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方法文章

诱导等电位脑状态以研究内源性突触活动对神经元兴奋性的影响 In Vivo

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DOI：

10.3791/53576

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2016年3月31日

 ,  ,  ,  , 
1Inserm U1127, 2CNRS UMR 7225, 3UPMC Univ Paris 06, UMR S 1127, Sorbonne Universités, 4Institut du Cerveau et de la Moelle épinière (ICM)

本文内容

摘要

该方法可在生理相关的脑状态期间以及完全消除持续电活动后（导致脑电静息状态）对单个神经元进行持久的体内细胞内记录。在动物过渡至人工昏迷状态的过程中，其生理常数被严密监测。

摘要

神经元处理信息的方式既取决于其固有的膜特性，也依赖于传入突触网络的动态特性。特别是内源性产生的网络活动，会随着警觉状态的不同而显著变化，从而对神经元的计算功能产生重要调制作用。为了研究不同类型的自发性脑活动如何影响单个神经元的整合特性，我们建立了一种新的大鼠实验策略，该策略通过抑制 体内 通过系统注射高剂量戊巴比妥钠来完全抑制所有脑部活动。通过皮层脑电图（ECoG）与细胞内记录相结合的方式持续监测皮层活动，其活动逐渐减慢，最终形成稳定的等电位曲线。这种极端的脑状态使大鼠进入深度昏迷，实验过程中通过持续监测动物的生理常数对其进行严密观察。细胞内记录使我们能够表征并比较同一神经元在生理相关的皮层动态（如睡眠-觉醒周期中所见）以及在脑部完全静息状态下的整合特性。

引言

在缺乏任何环境刺激或行为任务的情况下， "静息状态" 大脑产生持续不断的电活动，可通过头皮记录为脑电图（EEG）波形。这种内源性脑活动的细胞内对应表现为背景膜电位波动（也称为 "突触噪声"），由兴奋性和抑制性突触电位组合而成，反映传入神经网络的持续活动 1,2这种自发性活动的频率和幅度随警觉状态的不同而变化。阐明网络活动对单个神经元兴奋性和反应性的影响，是神经科学面临的主要挑战之一。 3,4.

许多实验和计算研究探讨了持续的突触活动对神经元整合特性所产生的功能影响。然而，背景突触噪声所影响的不同神经元参数的具体作用仍不明确。例如，膜去极化的平均水平被发现与感觉输入触发动作电位的能力呈正相关5,6或负相关7-9。此外，尽管一些研究表明，由持续变化的传入突触输入流所引起的膜电位波动，可通过调节神经元输入-输出关系的增益，显著影响单个神经元的反应性3,10-13，但其他研究指出，由分流抑制介导的膜输入电导变化足以调节神经元增益，而与膜电位波动的幅度无关14,15。最后，近期在清醒动物中开展的研究强调，单个神经元对感觉信息的处理在很大程度上依赖于警觉状态和当前的行为需求16,17。

在高度互联的系统中，阐明某一特定过程功能作用的直接策略是确定该过程的缺失如何特异性地改变系统的功能。这一方法已在神经科学研究中得到广泛应用，例如通过实验性损毁或失活不同的脑区18-21，或通过药理学手段阻断特定的离子通道22,23。值得注意的是，该方法已应用于活体（in vivo）研究，以揭示功能连接性和网络动力学如何影响单个神经元的计算功能24-27。然而，迄今为止，旨在阻断神经元放电和/或干扰其基本生物物理特性的局部操控手段仅能部分奏效，且局限于相对较小的脑区体积28。

