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大鼠的巴甫洛夫条件性接近训练

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DOI：

10.3791/53580

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2016年2月4日

 , 
1Neuroscience Graduate Program, University of Michigan, 2Department of Psychiatry, University of Michigan

本文内容

摘要

本文介绍了一种在大鼠中诱导经典条件性接近行为的实验方案。该方法可用于测量个体对奖励相关线索产生接近行为并赋予其奖赏显著性的倾向性差异，并用于研究成瘾易感性。

摘要

与无条件的奖赏性刺激偶然配对的线索，可通过一种称为奖赏显著性赋予的过程，使原本中性的刺激自身获得奖赏属性，转变为具有吸引力的刺激， "能够激发行为动机的“期望”刺激。在条件刺激（CS）非依赖于反应地呈现后，会形成巴甫洛夫条件性接近（PCA）。 例如，一个杠杆）来预测非条件刺激（US； 例如一种食物颗粒）来测量奖赏线索的激励显著性。在训练过程中，可形成三种条件化反应（CR）模式：线索追踪行为（指向条件刺激的CR）、目标追踪行为（指向非条件刺激的US的CR）以及中间型反应（同时具有上述两种CR）。其中，线索追踪者会将激励显著性赋予与奖赏相关的线索，因而更容易出现线索诱发的药物寻求行为复燃及其他成瘾相关行为，这使得条件位置性活动（PCA）成为研究成瘾易感性的潜在重要实验方法。本文描述了用于诱导大鼠PCA行为的材料与方法，并阐述了在单个实验中分析与解读PCA行为的具体步骤。

引言

从药物使用发展为成瘾涉及经典条件反射与操作性学习之间的复杂相互作用1,2。在用药和觅药行为过程中，行为与结果通过操作性学习过程被习得；然而，刺激（例如，与药物相关的线索）和奖赏之间的关联也通过经典条件反射过程被学习。经典条件反射线索具有预测价值，同时还能获得激励动机价值3，从而使其变得具有吸引力、令人渴望，并能够促进和维持奖赏寻求行为4。

然而，许多研究动物奖赏学习的实验程序无法区分预测性学习与动机激励性学习。例如，在药物自我给药实验中，通常同时采用工具性条件反射和经典性条件反射范式，使得大鼠学会执行某种行为（例如，鼻触，压杆， 等等。）以获得结果（即，静脉注射药物）。该奖赏性结果也会与巴甫洛夫刺激配对例如鼻触端口的光照、提示灯的呈现、输注泵的声音、液体输送到血液中的内感受感觉 等。在这些实验流程中，通常尚不明确线索是否仅仅因其与奖励之间的预测性关系而支持目标导向行为，还是线索本身已获得了独立的激励动机属性。

为了在实验上将巴甫洛夫刺激的奖赏激励价值与其预测价值分离开来，本实验室采用巴甫洛夫条件性趋近（Pavlovian conditioned approach, PCA）程序，以识别那些将激励显著性赋予奖赏相关线索的大鼠。在训练阶段，呈现一个条件刺激（CS； 例如，一个杠杆）独立于反应地预测非条件刺激（US； 例如，一种食物颗粒）。在多次训练过程中，会出现三种表型：趋近信号行为（指向条件刺激的条件反应[CR]）、趋近目标行为（指向非条件刺激的条件反应[CR]）以及中间型反应（同时表现出两种条件反应）。对于趋近目标者（GTs），条件刺激（CS）被用作预测奖赏出现的线索；而对于趋近信号者（STs），条件刺激则被赋予了激励显著性，从而变得具有吸引力并令人渴求。在本综述中，我们概述了执行条件位置趋近（PCA）实验所需的设备、实验设置及数据处理方法。此外，我们提供了PCA训练的代表性结果，列出了关键的实验注意事项，并讨论了PCA范式在研究成瘾及其他神经精神疾病中的潜在应用价值。

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方案

所有实验程序均已获得密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA；密歇根大学，安娜堡，密歇根州）的批准。

1. 仪器与软件

  1. 获取商用操作式条件反射箱及设备。参见材料表。
  2. 在大鼠操作式条件反射箱（24.1 cm 宽 × 20.5 cm 深 × 29.2 cm 高）中进行训练，将箱子置于带通风风扇的隔音柜内，以提供背景噪音。
  3. 每个箱体配备一个位于前壁中央的食丸仓（容器），前壁宽21.6 cm，食丸仓位于不锈钢网格地板上方3 cm处。确保食丸仓内置红外传感器，可检测动物头部进入装置的行为。
  4. 将食丸仓连接至食丸分配器，用于递送香蕉味食物食丸（45 mg）。
  5. 以平衡方式，在食丸仓左右两侧约2.5 cm处各安装一个可伸缩杠杆（CS），位置位于不锈钢网格地板上方3 cm处。
  6. 确保杠杆内部装有LED提示灯，使伸出状态的杠杆在视觉上更为显著。
  7. 若使用可伸缩杠杆，需通过校准程序进行校准：将10 g校准砝码置于杠杆顶部，然后使用六角扳手调节装置顶部的校准螺丝，直至仅靠砝码自身重量即可压下杠杆。
  8. 在箱体顶部、与食丸仓相对的墙壁上安装一盏红色室内灯。
    注意：使用红色室内灯可增强被照亮杠杆的视觉显著性。

