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方法文章

利用双光子显微镜在HIV诱导的神经炎症小鼠模型中定量分析脑血管结构

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DOI：

10.3791/53582

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2016年1月12日

 ,  ,  , 
1Department of Microbiology and Immunology, University of Rochester Medical Center, 2Department of Human Genetics, University of Chicago

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用血管造影技术对脑内血管结构进行定量分析的方法 体内 和 离体 双光子显微镜

摘要

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）感染常导致HIV-1相关性神经认知障碍（HAND），其特征是中枢神经系统（CNS）内持续存在的慢性神经炎症状态，被认为主要由病毒介导的小胶质细胞和脑内常驻巨噬细胞活化所驱动。HIV-1感染还伴随脑血管血流（CBF）的改变，提示HIV相关的慢性神经炎症可能导致CBF和/或脑血管结构的变化。为探讨这一问题，我们采用了一种HIV诱导神经炎症的小鼠模型，检测长期暴露于该炎症环境是否可能损伤脑血管系统，并导致毛细血管网络的稀疏化。本文描述了一种在神经炎症疾病小鼠模型（HIV-1 Tat转基因小鼠）中定量分析皮层毛细血管密度变化的方法。该方法具有可推广性，采用 体内 通过薄颅骨皮层窗口对皮层毛细血管进行双光子成像，以及 离体 小鼠脑组织切片中皮层毛细血管的双光子成像。这些操作可分别获得毛细血管网络的图像和z轴层扫文件，随后可对其进行定量分析，以评估脑血管结构的变化。

引言

人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）在病毒感染的急性期即可侵入大脑，并有效感染小胶质细胞和脑内常驻巨噬细胞，导致这些细胞被激活，进而释放宿主来源的炎性介质以及可溶性HIV-1病毒毒素（如Tat和gp120）（详见文献1,2）。其结果是在中枢神经系统（CNS）中形成持续性的神经炎症状态，这种状态被认为参与了HIV-1相关神经认知功能障碍（HAND）的发病机制3-5。

在小鼠中枢神经系统（CNS）中长期过表达HIV-1 Tat或白细胞介素（IL）-17A已被证明会导致微血管稀疏化6,7。这提示慢性神经炎症可能通过影响脑血管系统而在HIV相关性神经认知功能障碍（HAND）的发病机制中发挥作用。为了进一步探讨这一问题，我们建立了定量分析脑血管结构的方法。

本文介绍了一种用于定量分析毛细血管节点数量、毛细血管节段数量、平均节段长度、节段总长度、平均毛细血管直径以及毛细血管总体积的方法 体内 通过薄颅骨皮层窗口对毛细血管网络进行成像（基于先前描述的方案修改）8,9以及 离体 使用双光子显微镜对脑组织切片进行成像。该联合方法可对脑血管参数进行整体定量，因为 体内 薄颅骨皮层窗可保留大脑环境的完整性，同时 离体 脑切片中毛细血管网络的成像可实现完整三维毛细血管网络的重建，随后可利用市售软件对这些网络进行定量分析。

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方案

罗切斯特大学动物资源委员会批准了本文中进行的所有操作程序。

1. 术前准备（及小鼠）

  1. 准备手术区域并备齐所有所需设备。使用70%乙醇对术中使用的所有工具进行预先灭菌。可选择使用玻璃珠灭菌器或高压灭菌器对工具进行灭菌。
  2. 将小鼠放入连接异氟烷蒸发器的异氟烷诱导室中。将异氟烷浓度设定为4%，流速为1 L/min。
    注意：本研究中所报告的实验采用由星形胶质细胞特异性胶质纤维酸性蛋白（GFAP）启动子驱动的强力霉素（DOX）可诱导HIV-1 Tat转基因小鼠（HIV Tat-Tg小鼠）10，以检测HIV-1诱导的神经炎症对脑血管结构的影响，方法如先前所述7,10。
  3. 轻轻倾斜诱导室以观察小鼠的翻正反射。当翻正反射被抑制后，将异氟烷浓度调至2%，并将气流从诱导室转移至手术台上的鼻罩。
  4. 迅速将小鼠从诱导室转移至注水加热垫上。通过鼻罩持续给予异氟烷（1.5–2%）。根据通过呼吸频率（RR）监测评估的个体小鼠耐受性调整麻醉深度。
    注意：呼吸频率降低可能干扰生理气体参数，从而影响脑血流和血管直径的评估。应尽量将呼吸频率维持在每分钟55–65次。心率（HR）也可用于评估麻醉深度；应将心率维持在每分钟300–450次，以防止血管直径发生生理变化。通常情况下，对于特定小鼠，在1 L/min流速下使用1.5–2.0%异氟烷即可达到充分麻醉。
  5. 进行足趾夹捏以进一步检查麻醉深度。若小鼠无反应，则开始手术操作。

