本文介绍了一种通过特异性siRNA介导的mRNA耗竭，随后进行免疫荧光分析，以评估小鼠卵母细胞中减数分裂纺锤体组装与结构的实验方案。该方案适用于 体外 卵母细胞中不同纺锤体和/或微管组织中心相关因子的转录本耗竭及其功能评估
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摘要
摘要
配子减数分裂过程中染色体分离的错误可导致非整倍体，受精后会将这种异常传递给胚胎。发育中胚胎出现的非整倍体现象被认为是妊娠丢失和先天性出生缺陷（如唐氏综合征）的主要原因。染色体的准确分离在很大程度上依赖于微管纺锤体结构的形成，然而该过程在哺乳动物卵母细胞中仍知之甚少。引人注目的是，减数分裂纺锤体的组装机制不同于有丝分裂，并且至少部分受到独特的微管组织中心（MTOC）调控。对MTOC相关蛋白的评估可为调控减数分裂纺锤体形成与组织的分子机制提供重要见解。本文中，我们描述了分离小鼠卵母细胞并利用siRNA介导的方法耗竭MTOC相关蛋白以检测其功能的技术流程。此外，我们还介绍了卵母细胞固定及免疫荧光分析的实验条件，用于评估减数分裂纺锤体的形成与组织状态。
引言
减数分裂是一种独特的分裂过程，发生在配子（卵母细胞和精子）中，包括两次连续的分裂，其间不发生DNA合成，分别在减数分裂I和减数分裂II中分离同源染色体和姐妹染色单体1。卵母细胞减数分裂过程中染色体分离错误可导致非整倍体，这种异常会在受精时遗传给胚胎。值得注意的是，随着母亲年龄的增长，发育中胚胎的非整倍体发生率增加，这是女性先天性出生缺陷和妊娠丢失的主要原因1,2，因此凸显了深入理解减数分裂过程中非整倍体分子基础的重要需求。
细胞分裂过程中，染色体的正确分离高度依赖于微管纺锤体结构的组装以及染色体与微管之间稳定相互作用的建立，以确保染色体正确连接至纺锤体的两极。重要的是，哺乳动物卵母细胞中的减数分裂纺锤体形成不同于体细胞的有丝分裂，其由缺乏中心粒的独特微管组织中心（MTOC）所调控3,4。对于微管成核和组织至关重要的蛋白质定位于卵母细胞的MTOC，其中包括催化微管组装的γ-微管蛋白。此外，pericentrin作为一种关键的支架蛋白，在MTOC处结合并锚定γ-微管蛋白及其他相关因子5。值得注意的是，我们的研究表明，关键MTOC相关蛋白的缺失会破坏卵母细胞中减数分裂纺锤体的正常组织，并导致染色体分离错误，而此类错误无法被纺锤体组装检验点（SAC）完全识别和纠正6,7。因此，那些不足以触发减数分裂阻滞的纺锤体稳定性缺陷，仍会显著增加非整倍体发生的风险。尽管MTOC在纺锤体组装与组织中具有关键作用，但卵母细胞MTOC的蛋白质组成及其功能仍知之甚少。
在哺乳动物卵母细胞中检测特定靶蛋白功能具有挑战性，因为这些细胞在减数分裂恢复前不久即进入转录静止状态8,9。因此，排卵前的卵母细胞依赖母源性mRNA储存来恢复减数分裂，并支持减数分裂以及受精后的首次卵裂分裂10,11。RNA干扰（RNAi）介导的mRNA转录本降解在哺乳动物卵母细胞中的有效性已得到充分证实，且在减数成熟过程中被招募进行翻译的母源RNA特别易于被siRNA靶向12-14。因此，将短干扰RNA（siRNA）显微注射至卵母细胞中，为耗竭靶mRNA以进行功能检测提供了一种有效的方法。
本文介绍了分离小鼠卵母细胞以及利用siRNA介导的转录本敲低技术来检测中心体周围蛋白（pericentrin）这一关键MTOC相关蛋白功能的方法。此外，还描述了用于评估卵母细胞中减数分裂纺锤体形成的免疫荧光分析条件。
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方案
本方案已获得乔治亚大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）的批准。
1. 准备工作
- 进行卵母细胞培养时，购买或新鲜配制最低必需培养基（MEM），并按照表1所述添加3 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）。将一个聚苯乙烯瓶置于电子天平上（去皮归零），按顺序加入除BSA外的所有试剂，并通过称重用MQ水定容至总重量250 g。随后加入BSA，待其完全溶解后过滤除菌。
注意：上述MEM培养基需在含5% CO2、5% O2和90% N2的医用气体混合物环境中平衡，并用于细胞培养。然而，也可使用其他培养基（例如 CZB），可在大气条件下以5% CO2进行细胞培养。 - 进行卵母细胞显微注射时，购买或配制M2培养基。
