方法文章

利用微波辐射构建骨架环状肽库作为潜在抗寄生虫治疗药物

DOI：

10.3791/53589

⸱

2016年1月26日

 , 
1Department of Chemical and Systems Biology, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

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本文概述了一种利用微波辐射合成环肽的简单且通用的方法。该方法能够在保留侧链和药效团部分的同时，合成具有多种不同构象的骨架环肽，从而可用于筛选生物活性构象。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）几乎参与了所有生物过程，并与多种人类疾病相关。因此，基础研究和制药行业均致力于靶向PPIs。蛋白质-蛋白质相互作用界面通常较大、较平坦，且常缺乏结合口袋，这使得发现能够靶向此类位点的小分子变得复杂。利用抗体进行靶向的替代策略由于口服生物利用度差、细胞通透性低以及生产效率低下而存在局限性。

利用多肽靶向蛋白质相互作用（PPI）界面具有多种优势。多肽具有更高的构象灵活性、更强的选择性，且通常成本较低。然而，多肽自身也存在局限性，例如稳定性差以及穿越细胞膜效率低下。为克服这些局限，可采用多肽环化策略。研究表明，环化能够提高多肽的选择性、代谢稳定性以及生物利用度。然而，预测环状多肽的生物活性构象并非易事。为应对这一挑战，一种可行的策略是构建并筛选一个聚焦文库，其中所有骨架环状多肽具有相同的初级序列，但在影响其构象的参数（如环的大小和位置）上有所不同。

我们描述了一种合成靶向特定寄生虫蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）的骨架环肽文库的详细方案。采用理性设计方法，我们开发了源自支架蛋白Leishmania激活型C激酶受体（LACK）的肽序列。我们假设，在寄生虫中保守而哺乳动物宿主同源物中不存在的LACK序列，可能代表对寄生虫存活至关重要的蛋白质相互作用位点。环肽的合成采用微波辐照，以缩短反应时间并提高效率。构建具有不同环大小的骨架环肽文库，有助于系统性筛选出生物学活性最高的构象。该方法提供了一种通用、快速且简便的环肽合成途径。

引言

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蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）在大多数生物过程中起着关键作用，从细胞内信号转导到细胞死亡均依赖于此1。因此，靶向PPI对于基础研究和治疗应用均具有重要意义。PPI可通过特异且稳定的抗体进行调控，但抗体成本高昂、制备困难，并且生物利用度较差。另一种方法是使用小分子靶向PPI。与抗体相比，小分子更易于合成且价格低廉；然而，其结构相对刚性，更适合结合小的空腔，而非较大的蛋白质-蛋白质相互作用界面2,3。大量研究表明，肽类分子结构比抗体更简单、成本更低，且比小分子更具柔性，能够结合蛋白质界面并调控PPI4,5。2013年，全球治疗性肽市场规模约为150亿美元，年增长率达10.5%6。此外，已有超过50种肽类药物上市，约270种肽处于不同阶段的临床试验，约400种肽处于高级临床前研究阶段7。尽管已有大量肽被用作药物，肽类仍面临若干挑战，限制了其广泛应用，包括生物利用度低、稳定性差、跨膜效率低以及构象灵活性等问题8,9。克服这些缺点的一种替代策略是引入多种修饰，如局部限制性修饰（D型氨基酸、N-烷基化）和全局性修饰（环化）8,10-12。这些修饰在自然界中也普遍存在。例如，环孢素A是一种环状天然肽类免疫抑制剂，含有一个D型氨基酸，并经历N-烷基化修饰13,14。

对天然氨基酸进行修饰以引入局部约束，例如 D-烷基化和 N-烷基化，通常会影响肽的生物活性。然而，环化修饰能够在保持目标序列不变的情况下，更有可能保留其生物活性。环化是一种极具吸引力的策略，可通过减少不同构象之间的平衡来限制肽的构象空间。它通常通过将肽限制在介导单一功能的活性构象中，从而提高肽的生物活性和选择性。此外，环化还能通过使肽保持在不易被降解酶识别的构象中，提高其稳定性。事实上，与线性对应物相比，环状肽表现出更优的代谢稳定性、生物利用度和选择性15-17。