2. 薄颅骨颅窗的制备

  1. 将人工泪凝胶涂抹于小鼠眼部。使用剪刀或电动剃刀彻底去除小鼠头皮上的毛发。
  2. 用聚维酮碘溶液对头皮进行消毒，并使其自然干燥。随后在体视显微镜下剥离小鼠头皮皮肤，完全暴露顶骨、尾侧额骨及人字缝标记。
  3. 在颅骨上施加少量10%氯化铁溶液，以干燥脑膜便于去除。使用#5/45镊子轻轻刮除已干燥的脑膜。
  4. 在头固定板窗口周围涂上一层薄胶。轻柔地将头固定板压在小鼠颅骨上，确保目标区域位于窗口中央。在头固定板上滴加一滴牙科水泥，以促进胶水聚合。
  5. 沿头固定板窗口边缘涂一层薄胶，形成用于盛放生理盐水的储液区。待胶水干燥后，将头固定板拧入小鼠头固定板固定装置。
    注意：本实验中使用的小鼠头固定板固定装置由金属底座和两根金属柱组成，每根金属柱上装有一个弹簧和一个翼形螺母。头固定板置于弹簧上方，旋紧翼形螺母直至头部保持水平且无移动。
  6. 使用连接在微型扭矩钻上的钻头（转速设定为6,000 rpm）清除头固定板窗口上的多余胶水。每隔10–15秒暂停一次 ，以防止小鼠颅骨过热，避免血管结构受损。
    1. 更换新的钻头，将微型扭矩钻置于中线外侧1.5 mm处（约为头固定板窗口直径的三分之一）。以4,000 rpm的转速开始对该区域颅骨进行减薄处理。轻柔地在颅骨表面移动钻头，避免施加垂直向下的压力。
    2. 每隔10–15秒停止钻磨 ，防止颅骨过热。在此期间，使用压缩空气罐清除积聚的骨屑。
    3. 滴加室温生理盐水冷却颅骨5–10秒。用柔软的组织轻轻吸除所有液体后，继续进行颅骨减薄操作。
  7. 进行颅骨最终减薄时，在头固定板储液区中加入少量生理盐水，并用牙科微型刀片轻柔扫过目标区域，直至细小血管清晰可见。