- 将孕马血清促性腺激素（PMSG）配制为5 IU/100 µl的浓度。
- 购买siRNA原液并重悬至1 µM的工作浓度。
2. 小鼠卵母细胞的收集
- 第1天： 为促进卵巢卵泡发育并增加排卵前卵泡数量，在采集卵母细胞前48小时，对雌性小鼠腹腔注射5 IU的PMSG。
- 第3天： 用于卵母细胞采集和培养，准备35 mm培养皿，每皿加入3 ml添加了MEM/BSA的培养基，并补充 1 µg/ml 米力农。这种磷酸二酯酶抑制剂可使卵母细胞维持在第一次减数分裂前期停滞状态，并防止生发泡破裂（GVBD）。将培养皿置于医用气体混合物中平衡至少15分钟。
注意：在整个卵母细胞采集、卵母细胞显微注射以及siRNA处理后的24小时培养静置期间，均需使用添加米力农的培养基。 - 使用标准的实验室操作技术从小鼠雌鼠中取出卵巢15 转移至含有预热并平衡过的 MEM/BSA/米力农的新培养皿中。
- 将培养皿置于体视显微镜载物台上用于采集卵母细胞。使用27 G针头手动穿刺窦状卵泡，释放卵丘-卵母细胞复合体（COCs）。用连接1 ml注射器的27 G针头将一侧卵巢固定于培养皿底部，再用另一根针头穿刺所有较大的卵泡。每侧卵巢均重复此操作。
- 采用标准的口吸管操作程序或其他卵母细胞吸取方法，收集所有被两层或更多层致密卵丘细胞包围的卵母细胞。将卵丘-卵母细胞复合体（COCs）转移至新的培养皿中，并在以下条件下孵育 37 °C 1小时。
- 用设置为吸取体积的1 ml移液器反复轻柔吹打，仔细去除周围的卵丘细胞 750 µl重复吹打约12次，使卵母细胞恢复5分钟。以此方式继续操作，直至所有或大部分卵丘细胞被去除。将去卵丘细胞的卵母细胞转移至另一培养皿中，并于培养条件下平衡 37 °C 15分钟。
- 将去核卵母细胞分配至三个实验组，分别用于：(i) 显微注射针对目标分子的特异性siRNA，(ii) 显微注射非特异性（对照）siRNA，以及(iii) 不进行注射的对照组，以排除培养条件的影响。
3. 卵母细胞显微注射
- 为卵母细胞显微注射准备培养皿，每皿加入含 milrinone（1 µg/ml）的 3 ml M2 培养基。另准备含有 MEM/BSA/milrinone 的培养皿，用于注射后卵母细胞的洗涤和后续培养。
注意：M2 培养基含有 HEPES 缓冲液，需在常压条件下于 37 °C 预热 15 分钟。MEM 培养基需如上所述，使用医用气体进行预热和平衡。 - 准备显微注射系统。将注射针头吸入 5 µl 浓度为 1 µM 的特异性 siRNA 溶液。将持卵毛细管和注射针头固定在显微操作仪上，并校准注射装置的体积和压力。
- 在 3 cm 培养皿的皿盖内侧放置一滴 200 µl 的 M2 培养基微滴，并放入一个卵母细胞，用于显微注射系统的设置与校准。
- 以卵母细胞为参考，调整持卵毛细管和注射针头的位置。对持卵毛细管施加负压，轻柔固定卵母细胞，并将注射针头调整至细胞最大直径处。调节参数，使 siRNA 溶液的注射体积约为 10 pl，可注入卵母细胞胞质的任意位置。
图 1. 卵母细胞显微注射装置。 （A）在 3 cm 培养皿的皿盖内侧放置一滴 200 µl 的 M2 培养基微滴的代表性图像，持卵毛细管位于左侧，注射针头位于右侧。 （B）显微注射前处于第一次减数分裂前期停滞状态（GV 期）的一组卵母细胞。 请点击此处查看该图的放大版本。
- 将皿盖放回体视显微镜载物台上，并加入一滴 200 µl 的新鲜 M2 培养基。通过口吸管或其他方法将一组卵母细胞（约 10 个）加入微滴中，然后将含微滴的皿盖放回显微注射平台。
- 开始对单个卵母细胞进行显微注射。用持卵毛细管固定一个卵母细胞，缓慢将注射针头尖端插入胞质，注入设定体积的 siRNA 溶液。小心撤回注射针头，并将已注射的卵母细胞移至微滴底部。将注射失败的卵母细胞移至微滴顶部。
- 对每个卵母细胞重复上述显微注射操作。为保持卵母细胞最佳活力，每次仅注射少量卵母细胞。确保整个过程不超过几分钟，以避免微滴内温度和 pH 值的变化。
- 吸取成功注射的卵母细胞，或小心地将含有注射后卵母细胞微滴的皿盖转移至体视显微镜下。通过口吸管或其他方法将注射后存活的卵母细胞转移至 MEM/BSA/milrinone 培养基中，于 37 °C 洗涤并平衡。
- 使用另一组卵母细胞，更换装有非特异性 siRNA 的新注射针头，重复上述显微注射过程，作为对照组。将这些卵母细胞在 MEM/BSA/milrinone 中洗涤后，转移至另一独立的培养皿中。