为了克服这些局限性，我们开发了一种新的方法 体内 在大鼠中采用实验方法，比较在特定脑状态下记录的单个神经元的电生理特性， 即， 嵌入特定网络动态中，与全脑突触活动完全抑制后所获得的结果进行比较 29在对照条件下，可产生两种不同的皮层动力学状态。通过注射中等剂量的戊巴比妥钠，可诱导出类似睡眠的皮层脑电图（ECoG）模式。或者，通过注射芬太尼，可产生类似于清醒状态下皮层活动的快速、低幅ECoG波动（类似清醒模式）。随后，在保持相同ECoG和细胞内记录的条件下，通过系统性注射高剂量戊巴比妥钠，实现内源性脑电活动的完全静默，其特征为等电位的ECoG和细胞内活动。由于诱导此类极度昏迷状态可能对生理功能造成致命后果，因此必须对生理变量进行细致且持续的监测。为此，我们严密追踪了心率、呼气末CO₂2 浓度（EtCO₂）2），O2 饱和度（SpO2以及实验过程中大鼠的核心温度。

我们使用锐利的微电极评估单个神经元在这些不同状态下的特性，这种电极特别适用于体内长期且稳定的记录。in vivo。此处描述的实验步骤可与其他电生理学和成像方法结合使用，并可推广至其他动物模型。

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方案

所有操作均按照欧洲联盟（指令 2010/63/EU）的指南进行，并经查尔斯·达尔文动物实验伦理委员会批准。本文描述了我们在实验室中常规使用的方法，但大多数步骤可根据各自的具体需求进行调整。

1. 手术准备

注意：所有切口和受压点应反复浸润局部麻醉剂（利多卡因或布比卡因）。本操作为终末性操作，若需要无菌准备，则应实施若干修改。

  1. 用戊巴比妥钠（40 mg/kg）和氯胺酮（50 mg/kg）进行两次局部分离的腹腔内（IP）注射，使大鼠麻醉。
  2. 让动物进入全身麻醉状态，并反复确认已达到手术麻醉深度（对脚趾夹捏无反应）。将大鼠置于反馈式加热毯上，并插入直肠探头以维持核心体温在约 37 °C。
  3. 在腹腔内放置导管，以便后续注射麻醉剂，并避免因反复穿刺而损伤器官 30。
    1. 剪除位于胃区右下或左下象限区域内一小块（约 2 - 3 mm）皮肤上的毛发。
      注意：也可使用脱毛膏。 
    2. 使用锋利的剪刀或手术刀在皮肤上做一个 2 - 3 mm 的切口。采用钝性分离法去除脂肪层和肌肉层，直至暴露腹腔。
    3. 将一根小导管插入腹腔约 1 - 2 cm，并用手术胶封闭伤口。
      注意：导管的直径和总长度应尽可能小（例如，2 French — 对应内径 0.043 mm），以减少死腔体积。聚氨酯管材最为合适。
    4. 将导管打结成环并缝合固定于皮肤，以确保其位置稳定。
  4. 插入气管插管，以在人工呼吸期间控制通气。
    1. 与前一步骤类似，准备目标区域（胸骨柄正上方气管处约 1 - 2 cm 范围），去除毛发并切开皮肤。
    2. 钝性分离浅层脂肪和肌肉，然后将唾液腺移开，轻柔地分离最后一层肌肉以暴露气管。
    3. 小心清除气管上方的组织，并用小镊子将缝线从气管下方穿过。打外科结，但暂不收紧。
    4. 在两个软骨环之间横向切开气管。如有出血，用棉签清除气管内的血液。
    5. 插入合适直径的气管插管，并收紧缝线结以固定插管。为增加稳定性，可将缝线进一步固定在气管插管更高位置。
    6. 用缝合线或缝合钉关闭切口。若计划重复使用气管插管，则此处避免使用手术胶。
  5. 将动物固定于立体定位仪中，并密切监测以下生理参数：皮层脑电图（ECoG）、血氧饱和度（SpO2）、呼气末二氧化碳分压（EtCO2）、心率（通过心电图 ECG）以及体温。持续监测并调节这些参数，以维持适当的麻醉深度和生理状态。必要时，可通过补充小剂量戊巴比妥钠（10 mg/kg）来加强麻醉。
  6. 在双眼上涂抹眼膏，防止角膜干燥。剪除头顶部毛发，做一条纵向切口（约 2 cm），并用手术刀或刮匙去除颅骨表面的结缔组织。
  7. 使用牙科钻在目标区域钻一个小型颅骨开窗（直径约 1.5 mm）。
    注意：此处靶向初级躯体感觉皮层的桶状皮层区（位于耳间线前 7 - 8 mm，中线外侧 4.5 - 5.5 mm 31）。反复冲洗以散热。
  8. 使用超细镊子轻柔地在硬脑膜上制造一个小孔。保留颅骨开窗内约 0.5 mm 区域用于放置皮层脑电图（ECoG）电极（见下一步）。持续用 0.9% NaCl 溶液（或人工脑脊液）保持皮层湿润。
  9. 将一个低阻抗（约 60 kΩ）的银电极（ECoG 电极）置于硬脑膜上，避免接触未被脑膜覆盖的皮层区域；参考电极则置于头部另一侧的头皮肌肉上。
  10. 在此阶段（最后一次戊巴比妥钠注射后 30 分钟），通过腹腔导管持续注射戊巴比妥钠（10–15 mg/kg/h）或芬太尼（3–6 µg/kg/h）以维持麻醉。前者将产生缓慢振荡、类似睡眠的 ECoG 模式，而后者则导致去同步化、类似清醒状态的皮层活动模式。
  11. 调节人工通气系统，使呼吸频率和潮气量接近大鼠自主呼吸水平（正常范围 70 - 115 次/分钟 32）。随后将机械通气连接至气管插管，并确认胸廓两侧均匀膨胀。如未达到，应调整通气管在气管内的位置。必要时，使用连接注射器或真空泵的导管吸除气管内的分泌物。
  12. 若所有生理参数 32–35 及 ECoG 29,36 模式均显示稳定的手术麻醉深度，则在每侧后肢肌肉注射三碘季铵酚（gallamine triethiodide）以实现动物麻痹，首次剂量为 40 mg/kg，之后每 2 小时追加 20 mg/kg 19,29,36,50。

