本方案描述了一种用于解离人体组织并创建自体微移植物的新方法，这些微移植物与胶原海绵结合后可形成可用于皮肤损伤治疗的人源生物复合物。此外，该系统可在机械解离后的不同时间点维持微移植物的细胞活力。
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摘要
摘要
近年来，生物技术领域已开发出多种新方法，可在手术过程中获取自体细胞悬液，以实现对急性和慢性皮肤损伤的一次性治疗。此外，由创伤、糖尿病、感染及其他原因引起的慢性和急性创面管理仍然具有挑战性。本研究中，我们描述了一种从单个患者的皮肤组织制备自体微组织移植物的新方法及其临床应用。此外， 体外 还对来自皮肤、去表皮真皮（Ded）以及多器官和/或多组织供体的真皮组织进行了生物学表征。所有组织均通过该新方案实现解离，使我们能够获得具有活力的微组织移植物。特别是，我们报道了这一创新性方案能够制备由自体微组织移植物与胶原海绵组成的生物复合物，可直接应用于皮肤创面。此外，我们还报道了将自体生物复合物应用于腿部创面的临床案例，结果显示创面再上皮化过程及组织柔软度均得到改善。此外，我们的 体外 模型显示，使用该系统进行机械解离后，细胞活力在培养期间可维持长达七（7）天。我们还通过流式细胞术分析观察到，解离获得的细胞群体包含多种细胞类型，其中包括间充质干细胞；这类细胞因其具有强大的再生潜能，而在组织再生与修复过程中发挥关键作用。最后，我们证实了 体外 该方法在琼脂培养皿中培养时能够保持微移植物的无菌性。综上所述，我们认为这种新的再生方法可为临床医生提供一种有前景的工具，能够一步获得可存活、无菌且可直接使用的微移植物，这些微移植物可单独应用，也可与最常用的生物支架联合使用。
引言
近年来，生物技术领域开发出多种新方法，可在手术过程中获取自体细胞悬液，从而为急性和慢性皮肤损伤提供一步式治疗方案。此外，由创伤、糖尿病、感染及其他原因引起的急性尤其是慢性伤口的处理仍然具有挑战性。越来越多的证据表明，慢性伤口已成为一个严重的全球性健康问题，给世界各国的医疗系统带来了巨大的经济负担1。
为了提高皮肤病变治疗的成功率，必须避免对组织进行过度操作（包括细胞扩增），并维持无菌条件，以制备可直接应用于患者受损部位的细胞悬液，从而避免在洁净室（如细胞工厂）中进行更长时间的处理。通常从微小皮肤活检样本出发，通过研磨、离心及其他分离方法（例如，酶解或机械法）获得细胞悬液，并在培养基中进行培养。这些方法普遍耗时较长，会对细胞结构造成应激，导致细胞活力下降。另一个重要方面是获得可由临床医生立即使用的自体细胞悬液，例如用于修复受损区域。此外，已有充分证据表明，自体组织移植物可通过诱导和传导原理，在移植过程中存活并最终在受体部位定植2, 3。理想的移植物应易于获取，且具有低抗原性和较低的供体部位并发症风险4。
基于这些证据，本研究的首要目标是制备适用于组织修复临床应用的自体生物复合物。为此，我们描述了一种新的方法，通过该方案将皮肤组织解离，从而获得自体微移植体。本文还报告了一例临床应用案例，即采用本方案获得的自体微移植体联合胶原海绵进行治疗。该方法此前已被证实可有效实现人体组织的机械性解离5，并已应用于皮肤移植物及真皮组织再生的临床实践6,7，以及口腔颌面外科中结缔组织的再生治疗8-10。
此外，本研究的第二个目的是对该方案解离后的皮肤组织进行生物学表征。为此，在艾米利亚-罗马涅大区皮肤库，依据国家关于移植用组织采集、处理与分配的规定（CNT 2013），对来自多位多器官和/或多组织捐献者躯干部位的不同同源皮肤组织样本进行了处理。
病例介绍：
一名35岁女性患者因交通事故导致复合性创伤，被收治于安科纳医院重症监护室。该患者腿部因开放性伤口出现感染，并伴有采用外固定术治疗的复杂性骨折。经两次彻底清创后，伤口在负压引流治疗（V.A.C.疗法）后趋于清洁，骨膜呈现健康状态。我们在伤后两个月恢复期时实施了本研究方案。通过该系统进行组织解离后，所获得的微组织移植物与胶原海绵构建为生物复合体，并将其植入创面，以评估其在病损修复中的有效性。
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方案
伦理声明：由于该方案的临床应用需要使用患者的皮肤自体组织，因此需对其进行表征 体外 在中国台湾，Emilia Romagna区域皮肤库遵循国家关于移植用组织采集、处理与分发的规定（CNT 2013）指南，对同源皮肤组织在临床使用前进行了相应操作。
