基因组DNA的纯化
   1. 向每个反应管中加入 430 µl 的 1x TE（pH 8.0）。
   2. 将纯化柱放入2 mL收集管中，并正确标记各纯化柱。将每份标记的基因组DNA加样至相应的纯化柱上。
   3. 离心10分钟 14,000 × 在室温下，以微量离心机离心。弃去穿流液，将柱重新放回2 ml收集管中。
   4. 向每个柱中加入 480 µL 1x TE（pH 8.0）溶液，离心 10 分钟 在室温下，于微量离心机中以14,000 × g离心。弃去穿流液。
   5. 将柱子倒置放入一个新的2 mL收集管中，以1,000 × g离心1分钟 x g 在室温下以微量离心机离心，以收集纯化后的样品。
   6. 将样本体积调整至所用微阵列规格要求的体积，可使用浓缩仪或加入1x TE（pH 8.0）进行调节。例如，对于1-pack微阵列，将体积调至80.5 µL。将样本置于冰上孵育5分钟。 然后上下吹打溶液10次。
4. 杂交用标记gDNA的制备
   1. 在新的无RNase的1.5 mL离心管中，使用相应的Cy5标记样本和Cy3标记样本混合测试样本与参考样本。例如，对于1芯片微阵列，确保最终体积为158 µL。根据所使用的微阵列规格选择各样本的体积。
   2. 使用分光光度计通过测定 A260 nm（DNA）、A550 nm（Cy3）和 A650 nm（Cy5）处的吸光度来测量产量、标记程度或比活性。
      1. 使用以下公式计算产量：[DNA 浓度（ng/µl）× 样品体积（µl）]/1,000（ng/µg）。使用以下公式计算比活性：每微升染料的 pmol 数 / 每微升基因组 DNA 的 µg 数。
         注意：例如，当输入 DNA 为 0.5 µg 时，产量应为 8 至 11 µg，Cy3 标记样品的比活性（pmol/µg）应为 25 至 40，Cy5 标记样品的比活性应为 20 至 35。
   3. 为准备当前微阵列格式所需的杂交主混合液，混合以下试剂：50 µL Cot-1 DNA（1.0 mg/mL）、52 µL 10x aCGH 封闭剂和 260 µL 2x HI-RPM 杂交缓冲液。
   4. 向含有标记gDNA的1.5 ml无RNase的离心管中加入适量的杂交主混合液，以达到所用微阵列格式所需的总体积。例如，对于1包微阵列，确保每项反应的终体积为362 µl。
   5. 用移液器上下吹打混匀样品，然后在14,000 × g下快速离心 x g 孵育3分钟 在95 °C和37 °C下各反应30分钟。
5. 腔室组装与杂交
   1. 将洁净的垫圈载玻片放入腔室底座中，垫圈标签朝上，并与腔室底座的矩形部分对齐。确保垫圈载玻片与腔室底座表面平齐，无翘起。
   2. 将杂交样品混合物加入垫圈孔中，确保样品均匀分布。
   3. 将微阵列芯片轻轻放置在垫片玻片上，确保夹心配对正确对齐。然后组装反应室，将盖子盖在夹心结构的玻片上，并用手拧紧夹具。
   4. 通过垂直旋转组装好的腔室确保切片充分浸润。确保腔室内无气泡存在。如有必要，可将装置轻敲于硬质表面，以移除滞留的气泡。
   5. 将组装好的载玻片室放入旋转架中，设置转速为20 rpm。将杂交室置于烘箱中，在65 °C条件下杂交24或40小时。 根据所使用的微阵列格式。
6. 微阵列洗涤与扫描
   1. 将杂交室从烘箱中取出，浸入洗涤缓冲液1中，然后进行拆卸。
   2. 取出芯片载玻片，迅速放入室温的洗涤缓冲液1中的载玻片架内。
   3. 将芯片载片置于搅拌条件下清洗5分钟（使用搅拌子和磁力搅拌器）。调节搅拌器速度至4档（中速），以实现充分但不过于剧烈的混合。
   4. 用洗涤缓冲液2清洗芯片载片90秒 搅拌。轻轻将玻片从缓冲液中取出（应呈干燥状态），并在玻片保护器的辅助下将其装入玻片架中。
   5. 将玻片装入芯片扫描仪，并根据芯片制造商的说明进行扫描。
   6. 使用扫描仪配套的提取软件（版本 9.1.3.1），按照制造商提供的说明书分析结果。