- 将所有组别的卵母细胞在 37 °C、医用气体氛围条件下，于 MEM/BSA/milrinone 培养基中培养 24 小时。
注意：“milrinone 阻滞”培养期对于有效降低靶标 mRNA/蛋白水平是必需的。
4. 卵母细胞培养以进行减数分裂成熟
- 第4天：为每个实验组的卵母细胞准备4个培养皿（35 mm），每皿加入3 ml MEM/BSA培养基。每组中取一个培养皿，添加10%（高质量）胎牛血清（FBS），用于卵母细胞成熟。将所有培养皿置于37 °C条件下，用医用混合气体平衡。
- 为解除“米力农阻滞”并释放卵母细胞，依次将卵母细胞在含有MEM/BSA的培养皿中洗涤三次，然后转移至含10% FBS培养基的成熟培养皿中。将所有卵母细胞组在37 °C下培养17小时，以促进减数分裂的恢复和进程。
- 第5天：准备卵母细胞固定溶液，包括：(i) 含0.5% Triton-X 100的PEM缓冲液（100 mM PIPES [pH 6.9]，1 mM MgCl2，1 mM EGTA）中配制的4%多聚甲醛（PFA）；(ii) 添加5% FBS的PBS溶液，用于洗涤和封闭卵母细胞。
注意：这些溶液在用于卵母细胞固定前需预热至37 °C。 - 在完成17小时培养后，立即通过口吸管或其他方法将每组实验用卵母细胞快速转移至4孔板的各个孔中，每孔含750 µl预热的4% PFA溶液，并在37 °C孵育1小时。随后，用750 µl预热的含5% FBS的PBS溶液对每组卵母细胞进行3次洗涤，每次15分钟。
- 将卵母细胞在200 µl PBS/5% FBS中于4 °C过夜封闭，以最大限度减少非特异性抗体结合。
5. 免疫荧光分析
- 第6天：
注意：免疫染色在多孔板中进行，卵母细胞依次转移至含有相应抗体和洗涤液的不同孔中。可使用48孔或96孔板，根据孔的大小调整溶液体积。对于96孔板，每孔使用200 µl。卵母细胞按以下顺序转移至不同溶液：一抗溶液 → 3次洗涤孔 → 二抗溶液 → 3次洗涤孔。为减少光照暴露，可用铝箔覆盖多孔板。
配制新鲜的PBS/5% FBS溶液，并用该溶液稀释抗体（例如，兔抗pericentrin（1/1,000）、鼠抗tubulin（1/1,000））。 - 将各实验组固定的卵母细胞转移至分别含有200 µl（或根据需要减少至100 µl）一抗溶液的孔中，并用封口膜覆盖孔。根据各抗体最适条件进行孵育（例如，37 °C孵育1小时，或4 °C过夜孵育）。
注意：一抗的稀释比例、孵育时间及温度需通过实验优化，以确定不同抗体的最佳条件。 - 一抗孵育结束后，用PBS/5% FBS溶液洗涤卵母细胞三次，每次10–15分钟。
- 将卵母细胞转移至含荧光标记二抗的溶液中（例如，以不同波长荧光染料标记的抗兔和抗鼠二抗，稀释比例为1/1,000），在37 °C孵育1小时。
- 用PBS/5% FBS溶液洗涤卵母细胞三次，每次10–15分钟。
- 最后一次洗涤后，将卵母细胞转移至洁净的载玻片上，轻轻吸去多余的洗涤液，使卵母细胞固定在玻片表面。加入8 µl封片剂（含DAPI），然后小心覆盖22 mm × 22 mm的盖玻片。缓慢放下盖玻片，避免产生气泡或损伤卵母细胞。
注意：若需在共聚焦显微镜分析中保持卵母细胞的三维结构，可在盖玻片四角预先加入少量混有石蜡油的100 µm玻璃珠，再将其封片于载玻片上。 - 将载玻片储存于4 °C，或立即进行减数分裂进程评估，以及利用配备相应滤光片的荧光显微镜分析蛋白表达水平和亚细胞定位。
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结果
将siRNA显微注射到卵母细胞中，可有效降解mRNA并导致相应蛋白质的耗竭，从而实现对不同靶因子进行高效且高度特异的功能检测 in vitro。随后，通过免疫荧光染色对siRNA注射卵母细胞中的特定表型进行分析，并验证蛋白质的耗竭效果。在本示例中，利用DAPI对单个卵母细胞进行荧光标记，并结合抗微管蛋白（anti-tubulin）和抗中心粒周围蛋白（anti-pericentrin）抗体，实现了：（i）确认中心粒周围蛋白（pericentrin）的耗竭；以及（ii）对对照组和PCNT-耗竭卵母细胞中染色质和减数分裂纺锤体构型的全面评估。
在图27中展示了显微注射非特异性对照或Pcnt siRNA的卵母细胞的代表性免疫荧光图像。经过17小时培养后，大多数对照组卵母细胞发育至减数分裂II期，其纺锤体结构有序，染色体排列整齐，且在纺锤体两极可见明亮的中心粒周围蛋白（pericentrin）标记信号（图2A）。值得注意的是，在注射Pcnt<...