1. 用于临床应用的生物复合物构建
注意：本方案在临床上基于 Rigeneracons（组织解离装置）和 Rigenera 机器（组织解离系统）的使用（图1A）。该组织解离装置是一种生物医学用人体组织解离设备，能够利用六边形刀片构成的筛网对微小组织块进行解离，并通过截留孔径约为50微米的过滤装置分离细胞及细胞外基质组分。
- 通过皮肤活检钻取患者皮肤样本（图1B），并加入每块1 ml生理盐水进行分散，以获得自体微移植组织6,7,9（或参见步骤2.1）。
- 将1 ml微移植组织置于胶原海绵上（图1C），形成可用于临床应用的生物复合物。
- 将另外1 ml微移植组织接种于胶原海绵上，在含10%胎牛血清的6 ml DMEM培养基中，于37 °C、5% CO2湿化环境中培养。
- 培养3天后，用0.3%多聚甲醛在室温下固定生物复合物10分钟。使用专用分配器将石蜡直接倾注于样本上。用切片机切取厚度为5 µm的切片，并直接置于载玻片上。
- 将5 µm厚的石蜡切片浸入盛有15–20 ml二甲苯（市售，成分为间二甲苯40–65%、对二甲苯20%、邻二甲苯20%、乙苯6–20%，以及微量甲苯、三甲苯、苯酚、噻吩、吡啶和硫化氢）的玻璃容器中，每次3分钟。
- 将切片依次浸入浓度递减的乙醇溶液（100%至70%）中（100%乙醇1小时，95%乙醇1小时，80%乙醇1小时，70%乙醇1小时），然后用去离子水处理，以完成脱蜡和再水化。
- 用1–2 ml浓度为1 g/L的苏木精染色1–2分钟，随后用水冲洗以去除多余的苏木精。
- 用1%浓度的醇制伊红Y溶液与70%乙醇混合后稀释于水中，对切片染色4–5分钟。
- 每张切片使用1–2 ml伊红Y溶液染色，然后用流动自来水冲洗。
- 将切片依次浸入浓度递增的乙醇溶液（见步骤1.6），最后经二甲苯处理1小时，用封片介质封片，并在光学显微镜下以100倍放大倍数观察（图1D）。
2. 收集、解离和 体外 组织分析
- 使用取皮刀，从4名年龄在40至55岁之间的多器官和/或多组织供体的躯干部位，分别获取厚度为0.6 mm、1 mm或2 mm的独立皮肤组织、乳头层去表皮真皮（Ded）或网状层真皮（Dermis），操作需遵循国家关于移植用组织采集、处理与分配的规定（CNT 2013）。
- 将所有样本置于培养皿中，在旋转摇床上用0.9% NaCl溶液轻轻冲洗5分钟。
- 使用5 mm活检打孔器，从皮肤组织、Ded和Dermis中制备直径一致的样本，并在解离前称量所有组织标本。
- 分别将八份、三份或四份大小一致的皮肤组织、Ded或Dermis样本放入组织破碎仪中，加入1.5 ml生理盐水进行解离。
- 根据表1所示，对所有组织样本进行不同时间的解离处理。
- 使用来源于完整组织样本的相应数量的活检样本作为对照。
- 机械解离后，吸取含有微移植物的生理盐水，将每个样本分别置于12孔板的单独孔中。对完整的对照活检样本执行相同的操作流程。
- 向每个样本中加入1 ml RPMI 1640培养基，添加10%胎牛血清（FBS）及抗生素。
- 立即评估细胞活力。向每个含有微移植物的孔（由八份、三份或四份大小一致的皮肤组织、Ded或Dermis样本同时解离获得）加入含0.5 mg/ml MTT（3-[4,5-二甲基噻唑-2-基]-2,5-二苯基四氮唑溴盐）溶液的1 ml培养基，在37 °C、5% CO2/空气氛围中孵育3小时。对完整的对照活检样本执行相同的操作流程。
- 孵育结束后，移除含MTT的培养基，向每个样本加入1 ml二甲基亚砜（DMSO），作用10分钟。
- 将每个样本及其DMSO转移至比色皿中，使用分光光度计在570 nm波长下测定光密度（OD）。以570 nm处的吸光度与解离前组织质量（克，gr）的比值计算细胞活力。对完整的对照活检样本执行相同的操作流程。
- 机械解离后，吸取来自单个供体的皮肤组织、Ded和Dermis样本所产生的含微移植物的生理盐水。
- 将每个样本分别置于12孔板的单个孔中，或置于培养瓶中，用于细胞活力检测和形态学分析。
- 加入1 ml（12孔板）或5 ml（培养瓶）含10% FBS及抗生素的RPMI 1640培养基，在37 °C、5% CO2/空气氛围中培养24小时 或7天。
- 在培养24小时或7天后评估细胞活力（重复步骤2.1.8–2.1.10）。
- 通过光学显微镜观察培养瓶中培养24小时和7天后的细胞悬液情况，进行形态学分析。
- 对Dermis样本进行FACS分析，检测间充质和造血细胞标志物CD146、CD34和CD45抗原的表达情况6。
