室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.
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室管膜下结节状异位（PNH）是成年期最常见的皮质发育畸形（MCD）形式，但在大多数散发病例中，其遗传基础仍不明确。我们近期开发了一种策略，用于识别MCDs的新型候选基因，并直接验证其致病作用 体内.
涉及大脑皮层的出生缺陷，也称为皮层发育畸形（malformations of cortical development, MCD），是智力障碍的重要病因，占儿童期耐药性癫痫病例的20%–40%。高分辨率脑成像技术已促进了 体内 识别大量MCD表型。尽管脑成像、基因组分析和动物模型构建已取得进展，但仍缺乏一种系统性优先筛选候选基因并检测假定突变功能效应的直接工作流程。为解决这一问题，已开发并验证了一种可识别MCD新致病基因的实验策略。该策略基于通过array-CGH或全外显子组测序鉴定候选基因组区域或基因，并通过在发育中的啮齿类动物大脑中失活这些基因或过表达特定突变，来表征其功能影响 在子宫内 电穿孔。该方法促成了以下发现 C6orf70 基因，编码一种假定的囊泡蛋白，在室周结节状异位（一种由神经元迁移缺陷引起的脑皮质发育畸形）的发病机制中起作用。
大脑皮层在认知和智力过程中起着关键作用，同时参与情绪调控、学习与记忆。因此，许多神经系统和精神疾病都源于皮层发育畸形（MCD）。MCD 的病因复杂，涉及获得性因素和遗传因素。遗传决定的 MCD 累积患病率约为 2%，且大多数为散发病例。例如，先天性脑发育不良在人群中的发病率估计超过 1%，某些类型的 MCD 在所有癫痫患者中占比超过 14%，在重度或难治性癫痫患者中则高达 40%1,2。
室管膜下结节状异位（Periventricular Nodular Heterotopia, PNH）是最常见的脑皮质发育畸形（MCDs）之一，由神经元从脑室区（VZ）向发育中的大脑皮层迁移异常所致。神经元迁移失败导致异位神经元聚集在侧脑室壁周围，通常可通过磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）观察到。PNH 的临床表现、解剖特征和影像学特征具有异质性。结节可表现为单侧小范围病灶，也可为双侧对称性病灶。常见的临床后遗症包括癫痫和智力障碍3。位于 Xq28 的 Filamin A（即 FLNA）基因突变在所有 X 连锁双侧 PNH 家系中均被发现，在散发患者中检出率为 26%3,
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伦理声明：Wistar 大鼠在 INMED 动物实验中心进行交配、饲养和使用，符合欧洲联盟和法国的法律法规。
1. 用于阵列比较基因组杂交和全外显子组测序的DNA提取与定量
2. 芯片-CGH 实验方案
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用于鉴定新型代谢性脑病（MCD）致病基因的实验策略如图1所示。
通过对155例伴有发育性脑异常的患者队列进行阵列比较基因组杂交（array-CGH）分析，这些患者的临床表型包括室管膜下异位神经元（PNH）（图2A）、胼胝体发育不良、脑室扩张、小脑发育不全以及多小脑回畸形，并伴有癫痫、共济失调和认知功能障碍，我们在6q27区域发现了一个1.2 Mb的最小关键缺失区，该缺失区在12例患者中共同存在（图2B）21。该基因组区域包含四个已知基因（THBS2、PHF10、TCTE3 和 DLL1）以及两个预测基因（WDR27 和 C6orf70）（图2B）。
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皮质发育畸形（MCDs）是智力障碍的重要病因，占儿童期耐药性癫痫病例的20-40%1,2。在过去十年中，由于两个主要因素，人们对MCDs的兴趣显著增加。第一个因素是脑成像技术（尤其是磁共振成像，MRI）的进步，使医生和科学家能够观察到许多以往未被识别的脑部畸形。另一个因素是遗传学工具的发展，使得大量新的MCD致病基因得以被发现。这极大地加深了我们对大脑发育和功能机制的理解，并实现了更精确的遗传咨询。
过去，研究人员主要致力于致病基因的鉴定，而将设计功能实验以阐明这些基因在脑发育中的作用留待后续阶段。随着研究从罕见的、反复出现的遗传性疾病转向更为常见的散发性障碍，这一过程变得更加困难，因为传统的基因发现方法难以适用于后者。目前用于鉴定致病基因的方法通常只能识别出包含大量基因的较大基因组区域（如通过染色体微阵列分析，array-CGH），或在多个候选基因中发现若干难以验证的变异（如通过全外显子组测序WES或全基因组测序WGS）。
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作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢 G. McGillivray 博士、J. Clayton-Smith 教授、W.B. Dobyns 教授、P. Striano 教授、I.E. Scheffer 教授、S.P. Roberston 教授和 S.F. Berkovic 教授提供 MCD 患者样本。感谢 F. Michel 博士和 D. Mei 提供技术指导和帮助。本研究获得了欧盟第七框架计划 DESIRE 项目（合同编号：Health-F2-602531-2013）（资助对象：V.C.、R.G.、A.R.、A.F. 和 C.C.）、法国国家健康与医学研究院（INSERM）（资助对象：A.R. 和 C.C.）、Jérôme Lejeune 基金会（R13083AA，资助对象：A.F.、E.P.P. 和 C.C.）以及普罗旺斯-阿尔卑斯-蓝色海岸大区（APO2014 - DEMOTIC，资助对象：C.C. 和 A.A.D.）的经费支持。D.A.K. 是欧洲分子生物学组织（EMBO）青年研究员，同时获得奥地利科学基金会（FWF）资助（项目编号 I914 和 P24367）。
