Method Article

利用双光子显微镜的艾滋病毒引起的神经炎症的小鼠模型脑血管结构的量化

DOI:

10.3791/53582

⸱

January 12th, 2016

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Human Genetics, University of Chicago

In This Article

Summary

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本文描述了一种可以使用体内和离体双光子显微镜量化大脑血管结构的方法。

Abstract

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人类免疫缺陷病毒 1 （HIV-1） 感染经常导致 HIV-1 相关神经认知障碍 （HAND），其特征是中枢神经系统 （CNS） 内的慢性神经炎症状态，被认为主要由病毒介导的小胶质细胞和脑驻留巨噬细胞的激活驱动。 HIV-1 感染还伴有脑血管血流 （CBF） 的变化，这增加了 HIV 相关慢性神经炎症可能导致 CBF 和/或脑血管结构发生变化的可能性。为了解决这个问题，我们使用了 HIV 诱导的神经炎症小鼠模型，并且我们已经测试了长期暴露在这种炎症环境中是否会损害脑血管系统并导致毛细血管网络稀疏。在本文中，我们描述了一种量化神经炎症性疾病小鼠模型 （HIV-1 Tat 转基因小鼠） 中皮质毛细血管密度变化的方法。 这种可推广的方法采用通过薄颅骨皮层窗口对皮质毛细血管进行体内双光子成像，以及对小鼠脑切片中皮质毛细血管进行离体双光子成像。这些程序分别生成毛细血管网络的图像和 z 堆栈文件，然后可以对其进行定量分析，以评估脑血管结构的变化。

Introduction

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在病毒感染的急性期的人类免疫缺陷病毒-1（HIV-1）的侵入脑，和生产性感染都小胶质细胞和脑定居巨噬细胞，导致它们的活化 - 并且两个来自宿主的炎症介质和可溶性HIV-1的释放virotoxins如Tat和gp120的（ 在 1,2-综述）。因此，慢性神经炎状态成为中枢神经系统，这被认为是有助于HIV-1相关的神经认知障碍（手），3-5的发病机制建立。

HIV-1的Tat或小鼠的中枢神经系统内白细胞介素（IL）-17A的慢性过度表达已被证明导致微血管稀疏6,7。这就提出了慢性神经炎症可以通过对脑血管的影响造成的手发病的可能性。为了进一步探讨这个问题，我们已经制定的方法来量化脑血管STRUCTures的。

本文介绍的方法用于定量毛细管节点，毛细管段的数量，平均段长度，总段长度，平均毛细管直径，并通过一薄的颅骨皮质窗口使用毛细管网络的体内显像总毛细管体积（从先前描述的改性协议）8,9，以及离体成像的脑切片中，使用双光子显微镜。这种组合方法提供用于脑血管的参数的整体定量，由于体内薄颅骨皮质窗口允许大脑保护环境，同时毛细管网络在脑切片的离体成像能够重建完整，立体毛细管网络 - 然后可以使用市售软件定量。

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Protocol

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罗切斯特大学委员会的动物资源学院批准在本文中进行的所有程序。

1.术前准备（和鼠标）

  1. 所有必需的设备准备手术区。消毒预先用70％的乙醇的过程​​中使用的所有工具。或者，使用玻璃珠灭菌或高压灭菌消毒的工具。
  2. 鼠标放置在异氟醚感应室，连接到一个异氟烷蒸发器。以1升/分钟的速率设置异氟烷水平至4％。
    注意:用强力霉素（DOX）诱导的HIV-1的Tat转基因的星形胶质细胞特异性胶质纤维蛋白（GFAP）启动子（HIV TAT-Tg小鼠）驱动此报告的实验中，小鼠10被用来检测艾滋病病毒的效果-1诱导的神经炎症对脑血管结构，如前所述7,10。
  3. 轻轻倾斜感应室，观察鼠标＃39; S翻正反射。一旦正位反射被抑制，异氟醚级别设置为2％和重定向从感应腔室到鼻锥的气流在手术台上。
  4. 快速地从感应室向水注入加热垫移动鼠标。继续通过鼻锥申请异氟烷（1.5-2％）。根据个人老鼠容忍通过呼吸频率（RR）的监测评估，调整麻醉。
    注:RR的抑郁症可能扰乱生理气体参数改变脑血流量和血管直径评估。试图保持每分钟55-65次呼吸之间RR。心脏速率（HR）也可以用于评估麻醉深度;让HR每分钟300-450次之间，以防止生理改变血管直径。通常情况下，麻醉就足够了1.5-2.0％异氟烷之间以1L /分钟的一个给定的鼠标。
  5. 执行脚趾捏进一步检查麻醉深度。如果鼠标不响应....

