一种仿生呼吸肺泡细支气管微流控模型

摘要

采用软光刻技术制备了一种具有代表性的、真实比例的肺泡气道模型，该模型可周期性扩张与收缩，模拟生理呼吸运动。该平台可在芯片上重现呼吸性肺泡区的气流，有望促进对吸入气溶胶在肺泡区域内的动力学行为及沉积特性的实验研究。

摘要

量化肺部肺泡深处的呼吸气流特征及其对吸入气溶胶传输的影响，对于优化药物吸入技术以及预测潜在有毒空气颗粒在肺泡中的沉积模式至关重要。本文采用软光刻技术，在真实解剖尺度上制备出复杂的类肺泡气道结构，构建了一个光学可及的系统，可重现生理条件下的肺泡气流现象。该微流控装置包含5代具有周期性扩张与收缩管壁的分支肺泡化导管。通过调节充满水的腔室内部压力，从装置的侧面和顶部作用于薄PDMS肺泡通道壁，实现管壁的驱动。与常见的多层微流控装置（需堆叠多个PDMS模具）不同，本文提出一种简便方法：将注射器的筒体部分嵌入PDMS模具中，从而制备顶部腔室。这种新型微流控装置可实现生理呼吸运动，进而产生典型的肺泡气流。在本研究中，采用悬浮液态颗粒的显微粒子图像测速技术（µPIV），基于流体动力学相似性匹配原理，对上述气流进行量化分析。µPIV结果与预期肺泡气流现象的良好一致性表明，该微流控平台有望在不久的将来成为一种有吸引力的in vitro工具，用于直接研究肺部肺泡区域中代表性空气颗粒的传输与沉积行为。

引言

对肺部远端肺泡区域呼吸气流动力学进行详细量化，对于理解肺泡内的气流混合以及预测吸入气溶胶在最深部气道中的去向至关重要^1–3。在一方面涉及吸入污染物颗粒的危害，或另一方面寻求新型策略以改善药物在肺部特定部位的靶向递送时^{4, 5} ，乃至实现全身性给药，这一方面尤其值得关注。

迄今为止，肺部肺泡区域深处的呼吸气流通常通过计算流体动力学（CFD）进行in silico研究，或 alternatively 采用符合流体动力学相似性匹配的放大比例实验模型进行in vitro研究。在过去的几十年中，CFD 方法 increasingly 被应用于研究肺泡气流现象，从单个肺泡模型^{6, 7} 和肺泡化细支气管^8–12 ，发展到更为复杂的in silico模型，后者能够再现解剖结构真实的肺泡树，包含多代肺泡化细支气管以及多达数百个独立的肺泡^13–15。

综上所述，数值模拟研究在揭示呼吸过程中肺泡壁运动对肺泡内气流模式的影响方面发挥了关键作用。在无呼吸运动的情况下，静态肺泡腔内存在循环流动，这些流动在肺泡管与肺泡之间不产生任何对流性气体交换^{6, 7}；换句话说，肺泡内的气流将完全独立于肺泡树内的气流，气体交换仅通过扩散机制实现。然而，当肺泡区域发生周期性扩张时，肺泡内流场结构发生显著改变，肺泡内部的流动模式与肺泡在肺泡树中的位置密切相关（例如，近端与远端代次）。

特别是，已有模拟研究提出假设：肺泡内的流动模式在很大程度上受到肺泡与导管流速之比的影响。在肺泡树的近端分支中，由于树状结构的质量守恒作用，该比值相对较大，导致肺泡腔内出现复杂的回旋流动，并伴随不可逆的流体路径线。随着肺泡分支逐级深入，肺泡与导管流速之比逐渐减小，使得远端肺泡分支呈现出更接近径向的流线形态，类似于气球的简单膨胀与收缩过程。随着现代成像技术的进步，已获得包括大鼠和小鼠在内的啮齿类动物肺部成像数据^{16, 17} ，这些数据催生了首批基于解剖结构重建的肺泡中肺泡气流的计算流体动力学（CFD）模拟研究。尽管取得了令人鼓舞的进展，但这些近期研究仍局限于仅研究终末肺泡囊^{18, 19} 或单个导管周围少数几个肺泡的气流现象²⁰。因此，目前关于肺泡内呼吸气流现象的前沿研究仍主要集中在基于解剖结构启发的通用几何模型上²。