3. 生理参数的监测

  1. 当颅骨完全变薄后，将小鼠从固定器上取下并置于仰卧位。用胶带轻轻固定住两只后肢，以充分暴露内侧大腿区域。
  2. 使用剪刀或电动剃须刀去除双侧内侧大腿区域的毛发。用聚维酮碘覆盖大腿部位，对术区进行消毒。
  3. 使用#5镊子夹住右侧大腿内侧股静脉和股动脉上方的皮肤，轻轻向上提起，然后用剪刀剪开并移除皮肤。
    注意：左侧大腿保留，以备手术出现并发症（如血管异常、血管破裂）时使用。
  4. 在手术区域滴加约3–5滴0.9%生理盐水。这有助于更清晰地放大观察血管，同时保持术区湿润，防止血管干燥。使用两把#5/45镊子钝性分离股神经血管束，以分离股静脉与股动脉。
  5. 在股动脉下方放置两段长约3 cm的外科缝线，两段缝线相距约1 cm。将上方缝线顺时针扭转，形成血管止血带，以帮助在插管过程中减少出血。
  6. 使用弹簧剪刀在股动脉上做一个小切口。通过切口将导管插入动脉，并推进至导管在动脉内稳固固定。
  7. 松开上方缝线（止血带），检查是否有渗漏以及导管位置是否正确。使用缝线在血管内围绕导管打两个结，将导管牢固固定于股动脉中。
  8. 通过导管注入10 µl肝素（100 IU/ml），以防止血液凝固。随后，使用4-0缝线以单纯间断缝合方式缝合右侧大腿皮肤，完成外科闭合。
  9. 在右下腹象限腹腔内注射50 µl乌拉坦（1.2 mg/g）。五分钟后，在左下腹象限再次注射50 µl，总计腹腔注射乌拉坦100 µl。同时逐步缓慢降低异氟烷浓度至约0.25%，并同步重新评估小鼠麻醉深度。
    注意：针头应保持在腹膜腔浅层，紧贴后腹壁，避免穿破肠道。可通过捏起腹直肌使其远离内脏后进行注射来实现。
  10. 使用毛细管从导管中采集40 µl动脉血样本。将导管连接至装有生理盐水填充的四通旋塞阀和肝素填充注射器的血压换能器。
  11. 将血压换能器用胶带固定在手术装置上，以防止导管意外脱出。开始监测平均动脉压。
  12. 将含有血液的毛细管插入血气分析仪的进样口。待血液完全吸入后，将毛细管从进样口取出。O2和CO2的血气水平将由血气分析仪打印在纸带上显示。

4. 荧光染料的注射

  1. 使用 #5 镊子夹住左侧大腿内侧的皮肤。轻轻向上拉起皮肤，并用剪刀剪除皮肤。准备右旋糖酐偶联的红色发射罗丹明染料（70 kDa）（10 mg/kg，溶于生理盐水）。
  2. 定位股静脉。使用带有 30 G 针头的 1 ml 注射器，吸取先前配制好的适合成像的荧光染料至注射器的 130 µl 刻度线处。通过将染料完全吸入注射器并用力轻弹注射器壁，去除所有气泡。
    1. 将 30 G 针头的斜面朝上，压在硬质表面上，使其弯曲成约 30 度角。用染料充满针头，并弃去多余液体，保留 100 µl 样品。
  3. 将 100 µl 染料缓慢注入股静脉。拔出针头后，对注射部位施加稳定而轻柔的压力以止血。让染料循环 5 分钟。
    注意：也可选择右侧股静脉进行荧光染料注射，以避免因创建另一个手术部位而导致进一步失血。此外，如果动物手术部位出血无法控制，可能表明为冲洗导管而给予的肝素过多。如果在 10–15 分钟内 无凝血迹象且小鼠仍在出血，应考虑使用新的小鼠重新开始实验。
  4. 用 4-0 缝线缝合左侧大腿皮肤，然后小心地将小鼠翻转至俯卧位，并将其放入小鼠头部固定板背带中。

5. 在体 内 双光子成像

  1. 将手术装置移至双光子显微镜下，确保持续维持麻醉水平。向头固定板的储液槽中加入少量0.9%生理盐水，并降低显微镜物镜，使其与生理盐水接触。使用明场观察物镜定位目标区域
  2. 将双光子激光激发波长设置为适合荧光染料的波长。使用25倍物镜开始双光子成像。
    本实验中采用与红色发射罗丹明染料偶联的葡聚糖，激发波长为780 nm。使用607/36带通发射滤光片检测染料的荧光信号，使用480/20带通发射滤光片检测动脉自发荧光
  3. 在视野屏幕上定位一个毛细血管床，并使用2倍光学变焦放大该区域。利用双光子成像软件采集毛细血管图像
  4. 成像完成后，通过颈椎脱位并随后断头处死小鼠