3. WES 实验方案

1. 靶向富集
   1. 根据仪器操作说明，使用双链DNA BR检测试剂盒测定基因组DNA（gDNA）样品的浓度。
   2. 将5 µg高质量的双链DNA用1×低TE缓冲液稀释至总体积为50 µL，置于1.5 mL低吸附管中。
   3. 按照制造商说明设置超声破碎仪，并将微量管放入加载与卸载站中。保持管盖处于关闭状态。
   4. 缓慢将50 µL DNA样品通过预切隔垫转移，避免引入气泡。
   5. 根据超声破碎仪制造商推荐的参数进行DNA片段化，并按照制造商说明使用Bioanalyzer评估片段质量。目标DNA片段大小为150至200 bp。
2. DNA末端修复
   1. 通过将40 µL末端修复酶混合液与10 µL末端修复寡核苷酸混合液混合，配制末端修复反应体系。在涡旋振荡器上充分混匀。
   2. 在热循环仪中于20 °C孵育30分钟 ，随后保持在4 °C。请勿使用加热盖。
   3. 向每个50 µL剪切后的DNA样品孔中加入50 µL步骤3.2.1配制的末端修复反应混合液。通过反复吹打或轻柔涡旋充分混匀。
   4. 根据制造商说明，使用基于磁珠的纯化试剂盒对样品进行纯化。
3. 3'末端加poly(A)尾
   1. 向每个已完成末端修复并纯化的DNA样品（约20 µL）中加入20 µL dA加尾主混合液。
   2. 通过反复吹打或轻柔涡旋充分混匀。
   3. 在热循环仪中于37 °C孵育，随后保持在4 °C。请勿使用加热盖。
4. 捕获前索引接头连接
   1. 向每个A尾化的DNA样品中加入5 µL连接主混合液。
   2. 向每个样品中加入5 µL相应的捕获前索引溶液。
   3. 密封各孔，并在涡旋振荡器上剧烈振荡5秒以充分混匀。短暂离心收集液体。
   4. 在热循环仪中于20 °C孵育15分钟 ，随后保持在4 °C。请勿使用加热盖。
   5. 根据制造商说明，使用基于磁珠的纯化试剂盒对样品进行纯化。
5. 索引文库的扩增
   1. 通过将1 µL引物混合液与25 µL PCR主混合液混合，配制适当体积的捕获前PCR反应体系。在涡旋振荡器上充分混匀，并置于冰上保存。
   2. 在PCR板的各个孔中分别加入26 µL扩增混合液和24 µL各索引gDNA文库样品。
   3. 运行以下PCR程序：98 °C预变性2分钟，随后进行5个循环（98 °C变性30秒，60 °C退火30秒 ，72 °C延伸1分钟 ），最后在72 °C延伸10分钟。反应结束后将样品保持在4 °C。
   4. 根据制造商说明，使用基于磁珠的纯化试剂盒对样品进行纯化。
   5. 根据制造商说明，使用Bioanalyzer评估文库质量。
6. 用于杂交的索引DNA样品混合
   1. 对于每个捕获反应池，将适当体积的各个索引gDNA文库样品加入PCR板的一个孔中。例如，对于人或小鼠全外显子捕获文库，每池合并8个文库，每个索引文库使用187.5 ng。确保每个最终捕获反应池含有1,500 ng索引gDNA。
   2. 使用真空浓缩仪将每孔体积浓缩至<7 µL。避免样品完全干燥。
   3. 向每个浓缩后的gDNA池中加入足量无核酸酶水，使最终孔体积达到7 µL，然后剧烈涡旋振荡30秒。使用离心机或微型板离心器短暂离心，使液体沉降至孔底。
7. gDNA文库池与捕获文库的杂交
   1. 向每个7 µL的索引gDNA池中加入9 µL封闭混合液。反复吹打混匀。
   2. 密封各孔，将密封好的PCR板转移至热循环仪中，于95 °C孵育5分钟，随后保持在65 °C。确保板在65 °C至少保持5分钟。
   3. 根据捕获文库的大小，配制适当稀释比例的RNase阻断剂（对于小于<3.0 Mb的文库采用10%稀释，大于>3.0 Mb的文库采用25%稀释）。
   4. 根据捕获文库大小，在冰上放置的PCR板中加入适量捕获文库与稀释后的RNase阻断剂溶液。通过吹打充分混匀。对于小于<3.0 Mb的捕获文库，使用2 µL文库和5 µL 10%稀释的RNase阻断剂；对于大于>3.0 Mb的捕获文库，使用5 µL文库和2 µL 25%稀释的RNase阻断剂。