在实验方面，多年来已开发出多种包含一个或多个肺泡的气道装置^21–24。然而，目前尚无能够通过类似呼吸的扩张与收缩运动来模拟生理呼吸过程的分叉型肺泡化气道实验模型。由于缺乏理想的实验平台，关于肺泡区传输现象的研究在验证计算研究结果方面仍受到限制，更重要的是，目前可用的实验数据仍然十分匮乏。近年来，Ma et al.（2009）构建了一个放大的刚性壁肺泡结构模型，该模型包含三代肺泡单元；然而，由于该模型缺乏壁面运动，因而无法真实再现呼吸条件下肺泡内的实际流动模式。

最近引入了其他一些放大实验，包括基于铸型复制品解剖数据构建的移动壁模型²⁵；然而，由于该模型仅涵盖了最后两级肺泡管（i.e., 终末囊泡），未能捕捉到更近端肺泡管中典型的复杂回流流动。这些放大实验的实例进一步凸显了此类方法目前存在的局限性。具体而言，迄今为止尚无任何实验能够展示肺泡内从回流流动向径向流动的假想转变过程，因而无法验证数值模拟所预测的真实肺部肺泡树中可能存在的流型结构^{7, 15}。或许最为关键的是，由于难以匹配所有相关的无量纲参数（e.g.，颗粒扩散——这一亚微米颗粒的关键输运机制——在实验中被完全忽略），放大实验在研究吸入颗粒的输运与沉积动力学方面受到极大限制²⁶ 。

随着实验研究的不断推进，人们迫切需要新的实验平台，以实现对复杂运动壁肺泡网络中呼吸气流和颗粒动力学的探究。本文介绍一种基于解剖结构设计的 体外 引入了肺泡模型。该微流控平台在典型的肺泡尺度上直接模拟肺泡内的流动，并拓展了日益发展的肺微流控模型的应用范围²⁷，包括支气管液体栓塞流^28–30 肺泡-毛细血管屏障³¹.

具体而言，当前设计采用了一个简化的五代肺泡气道树结构，其管壁可周期性扩张和收缩。这种周期性运动通过控制环绕薄层聚二甲基硅氧烷（PDMS）侧壁的水室内的压力来实现，而顶部壁面的形变则由直接位于肺泡结构上方的另一个水室控制。与常见的多层微流控装置不同，该水室仅通过将注射器的筒状部分嵌入PDMS装置内部即可简单形成，无需额外制备PDMS模具。

与放大模型相比，本文介绍的微型化方法提供了一种简单且多功能的手段，可重现具有活动壁的复杂腺泡结构，同时捕捉腺泡气流环境的基本特征。该平台可用于气道内悬浮流体颗粒的流动可视化研究（见下文代表性结果）。在不久的将来，该模型将结合空气传播颗粒，用于研究吸入颗粒在腺泡内的动力学行为。

方案

1. 母版制作

1. 采用深反应离子刻蚀（DRIE）对绝缘体上硅（SOI）晶圆进行加工，以制备主硅晶圆，具体方法如先前研究^{32, 33}所述。
   注意：由于具有高深宽比的结构特征（40 µm 宽、90 µm 深的沟槽），优先选择 DRIE 而非标准的 SU-8 微加工工艺。