2. 细胞内记录

  1. 使用拉针仪制备玻璃微电极（尖锐的微电极），使其尖端直径约为 0.2 µm，当充满 2 M 醋酸钾（KAc）溶液后，电阻介于 50 至 80 MΩ 之间。
  2. 将微电极插入带有银/氯化银（Ag/AgCl）导线的专用电极夹中，以连接细胞内放大器（通过前置放大器）。电极夹应固定于显微操作器上。将一根 Ag/AgCl 参比电极置于大鼠颈部肌肉处。
  3. 缓慢将微电极插入脑组织，直至目标区域，并通过监测电流脉冲引起的电压降来确认其电阻。必要时使用放大器的“buzz”（或“zap”）按钮清除电极堵塞。
  4. 在覆盖硅胶弹性体或 4% 琼脂糖以减少脑组织移动之前，使用棉签或合成吸水条轻轻吸干颅骨开窗区域（注意避免触碰 ECoG 或细胞内电极）。
  5. 以 1 - 2 µm 的步长逐步下压微电极，当接近细胞时电阻会升高，随后使用放大器的“buzz”功能穿透进入神经元。

3. 诱导等电状态

  1. 执行相应的实验方案（例如，同时记录神经元的膜电位、皮层脑电图（ECoG）和生理变量，以获取该阶段对细胞内注入电流的放电反应、电流-电压关系以及对感觉刺激的反应。
  2. 通过分析记录过程中膜电位和动作电位特性的稳定性，确保细胞内电极在细胞内的稳定。若不稳定，则不得进入下一步操作，应等待记录信号恢复稳定，或寻找另一个神经元。
  3. 通过腹腔注射途径注入高剂量但亚致死剂量的戊巴比妥钠（约90 mg/kg，根据戊巴比妥初始条件可低至35 mg/kg，根据芬太尼初始条件可高达155 mg/kg）。
    注意：在15 - 20分钟内 细胞内和ECoG波形应减慢，并伴有间歇性电静息，短暂达到所谓的 "爆发抑制" 档案 37,38，逐渐塌陷至完全等电位状态。预计心率将显著减慢（约降低 10 - 20%），但 SpO2 和呼气末二氧化碳（EtCO₂）2 应保持相对稳定。
  4. 如果未达到等电状态，可注射少量戊巴比妥钠（约为步骤3.1剂量的10%）。等待15分钟 如果仍未达到电静息状态，则不要继续追加麻醉剂。
  5. 重复实验方案，以比较网络动力学对记录神经元整合特性的影响。
    注意：停止麻醉注射后，脑电活动应在3至4小时内完全恢复。
  6. 实验结束时，注射致死剂量的戊巴比妥钠（200 mg/kg，腹腔注射）以处死大鼠。