   5. 向每个含有7 µL捕获文库/RNase阻断剂混合液的孔中加入37 µL杂交缓冲液。通过吹打充分混匀，并短暂离心收集液体。
   6. 保持gDNA池板处于65 °C，使用多通道移液器将步骤3.7.5中全部44 µL捕获文库混合液转移至gDNA池板的每个样品孔中。缓慢吹打8至10次以充分混匀。
   7. 使用拱形条形盖密封各孔，确保所有孔完全密封。在热循环仪中的PCR板上放置压缩垫。
   8. 在65 °C孵育杂交混合物24小时 。注意：样品可孵育长达72小时，但必须确认延长孵育不会导致样品孔内液体大量蒸发。
8. 链霉亲和素包被磁珠的准备
   1. 将洗涤缓冲液2在水浴或加热块中预热至65 °C。
   2. 在涡旋振荡器上剧烈重悬链霉亲和素磁珠。磁珠在储存过程中会沉淀。
   3. 对于每个杂交样品，向PCR板的孔中加入50 µL重悬后的磁珠。
   4. 洗涤磁珠并将其重悬于200 µL结合缓冲液中。
9. 利用链霉亲和素磁珠捕获杂交DNA
   1. 估算并记录24小时 孵育后剩余的杂交液体积。
   2. 保持杂交板在65 °C，使用多通道移液器将每个杂交混合液的全部体积（约60 µL）转移至含有200 µL洗涤后链霉亲和素磁珠的孔中。缓慢吹打3至5次以充分混匀。
   3. 密封各孔，并在旋转混合器（Nutator）或等效设备上室温孵育30分钟 。确保样品在孔内充分混合。
   4. 在离心机或微型板离心器中短暂离心捕获板。
   5. 将捕获板置于磁力架上，使磁珠吸附于管壁。移除并弃去上清液。
   6. 用200 µL洗涤缓冲液1重悬磁珠。反复吹打直至磁珠完全重悬。
   7. 在离心机或微型板离心器中短暂离心。
   8. 将板置于磁力架上。
   9. 等待溶液澄清后，移除并弃去上清液。
10. 捕获后多重测序样品处理
    1. 根据扩增反应数量，通过混合以下组分配制适当体积的PCR反应体系：9 µL无核酸酶水、25 µL主混合液和1 µL引物混合液。使用涡旋振荡器充分混匀，并置于冰上保存。
    2. 对于每个扩增反应，将步骤3.10.1中配制的35 µL PCR反应体系加入PCR板的孔中。
    3. 反复吹打每个磁珠结合的捕获文库池样品，确保磁珠悬浮液均匀。
    4. 将15 µL各捕获文库池磁珠悬浮液加入对应的PCR反应体系孔中。充分吹打混匀，直至磁珠悬浮液均匀。
    5. 将步骤3.10.2制备的PCR板放入热循环仪，运行以下PCR扩增程序：98 °C预变性2分钟，8至11个循环（98 °C变性30秒，60 °C退火30秒 ，72 °C延伸1分钟），最后在72 °C延伸10分钟。反应结束后将样品保持在4 °C。
    6. 根据制造商说明，使用基于磁珠的纯化方法对样品进行纯化。
    7. 根据制造商说明，使用Bioanalyzer评估样品质量。
11. 准备多重测序样品
    注意：最终富集的样品包含8个或16个索引文库的混合物，具体取决于捕获文库的大小及相应的捕获前混合策略。单个测序通道中可多重测序的索引文库总数由所用测序平台的输出规格以及捕获文库所需的测序数据量共同决定。
    1. 根据测序平台的通量计算每通道可合并的索引数量。单个测序通道中可多重测序的索引文库总数由所用平台的输出规格及捕获文库所需的测序数据量决定。例如，对于人全外显子v5文库，每个索引文库推荐测序数据量为4 Gb，每个捕获前混合池推荐测序数据量为32 Gb（8索引池）。
12. 文库测序
    1. 将文库加载至选定的高通量测序平台，并根据仪器说明进行测序运行。
13. 分析外显子组测序数据
    1. 运行所选的碱基识别分析流程和软件。例如，使用Stampy进行序列比对²⁰，使用Picard（http://broadinstitute.github.io/picard/）去除重复序列，并使用Platypus²¹识别单核苷酸多态性及插入或缺失（indels）。过滤同义变异及等位基因频率小于<5%的变异，并与亲本外显子组数据比较以识别新生（de novo）变异。