2. 主成分分析训练

  1. 将抵达的成年雄性Sprague Dawley大鼠（250–300 g）配对饲养，在12小时光照/12小时黑暗循环的饲养环境中至少静置两天，期间不予干扰。
  2. 每天以轻柔的方式抓取每只大鼠，持续至少1分钟，连续进行两天，以使大鼠适应与人类的接触。为大鼠提供 随意摄取 在饲养群体中可自由获取食物和水。
  3. 在PCA训练开始前3天起，连续2天将香蕉味食物颗粒放入大鼠的饲养笼中（每只大鼠约15粒），使其适应该食物。
    注意：如果将大鼠成对饲养，最好将食物颗粒均匀地分放在饲养笼的两侧。
  4. 预训练项目
    注意：我们的所有编程均使用 MEDState Notation（Med Associates 软件）完成，手册可在线获取（mednr.com/pdf/doc003_MedPCProgramr.pdf）。程序以纯文本格式编写例如，使用 MedState Notation 保存为具有正确扩展名的 ASCII 或 DOS 文本）即，[文件名].mpc），然后使用 MED-PC 程序 Trans IV 进行转换。上述所有步骤在前述编程手册中有更详细的说明。
    1. 创建一个预训练程序，在程序开始5分钟后，以30秒可变时间（VT）间隔递送50粒食物颗粒即， 平均每30秒递送一粒食物丸，但实际递送时间在0至60秒之间随机变化。
    2. 编写预训练程序，使红色屋灯保持开启，但在整个程序期间（约25分钟），杠杆保持缩回状态。
    3. 在光周期期间进行预训练及所有后续实验操作。
    4. 在进行PCA训练前一日，将每只大鼠放入操作箱内，关闭并扣紧箱门，然后关闭隔音箱的门。
    5. 将每只大鼠放入实验舱后，应尽快启动预训练程序。
    6. 程序结束后，尽快将每只大鼠从其所在舱室中取出。
    7. 记录消耗的颗粒数量，并排除未完全消耗所有颗粒的大鼠，不再进行后续测试。
  5. 创建一个PCA训练程序，该程序在启动后1分钟开始，在约40分钟内完成25次训练试验。
    1. 编写程序，使在每次试验期间，杠杆伸入实验箱内并持续点亮8秒。
    2. 程序控制杠杆回缩，随后立即无条件递送一粒食丸至食丸储存器。
    3. 在每次试验之间设置 90 秒的 VT 间隔即杠杆延伸及随后的食物丸投放平均每隔90秒发生一次，但实际投放时间在30至150秒之间随机变化。
    4. 将每只大鼠放入条件化实验箱中，关闭并扣紧实验箱门，然后关闭隔音柜门。
    5. 将每只大鼠放入实验舱后，应尽快启动PCA训练程序。
    6. 程序结束后应尽快将每只大鼠从其隔间中取出。
    7. 排除未食用完所有颗粒饲料的大鼠，不再进行后续测试。

3. 数据处理

  1. 将输出信息转移至电子表格（例如，电子表格文档）。
  2. 创建一个提取识别信息（受试编号、开始日期、开始时间及箱体编号）以及输出信息（压杆次数与食槽进入次数及其潜伏期）的分析配置文件。
    注意：在实验中，该配置文件还会提取非条件刺激（non-CS）期间的食槽进入事件。将非条件刺激期间的食槽进入定义为发生在8秒条件刺激（CS）时段之外，并且处于杠杆未伸出时的可变时间（VT）90秒（即，60–120秒）期间的食槽进入。
  3. 通过将压杆反应和食槽进入的潜伏期上限设为8秒（即，条件刺激呈现的持续时间）进一步处理数据。此操作可通过电子表格中的IF函数实现：IF(X >8,8,X)。
  4. 计算反应偏向得分（即，单次实验会话中的总压杆次数与食槽进入次数；[压杆次数 - 食槽进入次数] / [压杆次数 + 食槽进入次数]）、潜伏期得分（即，会话期间执行压杆或进入食槽的平均潜伏期；[食槽进入潜伏期 - 压杆潜伏期]/8）以及概率差值（即，压杆或食槽进入所占比例；[压杆概率 - 食槽进入概率]）5。
    注意：使用这些公式时，所有得分应在1.0至-1.0之间。
  5. 通过计算每只大鼠在每次单独会话中的反应偏向得分、潜伏期得分和概率差值的平均值，得出其主成分分析（PCA）指数得分。
    注意：PCA指数得分应在1.0至-1.0之间。