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| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
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| HM 650 V 切片机 | Microm | 10076838 | HM 650 V 振动切片机，240V 50/60Hz，带振动刀片 |
| FluoView 300 | Olympus | Olympus FluoViewTM 300 是一种点扫描、点检测的共聚焦激光扫描显微镜，专为生物学研究应用设计 | |
| eCELLence 软件 | Glance Vision Technologies | eCELLence 是专为细胞迁移定量分析设计的软件 | |
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| Oligo aCGH/ChIP-on-chip 杂交洗涤缓冲液 2 | Agilent | p/n 5188-5222 | 阵列CGH杂交与洗涤 |
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| SureSelect XT2 试剂盒 | 靶向富集试剂盒 | ||
| HiSeq 平台 (HSQ)，16 样本 | Agilent | p/n G9621A | |
| HiSeq 平台 (HSQ)，96 样本 | Agilent | p/n G9621B | |
| HiSeq 平台 (HSQ)，480 样本 | Agilent | p/n G9621C | |
| MiSeq 平台 (MSQ)，16 样本 | Agilent | p/n G9622A | |
| MiSeq 平台 (MSQ)，96 样本 | Agilent | p/n G9622B | |
| MiSeq 平台 (MSQ)，480 样本 | Agilent | p/n G9622C | |
| DNA 1000 试剂盒 | Agilent | p/n 5067-1504 | 用于分离、定长和定量25至1000 bp的双链DNA片段的试剂盒。 |
| 高灵敏度DNA试剂盒 | Agilent | p/n 5067-4626 | 用于分析片段化DNA或DNA文库的试剂盒。 |
| AMPure XP 试剂盒 | 用于自动化PCR纯化的试剂盒。 | ||
| 5 mL | Agencourt | p/n A63880 | |
| 60 mL | Agencourt | p/n A63881 | |
| 450 mL | Agencourt | p/n A63882 | |
| Dynabeads MyOne 链霉亲和素 T1 | 生物素化核酸的分离与操作 | ||
| 2 mL | Life Technologies | Cat #65601 | |
| 10 mL | Life Technologies | Cat #65602 | |
| Quant-iT dsDNA BR 定量检测试剂盒，用于Qubit荧光计 | DNA定量 | ||
| 100次检测，2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32850 | |
| 500次检测，2-1000 ng | Life Technologies | Cat #Q32853 | |
| Qubit 检测管 | Life Technologies | p/n Q32856 | DNA定量 |
| SureSelect XT2 捕获文库 | Agilent | 根据实验而定 | 文库捕获试剂盒 |
| SureCycler 8800 热循环仪 | Agilent | p/n G8800A | DNA扩增 |
| SureCycler 8800 热循环仪用96孔板模块 | Agilent | p/n G8810A | DNA扩增 |
| 与SureCycler 8800兼容的96孔板 | Agilent | p/n 410088 | DNA扩增 |
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| 拱形管条盖 | Agilent | p/n 410096 | DNA扩增 |
| 压缩垫 | Agilent | p/n 410187 | DNA扩增 |
| 2100 生物分析仪笔记本电脑套装 | Agilent | p/n G2943CA | DNA扩增 |
| 2100 生物分析仪电泳套装 | Agilent | p/n G2947CA | DNA扩增 |
| Covaris 样品制备系统，E系列或S系列 | Covaris | DNA剪切 | |
| Covaris 样品架 | p/n 520078 | DNA剪切 | |
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| GaIIx | Illumina | 下一代测序仪 |
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