4. 质粒DNA制备 子宫内 电穿孔

1. 根据先前所述方法²²，设计若干针对候选基因编码序列或3'非翻译区（3'UTR）的短发夹RNA（shRNA）。
2. 为避免脱靶效应，采用标准方法通过BLAST在数据库中对shRNA的特异性进行检测；排除与其他大鼠基因互补性超过50%的shRNA。
3. 将退火后的寡核苷酸片段克隆至mU6-pro载体中，操作步骤如前所述²³。
4. 按照制造商说明书，使用大提试剂盒（Maxi-prep）纯化质粒DNA，并将其最终浓度调整为3 µg/µL。
5. 分装20 µl DNA（单独0.5 mg/ml pCAGGS-GFP，或与1.5 mg/ml shRNA构建体混合），加入2 µL快绿染料（Fast green dye，2 mg/mL），以便于观察注射过程。

5. 子宫内 电穿孔

1. 手术步骤
   1. 使用氯胺酮/赛拉嗪混合物（分别为每单位体重0.1 mg和0.01 mg）通过腹腔注射对E15.5妊娠雌性大鼠进行麻醉（E0定义为确认阴道栓阳性当天），以诱导麻醉。
   2. 通过观察脚趾夹捏反射是否消失，确认动物已完全麻醉。
   3. 使用剪毛器剃除动物下腹部毛发 ，并用聚维酮碘和70%酒精擦拭皮肤进行消毒。在麻醉期间于眼睛上涂抹兽用眼膏以防止干燥。
   4. 将动物置于加热源上，并在切口部位覆盖无菌手术巾（中央留有4–5 cm的开口）。佩戴口罩、实验服、帽子和无菌外科手套，直至手术结束前均保持无菌状态。
   5. 使用锐利的剪刀沿下腹部中线在皮肤上做一垂直切口（2–2.5 cm），然后沿中线在皮下肌层同样做一2.5 cm长的切口。
   6. 小心地从腹腔内暴露一侧子宫角。滴加37 °C预热的生理盐水溶液以保持胚胎湿润，并始终维持子宫湿润状态。
2. DNA注射与电穿孔
   1. 用持针钳轻轻夹住一侧子宫角，小心推动一个胚胎贴近子宫壁。一手固定胚胎，另一手持玻璃毛细管，从正中线旁1 mm处插入左侧侧脑室（深度2–3 mm），并通过显微注射仪注入约1 µL含快绿染料的DNA溶液，以便可视化监控注射过程。
   2. 将生理盐水滴加至3 × 7 mm²电极表面。将正极无菌电极置于注射侧（左侧侧脑室），负极无菌电极置于右侧脑室。使用脚控踏板施加5次电脉冲，每次间隔950 ms（电穿孔仪参数：4000 mF电容充电至40 V）。
3. 电穿孔后处理
   1. 将子宫角放回腹腔，向腹腔内滴加生理盐水，以使胚胎位置更自然，并补偿术中液体丢失。
   2. 使用可吸收缝合线缝合腹肌层，再用间断缝合法缝合皮肤。
   3. 将大鼠放回笼中，并持续监测直至其从麻醉中苏醒。
   4. 为缓解疼痛，术后48小时内每8–12小时通过皮下注射给予布托啡诺（0.03 mg/kg）一次。