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结果

我们发现，每天进行5至7次PCA训练即可将大鼠表型分类为ST、GT和中间型应答者（IR），尽管可根据特定实验室或实验的需求进一步增加训练次数。表型分类基于PCA指数评分，该评分通过计算各训练阶段的反应偏向、潜伏期评分和概率差异的平均值得出，具体方法已在本方案前文部分描述。表型的最终判定依据是最后两次PCA训练阶段PCA指数评分的平均值即，如果共有五次PCA训练，则为第4和第5次）。PCA指数将行为评分从1.0（完全的线索追踪）到-1.0（完全的目标追踪），0表示无偏向性（完全的中间反应）。由于线索追踪与目标追踪的倾向呈连续分布，因此需要设定分界值以确定表型，本实验室通常采用的PCA指数分界值为-0.5和0.5。换言之，线索追踪者（STs）的PCA指数评分≥0.5，中间反应者（IRs）的PCA指数评分介于-0.5至0.5之间，目标追踪者（GTs）的PCA指数评分≤-0.5。然而，根据具体实验需求，也可采用不同的PCA指数分界值。 图1 展示了三种表型在PCA训练过程中，压杆次数、潜伏期和压杆概率以及食丸盒入口次数的典型变化...

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讨论

主成分分析（PCA）训练可用于确定个体在将激励显著性赋予条件化线索方面的差异，这种差异被认为是成瘾易感性的重要组成部分。例如，先前的研究已证实，高倾向性个体（STs）会对食物和药物线索均赋予激励显著性6，且与食物和药物相关的线索在高倾向性个体中均可激活杏仁核-纹状体-丘脑环路中的相似脑区7。此外，高倾向性个体更具冲动性8，更容易因线索诱发药物寻求行为的复燃7,9，并且即使面临负面后果，仍会主动寻求与药物相关的线索10。

在进行条件性位置偏爱（PCA）实验时，大鼠的选择是优化表型多样性的关键步骤。例如，近交系大鼠在PCA行为的获得方面表现出显著差异（例如，Lewis 和 Fischer F344）11。即使在远交系群体中（例如，Sprague Dawley），不同供应商提供的动物在获得条件性位置偏爱（PCA）行为方面存在显著异质性（例如，Harlan Laboratories 与 Charles Ri...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由密歇根大学精神病学系（U032826；JDM）、国家药物滥用研究所（NIDA；K08 DA037912-01；JDM）以及美国国防部（DoD）国家国防科学与工程研究生（NDSEG）奖学金（CJF）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
用于大鼠的标准模块化操作测试箱（带改良顶盖）Med Associates, Inc.ENV-008CT顶盖设有通路槽，可用于药物输送拖线或其他背带系统；配备用于通路槽的ENV-008CTC（盖板插件）
扩展型PVC隔音屏蔽箱Med Associates, Inc.ENV-022V
最多支持十六个测试箱的PCI操作套装Med Associates, Inc.MED-SYST-16根据操作测试箱的数量，也可选用MED-SYST-8（最多支持八个测试箱的PCI操作套装）
SmartCtrlMed Associates, Inc.DIG-716P2
通用电缆，25′（7.6 m）Med Associates, Inc.SG-210CB根据个体需求，也可选用SG-210CB-50（通用电缆，50′ [15.2 m]）
18″（45.7 cm）3针Mini-Molex连接线Med Associates, Inc.SG-216A根据个体需求，也可选用SG-216A-2（2′ [61.0 cm] 3针Mini-Molex连接线）
电源线，25′（7.6 m） Med Associates, Inc.SG-210CP-25
大鼠用不锈钢格栅地板Med Associates, Inc.ENV-005根据偏好，也可选用ENV-005A（小鼠用不锈钢格栅地板） 
可重复使用废料盘Med Associates, Inc.ENV-007-P3
标准模块化测试箱用填充面板套装Med Associates, Inc.ENV-008-FP
大鼠用模块化颗粒分配器，45 mgMed Associates, Inc.ENV-203M-45
颗粒接收器，槽型Med Associates, Inc.ENV-200R2M根据偏好，也可选用ENV-200R1M（颗粒接收器，杯型） 
可伸缩杠杆Med Associates, Inc.ENV-112CM校准为25 g；在进行巴甫洛夫条件性接近训练前需调整至10 g
可伸缩杠杆提示灯Med Associates, Inc.ENV-112CML
大鼠用室内灯Med Associates, Inc.ENV-215M
100 mA替换灯泡，每包10个Med Associates, Inc.SG-800R红色；与ENV-215M（大鼠用室内灯）配合使用
颗粒饲料，45 mg，灵长类纯化饮食，香蕉味Bio-ServF0059每箱50,000粒 

参考文献

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