利用微波辐射构建骨架环状肽库作为潜在抗寄生虫治疗药物

摘要

本文概述了一种利用微波辐射合成环肽的简单且通用的方法。该方法能够在保留侧链和药效团部分的同时，合成具有多种不同构象的骨架环肽，从而可用于筛选生物活性构象。

摘要

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）几乎参与了所有生物过程，并与多种人类疾病相关。因此，基础研究和制药行业均致力于靶向PPIs。蛋白质-蛋白质相互作用界面通常较大、较平坦，且常缺乏结合口袋，这使得发现能够靶向此类位点的小分子变得复杂。利用抗体进行靶向的替代策略由于口服生物利用度差、细胞通透性低以及生产效率低下而存在局限性。

利用多肽靶向蛋白质相互作用（PPI）界面具有多种优势。多肽具有更高的构象灵活性、更强的选择性，且通常成本较低。然而，多肽自身也存在局限性，例如稳定性差以及穿越细胞膜效率低下。为克服这些局限，可采用多肽环化策略。研究表明，环化能够提高多肽的选择性、代谢稳定性以及生物利用度。然而，预测环状多肽的生物活性构象并非易事。为应对这一挑战，一种可行的策略是构建并筛选一个聚焦文库，其中所有骨架环状多肽具有相同的初级序列，但在影响其构象的参数（如环的大小和位置）上有所不同。

我们描述了一种合成靶向特定寄生虫蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的骨架环肽文库的详细方案。采用理性设计方法，我们开发了源自支架蛋白Leishmania激活型C激酶受体（LACK）的肽序列。我们假设，在寄生虫中保守而哺乳动物宿主同源物中不存在的LACK序列，可能代表对寄生虫存活至关重要的蛋白质相互作用位点。环肽的合成采用微波辐照，以缩短反应时间并提高效率。构建具有不同环大小的骨架环肽文库，有助于系统性筛选出生物学活性最高的构象。该方法提供了一种通用、快速且简便的环肽合成途径。

引言

蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在大多数生物过程中起着关键作用，从细胞内信号转导到细胞死亡均依赖于此¹。因此，靶向PPI对于基础研究和治疗应用均具有重要意义。PPI可通过特异且稳定的抗体进行调控，但抗体成本高昂、制备困难，并且生物利用度较差。另一种方法是使用小分子靶向PPI。与抗体相比，小分子更易于合成且价格低廉；然而，其结构相对刚性，更适合结合小的空腔，而非较大的蛋白质-蛋白质相互作用界面^2,3。大量研究表明，肽类分子结构比抗体更简单、成本更低，且比小分子更具柔性，能够结合蛋白质界面并调控PPI^4,5。2013年，全球治疗性肽市场规模约为150亿美元，年增长率达10.5%⁶。此外，已有超过50种肽类药物上市，约270种肽处于不同阶段的临床试验，约400种肽处于高级临床前研究阶段⁷。尽管已有大量肽被用作药物，肽类仍面临若干挑战，限制了其广泛应用，包括生物利用度低、稳定性差、跨膜效率低以及构象灵活性等问题^8,9。克服这些缺点的一种替代策略是引入多种修饰，如局部限制性修饰（D型氨基酸、N-烷基化）和全局性修饰（环化）^8,10-12。这些修饰在自然界中也普遍存在。例如，环孢素A是一种环状天然肽类免疫抑制剂，含有一个D型氨基酸，并经历N-烷基化修饰^13,14。

对天然氨基酸进行修饰以引入局部约束，例如 D-烷基....

方案

1. 仪器与试剂准备

1. 准备设备
   1. 所有步骤均须在通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。
   2. 使用配备 Discover 附加模块的微波多肽合成仪，在聚四氟乙烯反应瓶（30 ml，带玻璃砂芯）或一次性聚丙烯柱（12 ml，带粗砂芯）中，通过光纤温度探头控制微波功率，进行固相多肽的化学合成。
   3. 为实现充分混合，将氮气源连接至反应瓶；或 alternatively 密封聚丙烯柱的两端，并置于旋转摇床上。
   4. 为排出反应混合物或洗涤液，通过废液捕集装置连接至实验室真空系统。
   5. 将光纤探头插入反应瓶中。
2. 准备试剂
   1. 称取 Rink Amide AM 树脂（100–200 目，0.204 mg），加入 5 ml 体积比为 1:1 的 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）/二氯甲烷（DCM）混合溶液至反应瓶或聚丙烯柱中，以浸润树脂，振荡 2–4 小时使其充分溶胀，然后排干。
   2. 通过将相应的 9-芴甲氧羰基（Fmoc）-氨基酸溶解于 DMF 中，配制 0.2 M 的 Fmoc-氨基酸溶液，并涡旋混合至氨基酸完全溶解（表 1）。
   3. 通过将 18.96 g O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）溶解于....