6. 离体 双光子成像

  1. 使用超细剪刀，从鼠头的顶间骨至额骨处沿头皮做一切口。用拇指和食指将皮肤固定于颅骨两侧。
  2. 将超细剪刀置于中线顶间骨下方，沿矢状缝剪开颅骨，至前囟标记后约 3 mm 处停止剪切。
    注意：剪开颅骨时应施加向上压力，以防损伤脑组织。
  3. 使用 #5 镊子将颅骨与脑组织分离，并小心清除脑表面残留的脑膜。残留脑膜可能意外撕裂脑组织，需格外小心避免。将 #5 镊子轻轻插入脑组织下方，缓慢向前推进，直至脑组织完全脱离颅骨。
    注意：操作时应使用向下压力，以避免刺穿脑组织。
  4. 将脑组织置于专用于小鼠的脑切片工具中。通过在脑组织上滴加人工脑脊液进行清洗。
  5. 从前囟 0 至前囟 -2 处切下一块 2 mm 厚的冠状脑片。将该冠状切片置于含有人工脑脊液的凹面玻片上，确保前囟 0（切片最颅侧部分）朝上。轻轻盖上盖玻片，覆盖脑片。
    注意：盖上盖玻片后避免施加压力，以免变形血管结构。
  6. 将玻片转移至显微镜载物台，并在盖玻片上滴加少量 0.9% 生理盐水。降低显微镜物镜直至接触生理盐水。使用明场物镜定位脑中线。
  7. 开始双光子成像，并使用 25× 物镜再次定位中线。可通过观察冠状切片皮层表面的纵裂来确定中线位置。将成像画面的右侧边缘对准中线，再将视图画面水平向外移动三个完整视野（约距中线 1.5 mm）。
    注意：本实验中的成像参数与第 5.2 步注释中所述参数相同。
  8. 在视野屏幕上找到毛细血管刚好可见的深度。再将焦平面额外降低 20 µm，以确定 z 轴堆栈的顶部位置。
  9. 将图像厚度设为 1 µm。将视野屏幕降低 100 µm，并在过程中持续调节激光功率，使过饱和像素少于 1%。
    注意：z 轴堆栈图像由一系列连续的 100 张 500×500×1 µm 图像组成。z 轴堆栈越大，后续处理计算结果越准确。通常应尽量采集 100 µm 或更大的 z 轴堆栈。
  10. 先点击 XY Repeat 图标，再点击相邻的 XY 图标。完成 z 轴堆栈采集后，点击 Series Done 图标并保存文件。

7. 数据处理

  1. 在 ImageJ 软件中打开一个 in vivo 毛细血管图像。根据双光子软件获得的数值，手动设置像素与距离的比例。
    1. 从工具菜单中选择 *直线* 图标。绘制一条从一条毛细血管壁延伸到对侧毛细血管壁的线段，并记录 ImageJ 提供的长度。
      注意：可能需要放大图像，以便清晰地观察毛细血管壁的边缘。
    2. 在毛细血管的不同位置重复步骤 7.1.1，并对图像中的多个毛细血管进行相同操作。
  2. 将 z-stack 文件导入分析软件（例如 Amira）。从子应用程序工具栏中选择 Filament Editor 图标
    1. 将视图厚度设置为约 20。将视图移动至 z-stack 的顶部或底部。
    2. 选择 Trace 图标，并将光标移至加载的图像上。在 图 2C 所示位置的毛细血管上放置节点；相邻节点之间将自动生成线段。在整个 z-stack 范围内追踪毛细血管。
      注意：为了在整个 z-stack 中完成毛细血管的追踪，必须在端点和分支点之间放置节点。
    3. 如需删除这些中间节点，请点击 Remove Intermediate 图标。
      注意：此操作可能产生错误的环状线段，需使用 Select Single 图标选中环状结构，然后点击 Remove Selected 图标手动删除。如果在相同区域反复出现环状结构，则可能是将节点放置在了不同的毛细血管上。
    4. 完成追踪后，选择 Graph Info 图标，以打开包含自动提取的血管参数的电子表格。节点和线段的数量可在主视图界面中查看。

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结果

薄颅骨皮层窗可用于体内双光子成像观察皮层毛细血管（图1）。理想的成像区域应显示大量清晰可辨的毛细血管（图1A）。在同一视野中，不应出现动脉细胞壁的自发荧光，但可能存在其他荧光信号，例如由二次谐波产生诱导的胶原蛋白荧光11（图1B）。

脑切片制备完成后，定位距离中线约1.5 mm的成像区域（图2A）。 A 100 µm z-stack 生成三维图像，用于 Amira 分析软件中的分析图2B）。然后通过在毛细血管的起始端和末端，或任何一支毛细血管分出另一支的位置手动放置节点来追踪毛细血管网络图2C）。由此生成一个完全骨架化的图像，并从中自动提取形态学参数（图2D）。可通过双光子显微技...