- 在超净工作台内，将每个微移植物（由八份、三份或四份大小一致的皮肤组织、Ded或Dermis样本同时解离获得）以及每个未完全解离的组织小片段（解离后大小>50微米）接种至含5%羊血肉汤100 µl的哥伦比亚琼脂平板上。
- 将平板在37 °C下孵育三天，并在哥伦比亚琼脂平板上进行微生物学分析，以评估无菌性11。
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结果
在本项初步研究中，首要目的是探讨人自体微移植组织与胶原等生物载体结合形成即用型生物复合物的能力。这些生物复合物被植入患者体内 因车祸导致腿部损伤 (图 2A）以及30天后伴随组织修复的完全再上皮化图 2B) 观察到损伤区域在5个月后的临床随访中表现出良好的质地和柔软度（图2C）。 与临床应用同时进行 体外 还进行了研究，以评估该系统在解离前后对不同皮肤组织（如皮肤组织、表皮层和真皮层）细胞活力的影响。特别是考虑到每种组织类型的厚度不同，分别确定了皮肤组织、表皮层和真皮层在单步操作中可处理的活检样本数量阈值，分别为8个、4个和3个。随后，按照下述指定的时间点，对已确定数量的活检样本进行了四个不同时间的解离处理。 表1根据其生物学特性，以确定最佳的解离条件，从而保持良好的细胞活力。
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讨论
这项初步研究表明，通过本方案获得的微移植物可与胶原海绵结合使用，正如其他临床应用中已有报道的那样，以优化微移植物植入的效果9, 10特别是，本研究报道了由微移植物和胶原海绵构成的生物复合物在临床应用30天后辅助腿部病变伤口愈合的能力。此外， 体外 结果提供了证据，表明该方案在解离三种不同皮肤组织方面具有有效性，且在机械解离后即刻以及培养24小时和7天后均能保持较高的细胞活力。
此类匀浆处理后细胞活力的维持，使得仅通过一步操作即可获得无菌的自体微移植材料，避免了复杂的操作过程。该结果与其他近期文献报道一致，这些研究均证实了该方案的有效性 体外 也在其他类型的组织中进行了检测，包括骨膜、心房活检组织以及眼球的外直肌5特别是，在培养7天后，我们在Ded和真皮样本中观察到细胞活力增加，这可能是由于使用了添加10%胎牛血清的培养基所致。
除了维...
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披露
作者 Antonio Graziano 是 Human Brain Wave s.r.l. 公司的科学总监，该公司负责生产并销售 Rigenera 系统。作者 Letizia Trovato 是 Human Brain Wave s.r.l. 公司科学部门的合作者。
致谢
作者感谢 Federica Zanzottera 博士在开展流式细胞术分析方面为本研究做出的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 再生机器 | 人脑电波 | 79210R | |
| 再生子 | 人脑电波 | 79450S | |
| MTT | Roche Diagnostic GmbH | 11465007001 | |
| RPMI 培养基 | PBI International | 733-2292 | |
| DMEM 培养基 | PBI International | F 0415 | |
| 抗生素 | Biological Industries PBI | 03-038-1 | |
| 用于 FACS 分析的抗体 | eBiosciences | CD146-P 对应货号 12-1469；CD34-APC 对应货号 17-0349 | |
| 哥伦比亚琼脂 | BioMerieux 公司 | 43041 | |
| Condress® | Abiogen Pharma | 用于生物复合物的胶原海绵 | |
| DMSO | Bioniche Pharma USA LLC, Lake Forest, IL | ||
| NaCl 溶液 | Fresenius Kabi, Bad Homburg, Germany | ||
| 二甲苯 | Carlo Erba |
参考文献
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重印与许可