6. 脑组织样本制备

1. 固定方法
   1. 在手术后第5天，使用气体麻醉剂（异氟烷）麻醉怀孕大鼠，随后快速进行颈椎脱位处死。
   2. 做一条垂直切口，重新打开腹腔。
   3. 暴露子宫角，将胚胎从子宫中取出，并用锋利的剪刀将其头部剪除。
   4. 尽可能减少组织损伤地取出脑组织：使用锋利的剪刀，沿头部后端（小脑）至前端（嗅球）的轴线做一小切口，刺穿皮肤和颅骨，然后用镊子剥离颅骨以暴露脑组织，并用小刮勺将脑组织取出。
   5. 将脑组织在4%多聚甲醛的1×磷酸盐缓冲液（PBS）中于4 °C浸泡过夜。
2. 脑切片
   1. 用1× PBS清洗脑组织10分钟。
   2. 将脑组织包埋于塑料包埋模具中的4%琼脂内。
      1. 准备50 mL含4%琼脂的1× PBS，用于包埋5个胚胎脑组织。确保溶解的琼脂温度不超过50 °C。
   3. 将脑组织在琼脂糖中于4 °C下聚合至少1小时。去除脑组织周围多余的琼脂糖。
   4. 将脑组织粘附到振动切片机的底板上，方向应使脑的前-后轴与刀片垂直。等待数分钟使胶水干燥，然后将粘有脑组织的底板放入振动切片机的样品室中。
   5. 向振动切片机中加入1× PBS，切取厚度为100 µm的脑切片。
   6. 将脑切片转移至载玻片上，吸去多余液体，滴加数滴封片剂，然后在脑切片上加盖盖玻片。

7. 共聚焦成像与定量分析

1. 让封片剂过夜干燥后再进行成像。使用激光扫描共聚焦显微镜以10倍物镜对切片进行成像。
2. 使用定量图像分析软件，将图像转换为8位，选择一个具有代表性的GFP阳性荧光细胞，并手动定义其轮廓。操作方法为单击 "估算" 使用套索工具勾画细胞的边界，细胞的直径和强度阈值将由此被软件自动保留。
3. 点击 "寻找细胞" 以使软件能够定位整个皮层中转染的细胞。如有需要，可手动去除假阳性结果。
4. 将皮层全层厚度划分为8个标准化的兴趣区域。为实现此目的，点击 "区域工具"，选择8 "区域条带" 其中第一条（1）和第八条（8）分别对应室管膜区（VZ）和皮层板（CP）的顶部。点击 "应用" 以允许软件计算转染GFP的细胞在整个皮层中的相对位置。最后点击 "保存定量分析" 导出数据至 Excel 文件以进行分析。

结果

用于鉴定新型代谢性脑病（MCD）致病基因的实验策略如图1所示。

通过对155例伴有发育性脑异常的患者队列进行阵列比较基因组杂交（array-CGH）分析，这些患者的临床表型包括室管膜下异位神经元（PNH）（图2A）、胼胝体发育不良、脑室扩张、小脑发育不全以及多小脑回畸形，并伴有癫痫、共济失调和认知功能障碍，我们在6q27区域发现了一个1.2 Mb的最小关键缺失区，该缺失区在12例患者中共同存在（图2B）²¹。该基因组区域包含四个已知基因（THBS2、PHF10、TCTE3 和 DLL1）以及两个预测基因（WDR27 和 C6orf70）（图2B）。

