方法文章

利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构

DOI：

10.3791/53582

⸱

2016年1月12日

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1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Human Genetics, University of Chicago

本文内容

摘要

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本文介绍了一种利用血管造影技术对脑内血管结构进行定量分析的方法 体内 和 离体 双光子显微镜

摘要

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人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染常导致HIV-1相关性神经认知障碍（HAND），其特征是中枢神经系统（CNS）内持续存在的慢性神经炎症状态，被认为主要由病毒介导的小胶质细胞和脑内常驻巨噬细胞活化所驱动。HIV-1感染还伴随脑血管血流（CBF）的改变，提示HIV相关的慢性神经炎症可能导致CBF和/或脑血管结构的变化。为探讨这一问题，我们采用了一种HIV诱导神经炎症的小鼠模型，检测长期暴露于该炎症环境是否可能损伤脑血管系统，并导致毛细血管网络的稀疏化。本文描述了一种在神经炎症疾病小鼠模型（HIV-1 Tat转基因小鼠）中定量分析皮层毛细血管密度变化的方法。该方法具有可推广性，采用 体内 通过薄颅骨皮层窗口对皮层毛细血管进行双光子成像，以及 离体 小鼠脑组织切片中皮层毛细血管的双光子成像。这些操作可分别获得毛细血管网络的图像和z轴层扫文件，随后可对其进行定量分析，以评估脑血管结构的变化。

引言

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人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）在病毒感染的急性期即可侵入大脑，并有效感染小胶质细胞和脑内常驻巨噬细胞，导致这些细胞被激活，进而释放宿主来源的炎性介质以及可溶性HIV-1病毒毒素（如Tat和gp120）（详见文献1,2）。其结果是在中枢神经系统（CNS）中形成持续性的神经炎症状态，这种状态被认为参与了HIV-1相关神经认知功能障碍（HAND）的发病机制3-5。

在小鼠中枢神经系统（CNS）中长期过表达HIV-1 Tat或白细胞介素（IL）-17A已被证明会导致微血管稀疏化6,7。这提示慢性神经炎症可能通过影响脑血管系统而在HIV相关性神经认知功能障碍（HAND）的发病机制中发挥作用。为了进一步探讨这一问题，我们建立了定量分析脑血管结构的方法。

本文介绍了一种用于定量分析毛细血管节点数量、毛细血管节段数量、平均节段长度、节段总长度、平均毛细血管直径以及毛细血管总体积的方法 体内 通过薄颅骨皮层窗口对毛细血管网络进行成像（基于先前描述的方案修改）8,9以及 离体 使用双光子显微镜对脑组织切片进行成像。该联合方法可对脑血管参数进行整体定量，因为 体内 薄颅骨皮层窗可保留大脑环境的完整性，同时 离体 脑切片中毛细血管网络的成像可实现完整三维毛细血管网络的重建，随后可利用....

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方案

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罗切斯特大学动物资源委员会批准了本文中进行的所有操作程序。

1. 术前准备（及小鼠）

  1. 准备手术区域并备齐所有所需设备。使用70%乙醇对术中使用的所有工具进行预先灭菌。可选择使用玻璃珠灭菌器或高压灭菌器对工具进行灭菌。
  2. 将小鼠放入连接异氟烷蒸发器的异氟烷诱导室中。将异氟烷浓度设定为4%，流速为1 L/min。
    注意：本研究中所报告的实验采用由星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子驱动的强力霉素（DOX）可诱导HIV-1 Tat转基因小鼠（HIV Tat-Tg小鼠）10，以检测HIV-1诱导的神经炎症对脑血管结构的影响，方法如先前所述7,10。
  3. 轻轻倾斜诱导室以观察小鼠的翻正反射。当翻正反射被抑制后，将异氟烷浓度调至2%，并将气流从诱导室转移至手术台上的鼻罩。
  4. 迅速将小鼠从诱导室转移至注水加热垫上。通过鼻罩持续给予异氟烷（1.5–2%）。根据通过呼吸频率（RR）监测评估的个体小鼠耐受性调整麻醉深度。
    注意：呼吸频率降低可能干扰生理气体参数，从而影响脑血流和血管直径的评估。应尽量将呼吸频率维持在每分钟55–65次。心率（HR）也可用于评估麻醉深度；应将心率维持在每分钟300–450次，以防止血管直径发生生理变化。通常情况下，对于特定小鼠，在1 L/min流速下使用1.5–2.0%异氟烷即可达到充分麻醉。
    5. ....