2. 微流控装置的浇铸与密封

1. 在洁净的小容器（如塑料称量皿）中，按10:1的质量比混合PDMS和固化剂。
2. 将混合物置于真空干燥器中脱气，直至所有气泡完全去除。
   注意：请准备足量的PDMS以供后续所有步骤使用。下文中，缩写 "PDMS" 始终指在步骤2.1和2.2中制备的已脱气的10:1 PDMS:固化剂混合物。
3. 将脱气后的混合物倒入模具中，使其高度比模板晶圆高出约1 mm。再次在真空干燥器中脱气至少40分钟，以去除晶圆上方的所有气泡，并尽量减少晶圆下方的气泡。
   注意：确保晶圆尽可能贴近容器底部。如有必要，可用两根搅拌棒轻轻将晶圆压至底部，并再次脱气。
4. 在自然对流烘箱中以65 °C加热固化20分钟。
   注意：20分钟后，PDMS已硬化并几乎完全固化。虽然可延长烘烤时间，但20分钟的烘烤已足够节省时间，并有利于提高第二层PDMS与第一层之间的粘附性（见下文）。
5. 使用细砂纸打磨塑料2 ml注射器筒身部分，以增强其与PDMS的粘附性。此外，将砂纸平铺于平整表面，将注射器筒底在其上滑动打磨，以使其底部平整。使用加压空气清洁注射器。
6. 将注射器筒身部分放置于第一层PDMS之上，使大口端朝向PDMS表面，并在第一层PDMS上再浇注一层约5 mm高的PDMS，然后再次在真空干燥器中进行脱气。
   注意：第二层PDMS应从注射器筒周围的小容器中浇注，不得流入筒体内部。 
7. 将整个装置在自然对流烘箱中以65 °C烘烤至少2小时。
   注意：在固化过程中无需固定注射器筒的位置，因为PDMS对筒体宽大底部的压力足以使其牢固固定。
8. 使用解剖刀沿模板晶圆的图案区域周围切割PDMS模具。切割时，刀尖应轻微接触晶圆表面。然后，将薄型工具（如晶圆镊子）轻轻插入解剖刀刻出的切口，将PDMS复制件从模板晶圆上剥离下来。
9. 将复制件图案面朝上放置于覆盖铝箔的柔软表面上（i.e., 注射器筒应悬垂于桌面边缘），并使用1 mm活检打孔器在PDMS的腔室入口和通道入口处打孔。 
10. 使用设定为3,000 rpm、持续30秒的旋涂仪，在洁净的载玻片上涂覆一层（已脱气）10:1 PDMS:固化剂混合物，并在65 °C下烘烤>1小时。随后，使用透明胶带清洁载玻片和PDMS复制件。
11. 使用O₂等离子体（e.g., 手持式电晕处理仪）对PDMS模具表面及涂有PDMS的玻璃载玻片表面处理1分钟，然后将两表面轻轻贴合，并在65 °C下过夜（O/N）烘烤。

3. 装置填充与驱动

1. 将悬浮于水中的荧光聚苯乙烯微粒与水和甘油在玻璃小瓶中混合，制备成体积比为64/36（v/v）的甘油/水混合液，其中微粒含量为0.25%（w/w）。
2. 在通道入口上方滴加一滴甘油溶液，在腔室入口上方滴加一滴去离子水，然后将装置放入干燥器中，抽真空约5分钟。
   注意：在释放真空之前，需等待甘油溶液和去离子水液滴中形成的气泡破裂。释放真空后，液体将被吸入装置内部的空腔中。如果通道内仍有残留空气，可通过对外部液体施加压力来排除残留空气。例如，使用注射器）并使空气扩散进入PDMS。
3. 向顶部腔室注入约 2 ml 去离子水（即， 注射器筒体 图 2b）直至完全充满水。然后用一个19号钝头注射器针头盖住上部腔室，将另一个19号钝头注射器针头的尖端剪下，并将其插入侧腔入口。通过细聚四氟乙烯管和T型连接器，将两个注射器针头连接至一个1 ml注射器。
   注意：确保1 ml注射器、聚四氟乙烯（Teflon）管、T型连接头和上腔室（2 ml注射器筒）均充满水且无气泡。可通过打开连接点，将水推过管路的空段，然后重新连接各连接点来实现。
4. 将1 ml注射器连接至已预编程的注射泵，以模拟例如安静状态下的潮式呼吸周期（周期为 T = 4 秒）由线性斜坡构成， 即，从0到1.8 ml/min在1秒内，从1.8 ml/min 在2秒内从-1.8 ml/min降至-1.8 ml/min，并在1秒内从-1.8 ml/min回升至0。

