后皮肤微移植生成一个新的方法解聚表征的组织

Summary

该协议描述了一种新的方法来分解人体组织和​​创建自体微移植，与胶原蛋白海绵相结合，引起人体生物复合物准备皮损的治疗使用。另外，该系统保持在机械解聚后不同时间的微移植物的细胞生存力。

Abstract

几种新的方法，已经开发了生物技术在手术过程中，得到的自体细胞的悬浮液的领域中，为了对急性和慢性皮肤损害提供一个步骤的治疗方法。而且，从创伤，糖尿病，感染和其他原因引起的慢性而且急性伤口的管理，仍然具有挑战性。在这项研究中，我们描述了一个新的方法来创建从单个患者的皮肤组织及其临床应用自体微移植。此外，还进行体外皮肤，去epidermized真皮（DED）和多器官和/或多组织捐助者的真皮源性皮肤组织的生物学特性。所有组织被这个新协议分类的，使我们能够得到可行的微移植物。特别是，我们报道了这一创新协议是能够创建自体微移植物和胶原海绵准备上皮损要施加由生物复合物。在克里尼上的腿病变自体生物复合物的校准应用也有报告，表示再epitalization过程和病变的柔软性两者的改进。此外，我们的体外模型表明，该系统机械解聚后的细胞活力保持在一段时间内培养可达七（7）天。我们还观察到，通过流式细胞术分析，从解聚获得的细胞的池是由几个细胞类型，包括间质干细胞，即施加在组织再生和修复的方法中的一个关键的作用，对它们的高的再生潜力。最后，我们表现出体外 ，在琼脂培养的菜时，此过程中保持微移植的不育。总之，我们的结论是这种新的再生方法可以是一个有希望的工具，临床医师在一个步骤上可行，无菌的，并且准备使用，可以单独或组合使用最常见的生物scaffo施加微移植物获得LDS。

Introduction

在过去的几年中，一些新的方法，已经开发了生物技术在手术过程中，得到的自体细胞的悬浮液的领域中，以治疗急性和慢性皮肤损伤提供一步法治疗。而且，从创伤，糖尿病，感染和其他原因造成的急性，但主要是慢性伤口的管理，仍然具有挑战性。有越来越多的证据表明，慢性伤口已成为严重的全球性健康问题，引起全世界对¹的医疗保健系统巨大的财政负担。

为了增加在皮肤损伤的治疗成功率，缺乏广泛操纵（包括蜂窝增强）和无菌条件下的维护是必要的，以创建可以在的受损区域被立即施加一个细胞悬浮液患者中，从而避免在洁净室较长的处理，如细胞工厂。圣从小皮肤活检，研磨，离心等分离方法（ 例如，酶或机械）arting，经常用于获得一个细胞悬浮液，其可在生长培养基中培养。所有的这些方法通常需要执行的很长一段时间，强调细胞结构，并导致降低细胞生存力的。另一个显著方面是获得准备好由临床医师可使用自体的细胞悬浮液，例如，以修复受损的区域。此外，众所周知，自体组织移植物存活的过户手续于通过感应和传导^2,3的原则接收站点，最终生存下来。理想的移植组织应该随时可用并具有低抗原性和供区的发病率^4。

这些证据的基础上，本研究的第一个目的是创建适合自体生物复合物在组织修复的临床应用。为此，我们描述了一个新的方法，以从被这个协议分类的皮肤组织开始自体微移植。案例呈现在本文中也描述为临床应用该协议结合胶原蛋白海绵获得自体微移植。这种方法已被报道为在人组织⁵的机械分解效率，并已用于临床移植物和真皮组织^6,7的再生以及用于在口腔颌面外科^8-10结缔组织再生疗法。

此外，本研究的第二个目的是皮肤组织的本协议其分解后的生物学特性。为此目的，皮肤组织的不同的同源样品来自不同的多器官的躯干区衍生和/或多组织捐赠者进行了处理上的收获，加工下列国家的规则和分配在艾米利亚 - 罗马涅地区的皮肤银行移植组织（CNT 2013年）。

病例报告:

显示由于车祸复杂外伤35岁的女病人被送往医院安科纳的重症监护病房。病人表现的腿感染，由于一个开放的伤口，并用外固定稳定复合骨折。两个病灶清除，实施时间与伤口成为负压治疗（VAC疗法）后的清洁和骨膜出现了健康，我们就从恢复两个月后，应用的协议。这个系统分解后，得到了微移植物被用来创建生物复合物胶原海绵这些建议后来为了植入，调查其对病灶修复功效。