讨论

皮质发育畸形（MCDs）是智力障碍的重要病因，占儿童期耐药性癫痫病例的20-40%^1,2。在过去十年中，由于两个主要因素，人们对MCDs的兴趣显著增加。第一个因素是脑成像技术（尤其是磁共振成像，MRI）的进步，使医生和科学家能够观察到许多以往未被识别的脑部畸形。另一个因素是遗传学工具的发展，使得大量新的MCD致病基因得以被发现。这极大地加深了我们对大脑发育和功能机制的理解，并实现了更精确的遗传咨询。

过去，研究人员主要致力于致病基因的鉴定，而将设计功能实验以阐明这些基因在脑发育中的作用留待后续阶段。随着研究从罕见的、反复出现的遗传性疾病转向更为常见的散发性障碍，这一过程变得更加困难，因为传统的基因发现方法难以适用于后者。目前用于鉴定致病基因的方法通常只能识别出包含大量基因的较大基因组区域（如通过染色体微阵列分析，array-CGH），或在多个候选基因中发现若干难以验证的变异（如通过全外显子组测序WES或全基因组测序WGS）。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
皮可喷射器 III	Parker Hannifin Corp	P/N 051-0500-900	细胞内显微注射分配系统
快绿 FCF	Sigma-Aldrich	F7252	快绿用于注射过程的可视化监测
BTX ECM 830 电穿孔仪	BTX Harvard Apparatus	45-0002	ECM 830 是一种方波脉冲发生器，专为体外和体内应用设计
HM 650 V 切片机	Microm	10076838	HM 650 V 振动切片机，240V 50/60Hz，带振动刀片
FluoView 300	Olympus		Olympus FluoViewTM 300 是一种点扫描、点检测的共聚焦激光扫描显微镜，专为生物学研究应用设计
eCELLence 软件	Glance Vision Technologies		eCELLence 是专为细胞迁移定量分析设计的软件
安捷伦微阵列扫描仪套装			微阵列玻片
适用于 1 × 244K、2 × 105K、4 × 44K 或 8 × 15K	Agilent	Agilent p/n G4900DA, G2565CA 或 G2565BA
适用于 1 × 1M、2 × 400K、4 × 180K 或 8 × 60K	Agilent	Agilent p/n G4900DA 或 G2565CA
不锈钢杂交室	Agilent	Agilent p/n G2534A	用于阵列CGH杂交的腔室
杂交室垫圈玻片，5片装			用于阵列CGH杂交的垫圈
适用于1片装微阵列	Agilent	Agilent p/n G2534-60003
适用于2片装微阵列	Agilent	Agilent p/n G2534-60002
适用于4片装微阵列	Agilent	Agilent p/n G2534-60011
适用于8片装微阵列	Agilent	Agilent p/n G2534-60014
杂交炉	Agilent	Agilent p/n G2545A
安捷伦微阵列杂交室用杂交炉旋转器	Agilent	Agilent p/n G2530-60029
带加热盖的热循环仪	Agilent	Agilent p/n G8800A 或同等产品	用于孵育的热循环仪
1.5 mL 无RNase微量离心管	Ambion	p/n AM12400 或同等产品	微量离心管
磁力搅拌子	Corning	p/n 401435 或同等产品	搅拌仪器
Qubit 荧光计	Life Technologies	p/n Q32857	用于DNA定量的仪器
Qubit dsDNA BR 定量检测试剂盒，用于Qubit荧光计	Invitrogen	p/n Q32850	Qubit荧光计配套试剂盒
紫外-可见分光光度计	Thermo Scientific	NanoDrop 8000 或 2000，或同等产品	用于DNA定量的仪器
P10、P20、P200 和 P1000 移液器	Pipetman 或同等产品		DNA分配
真空浓缩仪	Thermo Scientific	p/n DNA120-115 或 同等产品	用于浓缩DNA的仪器
SureTag 完整DNA标记试剂盒	Agilent	p/n 5190-4240	DNA标记试剂盒（适用于人源样本）
纯化柱（50个单位）	Agilent	p/n 5190-3391	DNA标记试剂盒（适用于人源样本）
AutoScreen A，96孔板	GE Healthcare	p/n 25-9005-98	DNA标记试剂盒（适用于人源样本）
GenElute PCR 纯化试剂盒	Sigma-Aldrich	p/n NA1020	DNA标记试剂盒（适用于人源样本）