然而，环化可能是一把双刃剑，因为在某些情况下，这种限制可能阻止肽段形成具有生物活性的构象。为了克服这一障碍，可以合成一个聚焦型文库，其中所有肽段具有相同的初级序列，因而具有恒定的药效团。该文库中的肽段在影响其结构的参数上有所不同，例如环的大小和位置，以便后续筛选出最具生物活性的构象9,18。

多肽可以在溶液中合成，也可以通过固相多肽合成（SPPS）方法进行合成，后者目前是更为常用的多肽合成方法，下文将对此进行进一步讨论。SPPS 是一种通过连接子在固相载体上进行化学转化以制备多种合成化合物的方法19。SPPS 能够通过逐个连接氨基酸的方式，从连接在固相载体上的 C-末端向 N-末端逐步组装多肽。为了确保每一步只添加一个氨基酸，氨基酸侧链上的 N-α 氨基必须用保护基团进行掩蔽，这些保护基团需在多肽链延伸过程中所用的反应条件下保持稳定。在最后一步中，多肽从树脂上释放，同时侧链上的保护基团也被去除。在多肽合成过程中，所有可溶性试剂均可通过过滤从多肽-固相载体复合物中去除，并在每次偶联步骤结束时被冲洗掉。利用该系统，可使用大量高浓度的过量试剂推动偶联反应趋于完全，且所有合成步骤均可在同一个反应容器中完成，无需转移物料20 。

尽管固相肽合成（SPPS）存在一些局限性，例如反应不完全、副反应、试剂不纯以及反应过程难以监测21，但其优势使其成为肽合成的“金标准”。这些优势包括可引入非天然氨基酸、可实现自动化、易于纯化、物理损失最小化以及可使用过量试剂，从而获得高产率。研究表明，SPPS在合成困难序列21,22、荧光标记修饰23以及肽库构建24,25方面极为有效。SPPS在其他多链分子的合成中也具有重要价值，例如寡核苷酸26,27、寡糖28,29以及肽核酸30,31。有趣的是，在某些情况下，SPPS被证明在合成传统上在溶液中制备的小分子时也具有优势32,33。SPPS既用于科研和教学中的小规模合成34,35，也广泛应用于工业上的大规模生产36-38。

固相多肽合成（SPPS）方法中主要用于多肽合成的两种合成策略是叔丁氧羰基（Boc）和9-芴甲氧羰基（Fmoc）。SPPS最初采用的策略是Boc法，该方法需要强酸条件来去除侧链保护基并使多肽从树脂上解离。然而，基于Fmoc的多肽合成则利用温和的碱性条件，是对酸不稳定的Boc方法的一种更温和的替代方案39。Fmoc策略采用正交的叔丁基（tBu）侧链保护基，该保护基在合成的最后一步通过酸性条件去除，同时使多肽从树脂上解离。

固相多肽合成的一般原理如图1所示。起始氨基酸的N-α-末端被临时保护基团封闭，从C-末端连接到树脂上。必要时，侧链也使用半永久性保护基团进行保护（图1，步骤1）。目标多肽的合成通过重复进行以下循环实现：脱除N-α-末端临时保护基团（图1，步骤2），然后偶联下一个带有保护基的氨基酸（图1，步骤3），从C-末端向N-末端逐步构建。当最后一个氨基酸连接完成后（图1，步骤4），将多肽从树脂载体上裂解下来，同时去除半永久性保护基团（图1，步骤5）。

固相多肽合成；化学过程示意图；TPG、SPG、氨基酸偶联步骤。
图1. 固相多肽合成的通用示意图。 N-α-保护的氨基酸通过其羧基经由连接臂锚定在树脂上（步骤1）。目标多肽通过重复进行临时保护基团（TPG）从N-α位点的脱保护（步骤2）和氨基酸偶联（步骤3），以从C端到N端的线性方式逐步组装。完成合成后（步骤4），在多肽裂解过程中去除半永久性保护基团（SPG）（步骤5）。请点击此处查看该图的放大版本。