Protocol

伦理陈述:自协议的临床应用程序需要使用患者的皮肤自体组织，其在体外表征同源皮肤组织在艾米利亚-罗马涅地区的皮肤银行下列国家规定的采伐，加工指引临床使用之前进行和分发用于移植的组织（CNT 2013）。

1.临床应用生物综合楼

注:该协议是基于临床的使用Rigeneracons（组织干扰物）和Rigenera机（组织干扰物系统）（ 图1A）。组织破坏剂是能够扰乱小片使用由六角形刀片和过滤的细胞和细胞外基质的成分具有约50微米的截止提供一网格组织的人体组织的生物医学干扰物。

1. 通过双向收集患者的skinsamplesOPSY冲头（ 图1B）和分解加入1ml生理盐水，每件以获得自体微移植物^6,7,9（或见步骤2.1）。
2. 放置1毫升胶原海绵的微移植物的（ 图1C）toform生物复合物用于临床应用。
3. 培养另一1毫升上在6ml补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中的存在胶原海绵的微移植物的在37℃在5％CO ₂的潮湿气氛中。
4. 以下培养3天后，固定生物复合物用0.3％多聚甲醛在室温10分钟。倾直接特定分配器到样品的石蜡。得到的切片用厚度为5μm的切片，并在玻璃载玻片放直接。
5. 浸泡5微米石蜡切片中用于组织学分析的玻璃，含有15 - 20毫升二甲苯（市售 - 间 - 二甲苯（40混合 - 65％），对二甲苯（20％），邻二甲苯（20％ ）和ETH基苯（6 - 20％）和甲苯，三甲基苯，苯酚，噻吩，吡啶和硫化氢）的每个3分钟的痕迹。
6. 沉浸在降低等级的乙醇的切片（100％至70％）（100％乙醇1小时，95％的乙醇1小时后，80％的乙醇1小时，70％的乙醇进行1小时），然后去离子水进行去paraffinizing和再水化的章节。
7. 染色切片与1 - 2毫升1克/ L Ematoxylin为1 - 2分钟，随后在水中漂洗，以除去任何Ematoxylin盈余。
8. 染色为4的部分 - 与曙红Y醇溶液5分钟，在浓度与70％乙醇混合的1％，而在用水稀释。
9. 使用1 - 2毫升曙红Y为每张幻灯片部分和流动自来水下冲洗。
10. 浸入部分中增加的乙醇等级（见步骤1.6），最后，在二甲苯中的通道1小时，盖玻片与基于安装mediumand放大100倍（ 图1D）在光学显微镜下观察之后。