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结果

诱导并维持脑电静息状态是一种精细的体内实验操作。该方法已被证实是直接研究皮层网络活动对神经元兴奋性和传递功能影响的有力工具29。图1展示了动物在诱导脑电静息状态前（图1A）和诱导后（图1B）的多参数监测结果，包括皮层脑电图（ECoG）和生命体征常数。

比较活跃状态与等电位状态下的ECoG、体温、EtCO2、SpO2、ECG信号的电生理图。
图1. 控制状态与等电位状态下生理参数的监测。
A 和 B

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讨论

我们在此介绍一种新的抑制方法 体内 在神经网络和细胞水平上，自发性脑电活动均显著降低。该过程导致一种极端的脑状态，称为等电位昏迷 41从临床角度来看，这种脑电活动消失是脑电图上可观察到的最严重异常，通常与不可逆性昏迷相关，所有患者要么死亡，要么持续处于植物状态。 42，但在由中枢神经系统抑制类药物（如硫喷妥钠）中毒或意外低体温引起时，至少可部分逆转 42 或窒息性心脏骤停 43在我们的实验范式中，通过大剂量静脉注射戊巴比妥钠，逐步实现等电位状态，该过程首先迅速引起ECoG频率成分的减少，随后 "爆发抑制" 模式 41,42，最终导致完全平坦的ECoG。在细胞内水平，自发性活动的消失具有相似的时间进程，同时伴随去极化和超极化膜电位波动的减少。因此可以假设，戊巴比妥钠的注射首先增强了突触抑制性传递，从而导致皮层神经元放电活动减少，随后兴奋性和抑制性突触传递进行性消失，最终引起等电位ECoG及细胞内活动的终止 29,44. 给予其他麻醉剂（如氯胺酮（个人观察）或异氟烷）后，也可观...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由法国基金会、法国国家健康与医学研究院、皮埃尔 & 玛丽·居里大学以及“未来投资”项目 ANR-10-IAIHU-06。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
戊巴比妥钠CentravetPentobarbital
氯胺酮500MerialImalgène 500
芬太尼 强生-CilagFentanyl
利多卡因CentravetXylovet
三碘季铵双酚酸镓SigmaG8134
皮层脑电图放大器A-M Systems交流放大器，型号 1700
细胞内放大器分子设备公司Axoclamp 900A
数据采集接口剑桥电子设计公司CED power 1401-3 
数据分析软件剑桥电子设计公司Spike2 版本 7
显微操作器ScientificaIVM-3000
毛细管拉制仪成机（Narishige）PE-2
硼硅酸盐玻璃毛细管哈佛仪器公司GC150F-10
直径0.125 mm银丝（用于细胞内记录）WPIAGT0525
银-氯化银参比电极PhymepE242
直径0.25 mm银丝（用于皮层脑电图记录）WPIAGT1025
人工呼吸系统MinerveAlpha Lab
生理参数监测系统DigicareLifeWindow Lite
加热毯哈佛仪器公司507215
体视显微镜徕卡M80
剪刀FST15005-08
杜蒙特#5镊子FST11295-10
杜蒙特#5SF镊子FST11252-00
IP聚氨酯导管 - 0.43×0.69 mm  InstechBTPU-027
硅酮弹性体WPIKWIK-CAST
牙科钻NSKY1001151 和 P496
外科粘合剂3Mvetbond

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戊巴比妥钠细胞内记录皮层脑电图脑功能静息突触活动抑制昏迷状态膜电位爆发抑制
诱导等电位脑状态以研究内源性突触活动对神经元兴奋性的影响 In Vivo
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