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讨论

本文所述方法可应用于多种实验模型和条件下的脑微血管结构分析。要成功实施该方法，必须掌握三个关键步骤。首先，薄颅窗的制备不得损伤颅骨或其下方的脑组织。在颅骨减薄过程中容易造成穿孔，或因产热导致血管渗漏。这会干扰成像效果，因为荧光染料可能渗入焦平面，从而遮蔽毛细血管。如果在制备薄颅窗时频繁发生颅骨破裂，最可能的原因是向下的压力过大。将微型扭矩钻持握位置尽量靠近钻头，可获得更好的触觉控制，从而减小对颅骨的下压力度。

其次，一旦动脉被切开，应尽快进行动脉插管。若未能迅速插入导管，可能导致大量失血，从而影响小鼠的生理完整性。插管困难通常是由于导管相对股动脉而言尺寸偏大所致。此时可能需要拉伸导管以减小其直径。此外，可使用#5镊子的尖端夹住并扩大动脉切口，以方便导管插入。

第三，应尽量缩短体内手术操作的持续时间，以便尽快给予乌拉坦麻醉。异氟烷麻醉可引起脑血管扩张13，从而导致毛细血管直径数据产生偏差。

需要指出的是，Amira 分析软件能够自动提...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢罗切斯特大学多光子核心实验室的 Maria Jepson、Paivi Jordan 博士和 Linda Callahan 博士在整个方案完成过程中提供的技术指导。我们还感谢 Changyong Feng 博士在统计学方面的专业建议，以及罗切斯特大学医学中心 Maiken Nedergaard 博士提供的本文所使用头固定板的设计。本研究部分得到了美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 T32GM007356 和 R01DA026325 的支持；同时也得到了罗切斯特大学艾滋病研究中心资助项目 P30AI078498（NIH）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Leica 显微镜Leica 公司MZ8
高亮度照明器Dolan-Jenner180
加热垫Stryker TP3E
T/PUMPGaymar 工业公司TP-500
TEC-4 异氟烷蒸发器Datex Ohmeda447
人工泪液凝胶Butler AHS7312
聚维酮碘溶液 Aplicare52380-1855-9
超精细 Bonn 剪刀精细科学工具公司14084-08
Dumont #5 镊子精细科学工具公司11295-10
Dumont #5/45 镊子精细科学工具公司11251-35
氯化铁溶液Ricca 化学公司3120-16
Loctite 454 Prism 瞬干胶凝胶汉高公司45404
牙科水泥Stoelting51459
Microtorque II 手柄套件Pearson 牙科公司R14-0002
微型钻头用 005 钻头精细科学工具公司19007-05
Norland 刀片（牙科微刀片）Salvin 牙科公司6900
聚氨酯Sigma-AldrichU25002B 类致癌物
编织缝合线Ethicon735G
Vannas 弹簧剪刀精细科学工具公司15000-03
 动脉导管SAI 输注技术公司MAC-01导管末端经手动拉伸以减小其直径。 
血压监测仪世界精密仪器公司SYS-BP1
血压换能器及电缆世界精密仪器公司BLPR2
RAPIDLab 血气分析仪 西门子公司 248
40 μl 毛细管VWR15401-413
德克萨斯红-葡聚糖（70,000 分子量，10 mg/kg 溶于生理盐水）InvitrogenD-1830
成年小鼠脑切片矩阵Zivic 仪器公司BSMAS001-1
Olympus Fluoview 1000 AOM-MPM 多光子显微镜OlympusFV-1000 MPE
MaiTai HP DeepSee 钛蓝宝石激光器Spectra-Physics
ImageJ 软件美国国立卫生研究院（NIH）可从 http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html 获取
Amira 软件Visage Imaging 

参考文献

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