人基因组DNA		p/n G1521	DNA标记试剂盒（适用于人源样本）
用于CGH微阵列：	Promega	（女性）或 p/n G1471（男性）	阵列CGH对照DNA
用于CGH+SNP微阵列：	Coriell	p/n NA18507, NA18517, NA12891, NA12878, 或 NA18579	阵列CGH对照DNA
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液试剂盒 或	Agilent	p/n 5188-5226	阵列CGH杂交与洗涤
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液 1 和	Agilent	p/n 5188-5221	阵列CGH杂交与洗涤
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液 2	Agilent	p/n 5188-5222	阵列CGH杂交与洗涤
稳定与干燥溶液	Agilent	p/n 5185-5979	阵列CGH杂交与洗涤
Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交试剂盒	Agilent	p/n 5188-5220（25）或 p/n 5188-5380（100）	阵列CGH杂交与洗涤
人源Cot-1 DNA	Agilent	p/n 5190-3393	阵列CGH杂交与洗涤
安捷伦C扫描仪	Agilent		用于阵列CGH玻片的扫描仪
SureSelect XT2 试剂盒			靶向富集试剂盒
HiSeq 平台 (HSQ)，16 样本	Agilent	p/n G9621A
HiSeq 平台 (HSQ)，96 样本	Agilent	p/n G9621B
HiSeq 平台 (HSQ)，480 样本	Agilent	p/n G9621C
MiSeq 平台 (MSQ)，16 样本	Agilent	p/n G9622A
MiSeq 平台 (MSQ)，96 样本	Agilent	p/n G9622B
MiSeq 平台 (MSQ)，480 样本	Agilent	p/n G9622C
DNA 1000 试剂盒	Agilent	p/n 5067-1504	用于分离、定长和定量25至1000 bp的双链DNA片段的试剂盒。
高灵敏度DNA试剂盒	Agilent	p/n 5067-4626	用于分析片段化DNA或DNA文库的试剂盒。
AMPure XP 试剂盒			用于自动化PCR纯化的试剂盒。
5 mL	Agencourt	p/n A63880
60 mL	Agencourt	p/n A63881
450 mL	Agencourt	p/n A63882
Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1			生物素化核酸的分离与操作
2 mL	Life Technologies	Cat #65601
10 mL	Life Technologies	Cat #65602
Quant-iT dsDNA BR 定量检测试剂盒，用于Qubit荧光计			DNA定量
100次检测，2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32850
500次检测，2-1000 ng	Life Technologies	Cat #Q32853
Qubit 检测管	Life Technologies	p/n Q32856	DNA定量
SureSelect XT2 捕获文库	Agilent	根据实验而定	文库捕获试剂盒
SureCycler 8800 热循环仪	Agilent	p/n G8800A	DNA扩增
SureCycler 8800 热循环仪用96孔板模块	Agilent	p/n G8810A	DNA扩增
与SureCycler 8800兼容的96孔板	Agilent	p/n 410088	DNA扩增
光学条形盖	Agilent	p/n 410025	DNA扩增
拱形管条盖	Agilent	p/n 410096	DNA扩增
压缩垫	Agilent	p/n 410187	DNA扩增
2100 生物分析仪笔记本电脑套装	Agilent	p/n G2943CA	DNA扩增
2100 生物分析仪电泳套装	Agilent	p/n G2947CA	DNA扩增
Covaris 样品制备系统，E系列或S系列	Covaris		DNA剪切
Covaris 样品架		p/n 520078	DNA剪切
Nutator 板式混合器	BD Diagnostics	p/n 421105 或同等产品	板式混合器
GaIIx	Illumina		下一代测序仪