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Results

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薄颅骨皮质窗口允许用于体内双光子皮质毛细血管成像（ 图1）。合适的区域，图像显示众多的，不同的毛细血管（ 图1A）。在同一视场，不存在动脉细胞壁自发荧光，以及可能还有其他的荧光信号，如胶原荧光，诱发二次谐波生成11（图1B）。

一旦脑切片的准备已完成，摄像区域约1.5mm处中线位于（图2A）。甲100μm的Z堆叠产生用于分析在阿米拉分析软件（图2B）的三维图像。毛细血管网，然后通过手动放置节点在开始和毛细管的端部，或者任何位置，一个毛细b被曝牧场到另一个（图2C）。这将产生一个完全镂空图像从其中形态学参数被自动萃取（ 图2D）。毛细管节点，段的数.......

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Discussion

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此处所描述的方法可用于分析脑微血管结构在大范围的实验模型/设置。对于这种方法的成功，有三个关键步骤，必须要掌握。首先，将薄颅骨窗不能损伤颅骨或底层大脑。这是很容易变薄时穿破头骨，或引起热诱导的血管渗漏。这可以通过摄像干扰作为荧光染料将泄漏到焦点的平面中，并掩盖了毛细血管。如果颅骨薄头骨制备过程中频频打破，它很可能是过大的下行压力造成的。握住微扭矩钻尽可能接近的毛刺允许更大的触摸控制，这将减少对头骨的下行压力。

第二，动脉插管应该尽可能快地，一旦动脉被切断发生。未能快速插入导管可导致失血过多，将COMPromise鼠标的生理完整性。难以插入导管通常是由于导管的相对大的尺寸相比股动脉。可能有必要以拉伸导管以减小其直径。此外，＃5钳提示可用于抓住并放大在动脉，以缓解在放置导管的所作的开口。

第三， 在体内的外科手术的持续时间应该被最小化，使得氨基甲酸酯麻醉，可尽快给药。在异氟烷麻醉可引起的脑血管13的血管舒张，从而倾斜毛细管直径的数据。

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Disclosures

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作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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我们感谢罗切斯特大学 Multiphoton Core 的 Maria Jepson、Paivi Jordan 博士和 Linda Callahan 博士在整个协议完成过程中提供的技术建议。我们还感谢 Changyong Feng 博士的专家统计建议，以及罗切斯特大学医学中心的 Maiken Nedergaard 博士在本文中使用的头板设计。这项工作部分得到了美国国立卫生研究院 （NIH） 的 T32GM007356 和 R01DA026325 的资助;以及罗切斯特大学艾滋病研究中心资助P30AI078498 （NIH）。

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
徕卡显微镜Leica Inc.MZ8
高强度照明器Dolan-Jenner180
加热垫Stryker TP3E
T/泵Gaymar Industries， Inc.TP-500
TEC-4 异氟烷蒸发器Datex Ohmeda447
人工泪液凝胶Butler AHS7312
聚维酮碘溶液 Aplicare52380-1855-9
超细波恩剪刀精细科学工具14084-08
Dumot #5 镊子精细科学工具11295-10
Dumont #5/45 镊子精细科学工具11251-35
氯化铁溶液Ricca Chemical Company3120-16
Loctite 454 Prism Instant Adhesive Gel汉高45404
牙科水泥刮51459
Microtoruqe II 手柄套件皮尔逊牙科R14-0002
005 微钻科学工具19007-05
Norland 刀片（牙科微刀片）Salvin Dental6900
氨基甲酸酯Sigma-AldrichU25002B 组致癌物
编织缝合线 Ethicon735G
Vannas 弹簧剪刀精细科学工具15000-03
 动脉导管SAI Infusion TechnologiesMAC-01导管的末端被手动拉长以减小其直径。
血压监测World 精密仪器SYS-BP1
血压传感器和电缆World 精密仪器BLPR2
RAPIDLab 血气分析仪 西门子 248
40 μl 毛细管VWR15401-413
Texas Red-葡聚糖（70,000 MW，10 mg/kg 溶于盐水中）InvitrogenD-1830
成年小鼠脑切片仪Matrix Zivic InstrumentsBSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子显微镜OlypmusFV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee Ti：Sa 激光光谱物理学
ImageJ 软件美国国立卫生研究院 （NIH）在 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html
Amira SoftwareVisage Imaging 
刀 精细毛刺 仪

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. ....

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