结果

本文描述了一种靶向利什曼原虫（Leishmania）关键蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）并具有抗寄生虫活性的骨架环化肽小分子聚焦文库的构建（有关靶向PPIs作为抗寄生虫剂的肽类化合物综述见文献⁸⁷）。通过合成新型骨架环化肽，可在可扩展尺寸的支架结构中保留药效团。本研究所提出的聚焦文库的优势在于能够在改变肽支架尺寸的同时，通过环化作用限制其构象自由度。所有骨架环化肽的合成均采用Fmoc/tBu策略，在固相载体上利用自动化微波合成仪完成。环化反应通过连接子（酸酐/酸）与赖氨酸侧链氨基之间形成酰胺键实现。最终的裂解及侧链脱保护步骤为手动操作，未使用微波能量（合成路线及最终产物结构见图3）。产物经制备型HPLC纯化后获得25 mg白色粉末，储存于-20 °C。取样品进行质谱分析（图4），并采用分析型HPLC测定其纯度（图5）。每种环化肽均送样进行生物学筛选。其中四种环化肽之一（pL1）对引起内脏利什曼病（人类最严重的利什曼病类型）的杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani.......

讨论

本文描述了利用全自动微波合成仪合成源自利什曼原虫（Leishmania）LACK蛋白的一类骨架环肽聚焦文库的方法。该聚焦环肽文库具有保守的药效团结构，并引入了多种不同的连接基团。通过添加戊二酸酐、琥珀酸酐、己二酸、庚二酸、赖氨酸、鸟氨酸及其他构建单元等不同连接基团，可拓展环肽构象空间的多样性。构建聚焦型环肽文库有助于研究人员筛选出最优的构象空间。由于环肽的构象受环大小和连接位置等参数影响而各不相同，因此可生成多种具有不同构象的类似物，这些类似物在生物大分子构效关系研究中可能具有重要应用价值⁸⁸。