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结果

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薄颅骨皮层窗可实现 体内 双光子成像技术观察皮层毛细血管图1）。合适的成像区域应显示大量清晰可辨的毛细血管（图1A）。在同一视野下，动脉管壁细胞无自发荧光，但可能存在由二次谐波产生的其他荧光信号，例如胶原蛋白荧光。11 (图1B).

脑切片制备完成后，定位距正中线约1.5 mm的成像区域（图2A）。 100 µm的z轴堆栈生成用于Amira分析软件分析的三维图像图2B）。然后通过在毛细血管的起始端和末端，或任何一条毛细血管分出另一条毛细血管的位置放置节点，手动追踪毛细血管网络图2C）。由此生成一个完全骨架化的图像，并从中自动提取形态学参数（图2D毛细血管节点数、节段数、平均节段长.......

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讨论

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本文所述方法可应用于多种实验模型和条件下的脑微血管结构分析。要成功实施该方法，必须掌握三个关键步骤。首先，薄颅窗的制备不得损伤颅骨或其下方的脑组织。在颅骨减薄过程中容易造成穿孔，或因产热导致血管渗漏。这会干扰成像效果，因为荧光染料可能渗入焦平面，从而遮蔽毛细血管。如果在制备薄颅窗时频繁发生颅骨破裂，最可能的原因是向下的压力过大。将微型扭矩钻持握位置尽量靠近钻头，可获得更好的触觉控制，从而减小对颅骨的下压力度。

其次，一旦动脉被切开，应尽快进行动脉插管。若未能迅速插入导管，可能导致大量失血，从而影响小鼠的生理完整性。插管困难通常是由于导管相对股动脉而言尺寸偏大所致。此时可能需要拉伸导管以减小其直径。此外，可使用#5镊子的尖端夹住并扩大动脉切口，以方便导管插入。

第三，应尽量缩短体内手术操作的持续时间，以便尽快给予乌拉坦麻醉。异氟烷麻醉可引起脑血管扩张13，从而导致毛细血管直径数据产生偏差。

需要指出的是，Amira 分析软件能够自动提.......

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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我们感谢罗切斯特大学多光子核心实验室的 Maria Jepson、Paivi Jordan 博士和 Linda Callahan 博士在整个方案完成过程中提供的技术指导。我们还感谢 Changyong Feng 博士在统计学方面的专业建议，以及罗切斯特大学医学中心 Maiken Nedergaard 博士提供的本文所使用头固定板的设计。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 T32GM007356 和 R01DA026325 的支持；同时也得到了罗切斯特大学艾滋病研究中心资助项目 P30AI078498（NIH）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leica 显微镜Leica 公司MZ8
高亮度照明器Dolan-Jenner180
加热垫Stryker TP3E
T/PUMPGaymar 工业公司TP-500
TEC-4 异氟烷蒸发器Datex Ohmeda447
人工泪液凝胶Butler AHS7312
聚维酮碘溶液 Aplicare52380-1855-9
超精细 Bonn 剪刀精细科学工具公司14084-08
Dumont #5 镊子精细科学工具公司11295-10
Dumont #5/45 镊子精细科学工具公司11251-35
氯化铁溶液Ricca 化学公司3120-16
Loctite 454 Prism 瞬干胶凝胶汉高公司45404
牙科水泥Stoelting51459
Microtorque II 手柄套件Pearson 牙科公司R14-0002
微型钻头用 005 钻头精细科学工具公司19007-05
Norland 刀片（牙科微刀片）Salvin 牙科公司6900
聚氨酯Sigma-AldrichU25002B 类致癌物
编织缝合线Ethicon735G
Vannas 弹簧剪刀精细科学工具公司15000-03
 动脉导管SAI 输注技术公司MAC-01导管末端经手动拉伸以减小其直径。 
血压监测仪世界精密仪器公司SYS-BP1
血压换能器及电缆世界精密仪器公司BLPR2
RAPIDLab 血气分析仪 西门子公司 248
40 μl 毛细管VWR15401-413
德克萨斯红-葡聚糖（70,000 分子量，10 mg/kg 溶于生理盐水）InvitrogenD-1830
成年小鼠脑切片矩阵Zivic 仪器公司BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子显微镜OlympusFV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee 钛蓝宝石激光器Spectra-Physics
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（NIH）可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html 获取
Amira 软件Visage Imaging 

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Kraft-Terry, S. D., Buch, S. J., Fox, H. S., Gendelman, H. E. A coat of many colors: neuroimmune crosstalk in human immunodeficiency virus infection. Neuron. 64 (1), 133-145 (2009).
  2. Ghafouri, M., Amini, S., Khalili, K., Sawaya, B. E. HIV-1 associated dementia: symptoms and causes. ....

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重印与许可

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标签

HIV 1 Tat

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