在完整肽链组装完成后，可通过以下几种方式进行环化：（A）首尾环化——这是一种简便的方法，但具有局限性，因为它仅提供一种环化选择（图2A）；（B）利用目标序列中含生物活性功能基团的氨基酸进行环化——然而，使用这些氨基酸可能会影响其生物活性（图2B）；（C）通过添加氨基酸（或其他构建单元）进行环化，同时不干扰生物活性序列。引入这类分子的方法被广泛应用，因为它可在不改变目标序列的前提下构建聚焦的化合物库（图2C）。

显示二硫键和氨基酸序列的肽链化学结构示意图。
图 2. 替代性肽环化策略。（A）首尾环化，通过C端与N端之间的肽键形成环状结构；（B）通过功能团之间的连接实现环化，例如半胱氨酸残基间的二硫键（1），赖氨酸侧链与天冬氨酸/谷氨酸之间的酰胺键（2），或侧链与N端或C端之间的连接（3-4）；（C）通过在活性序列之前（R0）和之后（R7）引入额外的氨基酸、氨基酸衍生物或小分子实现环化。 请点击此处查看此图的高清版本。

微波辅助合成利用微波辐射加热反应，从而加速有机化学转化40,41。微波化学的基础在于试剂/溶剂吸收微波能量并将其转化为热能的能力42。在该技术广泛普及之前，必须克服若干主要缺陷，包括合成方法的可控性与可重复性问题，以及缺乏能够有效控制温度和压力的可用系统43,44。首篇关于微波辅助多肽合成的报道采用家用微波炉合成了数种短肽（7-10个氨基酸），显著提高了偶联效率和产物纯度45。此外，微波能量被证明可减少肽链聚集、降低副反应发生率、抑制消旋化，并提高偶联速率，这些因素对于困难序列及长序列的合成均至关重要46-53。

目前，微波辐射已广泛应用于固相载体上多肽或相关化合物的合成，包括：（A）在水中而非有机溶剂中进行合成54；（B）合成具有常见翻译后修饰的多肽，例如糖肽55-58或磷酸化多肽59-61，这类多肽的合成通常较为困难，原因是空间位阻较大的氨基酸衍生物偶联效率较低；（C）合成主链结构发生修饰的多肽，例如通过将氨基酸残基的C(α)原子替换为氮原子而形成的氮杂肽62，或侧链连接在酰胺氮而非Cα原子上的肽类似物（peptoids）63,64；（D）环状多肽的合成65-71；以及（E）组合化学文库的合成51,72。在大量研究中，作者报告称，与传统方法相比，采用微波辐射可显著提高合成效率并缩短反应时间。

通过合理设计73-75，我们开发了源自Leishmania活化C激酶受体（LACK）支架的抗寄生虫肽。LACK在利什曼原虫感染的早期阶段发挥重要作用76。表达LACK水平较低的寄生虫甚至无法在免疫缺陷小鼠中寄生77，因为LACK参与了寄生虫关键的信号传导过程和蛋白质合成78。因此，LACK是一种关键的支架蛋白79，也是有价值的药物靶点。我们聚焦于LACK中在寄生虫中保守但在宿主哺乳动物同源蛋白RACK中不保守的序列，鉴定出一段8个氨基酸的肽段（RNGQCQRK），该肽段可降低培养中Leishmania sp.的存活率。