4. 流动可视化实验：微粒子图像测速技术（µPIV）

1. 在驱动装置的同时，使用微粒子图像测速系统（µPIV）获取9至12组相位锁定的双帧图像，以捕捉示踪粒子标记的流动情况。该系统可包含例如双帧多曝光CCD相机（例如，1,600 × 1,200像素，以获得足够分辨率）、双脉冲Nd-YAG激光器（波长：532 nm，输出能量：400 mJ，脉冲持续时间：4 nsec）以及倒置显微镜。
   注：此类系统能够获取帧对之间时间间隔低至几微秒的图像。为获得相位锁定的双帧图像，建议以例如10 Hz的频率采集双帧序列（帧对之间相隔0.1秒）。随后可对数据进行重组，使所有间隔为一个完整周期时间（此处T = 4秒）的帧对构成一个新的时间序列。应多次重复图像采集过程，同时调整每对帧中第一帧与第二帧之间的时间延迟（即，100 µsec至0.1 sec），以解析肺泡腔内不同区域的流动特征。
   注：针对此类微流动成像，亦存在其他可选配置，涉及图像采集系统（即，相机）与照明光源（即，激光器）的最佳组合方案^{34, 35}。
2. 采用互相关求和算法，基于每组不同时间延迟的图像序列，计算相应流场的相位锁定速度矢量图。通过多次改变每帧对中第一帧与第二帧之间的时间延迟，重复该过程，以解析肺泡腔内不同区域的流动。随后，利用数据分析程序将各个流场图拼接成完整的高分辨率流动模式图，通过对重叠数据点进行平均处理实现³³。

结果

计算机辅助设计（CAD）和显微镜图像的 体外 腺泡平台的相关内容如下所示 图1仿生腺泡模型具有五级分支的矩形通道，其内壁衬有类似肺泡的圆柱形腔隙（图1）。在此模型中，代数从第1代（最近端）到第5代（最远端）依次编号。需注意，仅有通向第1代的通道入口通过PDMS上的开口与外部环境相通。从第5代延伸出的16条导管均保持封闭，不与空气连通。图1a）。通过周期性调节腔室内的水压，构成肺泡腔和导管的薄壁会随之发生周期性形变。同时，通过位于导管上方的另一个水室对气道顶部施加垂直方向的形变；为了以简单方式构建顶部水室，而无需制备额外的微流控层，将注射器筒在PDMS交联前浸入其中。由此形成的PDMS层厚度约为1 mm，将肺泡化导管与顶部水室分隔开（见 图 2).

水室连接至一个注射泵，该注射泵被编程为重复一系列线性斜坡式流速，以模拟普通至深重潮式呼吸下平均成人的呼吸情况，呼吸周期为4秒（T）。这导致气道容积发生周期性的减小与增大...

讨论

本研究中所呈现的微流控腺泡平台的一个关键特征是其能够重现生理性的呼吸运动，从而在腺泡导管和肺泡内部产生符合生理条件的流动模式和流速。由于微流控通道采用相对较低的高宽比制备（即., w_d/h ≈ 3.9，其中 w_d 是导管宽度和 h 当量直径为导管高度时，测得的流场表现出比圆形通道中预期的抛物线流速分布更接近柱塞状流动的特征。然而，测得的流速仍处于生理范围之内；研究发现，表征惯性力与黏性力之比的特征无量纲雷诺数在肺泡管中段至远端区域的最大值约为0.01，该结果与半经验估算相符。².

此处，雷诺数定义为 Re = ū_x,最大D_h/ν

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚二甲基硅氧烷（PDMS）及固化剂	Dow Corning	(240)4019862	Sylgard® 184 硅橡胶弹性体套件
Plastipak 2 ml 注射器	BD	300185
Norm-Ject Luer 滑动式 1 ml 注射器	Henke Sass Wolf	4010-200V0
1 mm 组织活检打孔器	Kai Medical	BP-10F
实验室电晕处理仪	Electro-Technic Products	BD-20AC
PHD Ultra 注射泵	Harvard Apparatus	703006
红色染色水性荧光微粒	Thermo-Scientific		使用了未编目 0.86 µm 微珠
分析纯甘油	Gadot	830131320
FlowMaster MITAS 微粒子图像测速系统（µPIV）	LaVision	1108630