固相多肽合成（SPPS）中的一个主要挑战是难以判断合成进程并进行问题排查，因为中间产物不会被分离出来。因此，可采用多种比色检测方法来监测反应进程，例如通过凯撒试验（Kaiser试验）和氯化镍试验（Chloranil试验）来鉴定游离氨基。如果凯撒试验或氯化镍试验结果不明确（例如，由于脯氨酸和羟基脯氨酸的α-氨基参与形成五元环结构，无法像其他氨基酸一样与茚三酮发生相同反应），则可采用小规模裂解反应结合质谱分析来监测合成进程。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
固相载体，Rink Amide AM 树脂 ML	CBL	BR-1330	载量：0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OH	Advanced Chemtech	FA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OH	Advanced Chemtech	FR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OH	Advanced Chemtech	FD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OH	Advanced Chemtech	FE2237
Fmoc-Gly-OH	Advanced Chemtech	FG2275
Fmoc-His(Trt)-OH	Advanced Chemtech	FH2316
Fmoc-Ile-OH	Advanced Chemtech	FI2326
Fmoc-Leu-OH	Advanced Chemtech	FL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FK2390
Fmoc-Met-OH	Advanced Chemtech	FM2400
Fmoc-Phe-OH	Advanced Chemtech	FF2425
Fmoc-Pro-OH	Advanced Chemtech	FP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OH	Advanced Chemtech	FT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OH	Advanced Chemtech	FW2527
Fmoc-Tyr(But)-OH	Advanced Chemtech	FY2563
Fmoc-Val-OH	Advanced Chemtech	FV2575
1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）	Sigma	328634	注意 有毒/高度易燃/刺激性。
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）	Alfa Aesar	43465	注意 有毒。 使用高质量 DMF 以避免因 DMF 分解产生的二甲胺杂质引发 Fmoc 去除等副反应。
二氯甲烷（DCM）	Sigma	D65100	注意 有害
二溴甲烷（DBM）	Sigma	D41868	注意 有害
三氟乙酸（TFA）	Sigma	T62200	注意 腐蚀性/有毒
高效液相色谱级三氟乙酸（TFA）	Sigma	91707	注意 腐蚀性/有毒
乙醚	Sigma	31690	注意 高度易燃/有害
三异丙基硅烷（TIS）	Sigma	233781	注意 刺激性/易燃
水，高效液相色谱级	Sigma	270733
乙腈，高效液相色谱级（ACN）	Fisher Scientific	A998-4	注意 易燃/刺激性/有害
N,N-二异丙基乙胺（DIEA）	Sigma	3440	注意 腐蚀性/高度易燃
哌啶	Sigma	W290807	注意 有毒/高度易燃
吡啶	Sigma	270970	注意 高度易燃/有害
乙醇（EtOH）	Sigma	459844	注意 高度易燃/刺激性
1-羟基苯并三唑水合物（HOBt）	Sigma	157260	注意 高度易燃/刺激性/有害
O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）	Sigma	12804	注意 刺激性/有害
苯并三唑-1-基氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐（PyBOP）	Advanced Chemtech	RC8602	注意 刺激性
茚三酮	Sigma	454044	注意 有害
苯酚	Sigma	P3653	注意 腐蚀性/有毒
氰化钾（KCN）	Sigma	11813	注意 剧毒
氢氧化钾（KOH）	Sigma	221473	注意 有毒
N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）	Sigma	38370	注意 易燃/有毒
4-二甲氨基吡啶（DMAP）	Sigma	522805	注意 有毒/刺激性
戊二酸酐	Sigma	G3806	注意 易燃/刺激性/有害
琥珀酸酐	Sigma	239690	注意 刺激性/有害
己二酸	Sigma	A26357	注意 有毒/刺激性
庚二酸	Sigma	P45001	注意 有毒/刺激性
四氯苯醌	Sigma	23290	注意 有毒/刺激性
乙醛	Sigma	402788	注意 易燃/有毒
设备
离心机	Beckman Coulter	Allegra 6R 离心机
冻干机	Labconco	FreeZone 4.5
真空泵	Franklin Electric	型号 1101101416，配备 3/4 HP	Alcatel 泵配 Franklin 电机
12 ml 聚丙烯柱	Applied Separation	2419
12 ml 聚丙烯柱密封塞	Applied Separation	8157
3 ml 聚丙烯柱	Applied Separation	2413
3 ml 聚丙烯柱密封塞	Applied Separation	8054
聚四氟乙烯（PTFE）旋塞	Applied Separation	2406
50 ml 平底管	VWR	21008-240
萃取装置，20 位，16 x 100 mm 试管	Waters	WAT200609
摇床，BD Adams Nutator 混合器	Fisher Scientific	22363152
Nalgene HDPE 窄口 IP2 瓶，125 ml	Fisher Scientific	03-312-8
锥形瓶	Fisher Scientific	FB-501，500 ml
加热块	Thermolyne	1760 Dri Bath
一次性硼硅酸盐玻璃试管，平口	Fisher Scientific	14-961-25
移液器及吸头 Finnpipette	Thermo	20–200 和 100–1,000 μl
高效液相色谱小瓶 - 微型 PP 400 µl PK100	VWR	69400-124
高效液相色谱小瓶 - 蓝色 Snap-It 盖	VWR	66030-600
分析型高效液相色谱柱	Peeke Scientific	U1-5C18Q-JJ	Ultro 120 5 µm C18Q，4.6 mm 内径 × 150 mm
制备型高效液相色谱柱，XBridge	Waters	OBD C18 5 µm 柱	19 mm × 150 mm
质谱仪	Applied Biosystems	Voyager DE-RP
氮气钢瓶
干燥器
分析型反相高效液相色谱系统 Shimadzu LC-20			配备：CBM-20A 系统控制器、SPD-20A 检测器、CTO-20A 柱温箱、2 × LC-20AD 溶剂输送单元、SIL-20AC 自动进样器、DGU-20A5 脱气装置（Shimadzu，MD，USA）。
制备型反相高效液相色谱系统 Shimadzu LC-20			配备：CBM-20A 系统控制器、SPD-20A 检测器、CTO-20A 柱温箱、2 × LC-6AD 溶剂输送单元和 FRC-10A 馏分收集器（Shimadzu，MD，USA）。