2.收集，解体并在组织的体外分析

1. 分别为0.6毫米1毫米或2毫米的4种不同的多器官和/或多的行李箱区域的厚度用皮，走自主皮肤组织，乳头去epidermized真皮（DED）或真皮网状层（真皮）从40到55年的范围内组织的捐助者，下面就采收，加工和销售用于移植组织国家规则（CNT 2013年）。
   1. 轻轻冲洗在0.9％NaCl溶液的所有样品将它们在培养皿中在轨道摇动器5分钟。
   2. 使用5毫米活检穿孔，创建样品它是均匀的，从皮肤组织，扣减和真皮直径和分解之前称重所有组织标本。
   3. 插入皮肤组织，扣减或分别真皮，在组织破坏剂八个，三个或四个均匀样品，加入1.5毫升的解聚盐溶液。
   4. 执行不同对于所有组织样品解聚的时间在表1中所指示的。
   5. 使用从完整的组织样本作为对照衍生冲床活检的相应数字。
   6. 机械解聚后，吸含有微移植物和地点分别在一个12孔板的单个孔的每个样品的盐溶液。为进行完整控制冲床活检相同的协议。
   7. 添加补充有10％胎牛血清（FBS）和抗生素，以每个样品的RPMI 1640培养基1ml中。
   8. 立即评估细胞生存力。到每个孔中含有微移植物（分别由皮肤组织，扣减或真皮八个，三个或四个均匀样品同时分解获得）添加含有0.5毫克/毫升的MTT（3- [介质1毫升4,5-二甲基吡啶-2-基] -2,5-二苯基溴化）溶液，并在5％CO ₂ /空气的气氛中，在37℃孵育3小时。为进行完整控制相同的协议冲床活检。
   9. 温育后，除去所有含培养基的MTT，并添加到每个样品1毫升二甲基亚砜（DMSO）中10分钟。
   10. 转移的每个样品和DMSO在反应杯并使用分光光度计在570纳米处光密度（OD）读取。计算细胞存活率作为吸光度在570nm和该比在解聚之前使用组织的克数（克）的重量。为进行完整控制冲床活检相同的协议。
2. 机械分解后，吸出含有皮肤组织，单个供体的扣减和真皮样品衍生微移植盐溶液。
   1. 分别将每个样品中的12孔平板的单个孔或在用于分别细胞活力测试和形态分析的培养烧瓶中。
   2. 培养微移植物加入1ml（12孔板）或5毫升（培养瓶）的RPMI补充有10％FBS的1640培养基和抗生素在37℃在5％CO ₂ / Al的气氛r表示24小时或7天。
   3. 后24小时或7天（重复步骤2.1.8-2.1.10）评估细胞活力。
   4. 24小时后，并在烧瓶中培养7天后用光学显微镜进行形态分析评估细胞悬浮液的存在。
   5. 分析真皮的样品阳性的间质和造血细胞标志物，包括CD146，CD34和CD45抗原通过FACS分析^6。
   6. 在层流罩种子每个微接枝和各组织样本的相应小片段不完全分解的（由皮肤组织，分别扣减或真皮八个，三个或四个均匀样品同时分解获得）（> 50微米的尺寸后在含有5％羊血肉汤100μl的哥伦比亚琼脂平板分解处理）。
   7. 孵育在37℃的板三天，以评估不育上哥伦比亚琼脂板上进行微生物分析¹¹。

Results

在这个初步研究，第一个目的是探讨人类自体微移植与生物支持相结合，如胶原蛋白的生产生物复合物准备使用的能力。这些生物复合物在患者中植入 引起的车祸中（ 图2A）腿部病变和30天后（ 图2B）的组织修复相关的完整的再上皮中观察到。此外，临床随访上升5个月（ 图2C）后显示出已损坏的区域的良好的质地和柔软度，在平行于临床应用，还进行体外研究，以评估不同的皮肤组织的细胞生存力，如皮肤组织的，扣减和真皮前，由该系统分解后。特别是，考虑到每个类型的组织的不同的厚度，八阈值，可以在对皮肤组织，扣减和真皮单一步骤进行处理四加三活检，分别成立。活检的既定数目然后在四个不同的时间分列如表1所示，根据以查明解聚的最佳条件，以维持良好的细胞生存力的生物学特性。

Discussion

这一初步研究表明，通过该协议得到微移植物可与胶原海绵结合，如已经报道了其它临床应用中，以优化微移植物的植入物⁹的效力^，10，特别是，本研究中报道的生物的能力-complexes，通过微移植物和胶原海绵构成的，之后，从临床应用30天佐剂的腿病变的伤口愈​​合。此外， 在体外结果提供的证据有关此协议的有效性来分解三个不同的皮肤组织，保持可观的细胞存活率都机械解聚后，立即并24小时后和7天培养的。

细胞生存力的这种均化后的维持允许获得仅在一个步骤无菌自体微移植物，避免了大量的操纵。这个证据是一致最近其他文件中，该协议在体外的功效也测试了其他类型的组织，包括骨膜，心脏心房和眼球⁵直肌的活检。特别是，我们扣减和真皮样品中观察到增加的细胞存活率培养7天之后，可能是由于使用补充有10％胎牛血清的培养基。

除了维持细胞活力的，该系统...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Rigenera Machine	Human Brain Wave	79210R
Rigeneracons	Human Brain Wave	79450S
MTT	Roche Diagnostic GmbH	11465007001
RPMI 培养基	PBI International	733-2292
DMEM 培养基	PBI International	F 0415
抗生素	生物行业 PBI	03-038-1
用于 FACS 分析的抗体	eBiosciences	代码 12-1469 用于 CD146-P;代码 17-0349  用于 CD34-APC
哥伦比亚琼脂	BioMerieux Company	43041
Condress®	Abiogen Pharma		胶原蛋白海绵用于生物复合物
DMSO	Bioniche Pharma USA LLC， Lake Forest， IL
NaCl solution	Fresenius Kabi， Bad Homburg， Germany
二甲苯	卡洛·埃尔巴