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讨论
尽管存在多种将外源核酸导入体细胞的方法，例如电穿孔和转染，显微注射仍是将RNA分子递送至转录静息态小鼠卵母细胞的最优方法。本方案提供了一种有效的操作流程 体外 通过耗竭特定mRNA，可对卵母细胞中与纺锤体和/或微管组织中心（MTOC）相关因子进行功能测试。该方法可实现高效的转录本耗竭，且具有高度可适性。尽管本研究使用siRNA特异性靶向 Pcnt 转录本，类似条件可用于靶向几乎所有目的基因。
该方案的多个环节，包括卵母细胞的收集、培养和操作，均需经过练习和积累经验，以维持卵母细胞质量并避免技术性假象。操作过程中应迅速而谨慎，避免培养基pH值和/或温度发生波动。对少量卵母细胞进行显微注射，并使用配备加热载物台的显微注射系统，有助于减少不利的温度变化。建议使用预先验证过的siRNA，且高效的靶蛋白敲低效果需通过免疫荧光或Western blotting加以确认。针对不同的目的基因，部分步骤可能需要调整。例如，在含米力农的培养基中推荐采用24小时的“维持期”，该时长适用于多种siRNA。然而，对于丰度较高的mRNA和/或半衰期特别长的靶蛋白，该时间可能...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
本研究部分得到了佐治亚大学以及美国国立卫生研究院向 MMV 提供的基金（HD071330）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 孕马血清促性腺激素（PMSG） | EMD Biosciences | 367222 | |
| 最低必需培养基（MEM） | *配方见表1 | ||
| Earle's 平衡盐溶液（10倍浓度） | Sigma | E-7510 | |
| 碳酸氢钠 | Sigma | S-5761 | |
| 丙酮酸钠盐 | Sigma | P-5280 | |
| 青霉素G钾盐 | Sigma | P-7794 | |
| 硫酸链霉素 | Sigma | S-9137 | |
| L-谷氨酰胺 | Sigma | G-8540 | |
| EDTA二钠盐二水合物 | Sigma | E-4884 | |
| 必需氨基酸（50倍浓度） | Gibco | 11130-051 | |
| MEM维生素混合物（100倍浓度） | Sigma | M-6895 | |
| 酚红溶液 | Sigma | P-0290 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma | A1470 | |
| 米力农 | Sigma | M4659 | |
| 胎牛血清（FBS） | Hyclone | SH30070.01 | |
| 含 Hepes 的 EmbryoMax M2 培养基 | EMD Millipore | MR-015-D | |
| 靶向 Pericentrin 的 siRNA | Qiagen | GS18541 | |
| 阴性对照 siRNA | Qiagen | SI03650318 | |
| 多聚甲醛（16% 溶液） | Electron Microscopy Sciences | 15710 | |
| Triton-X | Sigma | T-8787 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Hyclone | SH30028.02 | |
| 抗 Pericentrin 抗体（兔源） | Covance | PRB-432C | |
| 抗乙酰化 α-微管蛋白抗体（鼠源） | Sigma | T-6793 | |
| Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔抗体 | Invitrogen | A-21430 | |
| Alexa Fluor 555 标记山羊抗鼠抗体 | Invitrogen | A-11017 | |
| 主要设备 | |||
| 体视显微镜（SMZ 800） | Nikon | ||
| 正置荧光显微镜 | Leica Microsystems | ||
| 倒置显微镜 | Nikon | ||
| Femtojet 显微注射系统 | Eppenforf | ||
| 显微操作器 | Eppendorf | ||
| 显微注射针（femtotips） | Eppendorf | 930000035 | |
| 持卵管（VacuTip） | Eppendorf | 930001015 | |
| 塑料器皿 | |||
| 35 mm 培养皿 | Corning Life Sciences | 351008 | |
| 4 孔板 | Thermo Scientific | 176740 | |
| 96 孔板 | Corning Life Sciences | 3367 | |
| 0.45 mm CA 滤器系统 | Corning Life Sciences | 430768 |
参考文献
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重印与许可
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