在此，我们描述一种基于上述LACK蛋白序列的骨架环肽合成方案。该肽在固相载体上采用Fmoc/tBu策略通过微波加热的固相肽合成（SPPS）方法进行合成。肽随后与TAT偶联47-57 (YGRKKRRQRRR) 载体肽通过酰胺键连接，作为固相肽合成（SPPS）的一部分。基于TAT的多种货物分子向细胞内的转运已应用超过15年，且货物向亚细胞器的递送作用已得到证实80使用了四种不同的连接臂，即琥珀酸酐、戊二酸酐以及己二酸和庚二酸，以进行环化反应，生成含2至5个碳原子的羧酸连接臂。环化反应采用微波能量完成，而最终的裂解及侧链去保护步骤则手动进行，未使用微波能量。采用自动化微波合成仪可提高产物纯度、增加产率，并缩短合成时间。该通用实验方案可应用于其他利用多肽研究重要分子机制的研究中。 体外 和 体内 并进一步开发用于人类疾病的潜在药物。

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方案

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1. 仪器与试剂准备

  1. 准备设备
    1. 所有步骤均须在通风橱内进行，并使用适当的个人防护装备。
    2. 使用配备 Discover 附加模块的微波多肽合成仪，在聚四氟乙烯反应瓶（30 ml，带玻璃砂芯）或一次性聚丙烯柱（12 ml，带粗砂芯）中，通过光纤温度探头控制微波功率，进行固相多肽的化学合成。
    3. 为实现充分混合，将氮气源连接至反应瓶；或 alternatively 密封聚丙烯柱的两端，并置于旋转摇床上。
    4. 为排出反应混合物或洗涤液，通过废液捕集装置连接至实验室真空系统。
    5. 将光纤探头插入反应瓶中。
  2. 准备试剂
    1. 称取 Rink Amide AM 树脂（100–200 目，0.204 mg），加入 5 ml 体积比为 1:1 的 N,N-二甲基甲酰胺（DMF）/二氯甲烷（DCM）混合溶液至反应瓶或聚丙烯柱中，以浸润树脂，振荡 2–4 小时使其充分溶胀，然后排干。
    2. 通过将相应的 9-芴甲氧羰基（Fmoc）-氨基酸溶解于 DMF 中，配制 0.2 M 的 Fmoc-氨基酸溶液，并涡旋混合至氨基酸完全溶解（表 1）。
    3. 通过将 18.96 g O-(苯并三氮唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）溶解于 100 ml DMF 中，配制 0.45 M 活化剂溶液混合物，并涡旋至固体完全溶解（表 1）。
    4. 通过将 34.8 ml N,N-二异丙基乙胺（DIEA）与 65.2 ml 1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）混合，配制 2 M 活化碱溶液混合物（表 1）。
    5. 通过将 3.37 g 1-羟基苯并三氮唑水合物（HOBt）溶解于 250 ml 含 20% v/v 哌啶的 DMF 溶液中，配制 0.1 M 去保护溶液混合物，并涡旋至固体完全溶解（表 1）。

2. Fmoc保护的氨基酸偶联

  1. 氨基酸偶联
    1. 将氨基酸（2.5 ml）/活化剂（1 ml）/活化剂碱（0.5 ml）加入反应瓶/聚丙烯柱中，在25 W、75 °C条件下反应300秒（见表2），然后排空溶液。
    2. 用DMF洗涤树脂：向树脂中加入DMF，保持120秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤五次。
  2. Fmoc脱保护
    1. 向反应瓶/聚丙烯柱中加入7 ml含0.1 M HOBt的20%哌啶DMF溶液，在45 W、75 °C条件下孵育30秒（见表2）。
    2. 排空反应混合物。
    3. 再次向反应瓶/聚丙烯柱中加入7 ml含0.1 M HOBt的20%哌啶DMF溶液，在45 W、75 °C条件下孵育180秒（见表2）。
    4. 排空反应混合物。
    5. 用DMF洗涤树脂：向树脂中加入DMF，保持120秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤五次。
      注：可选择在此暂停操作，待日后继续进行。
  3. 完成氨基酸偶联步骤后，用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂，并在4 °C下保存至少数天（如需更长期保存，可置于-20 °C）。
    1. 将树脂从反应瓶转移至聚丙烯柱中。
    2. 用DCM洗涤树脂：向树脂中加入DCM，保持120秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤三次。
    3. 用顶端盖和活塞将聚丙烯柱密封严密。
    4. 在开始新的合成前，将树脂在DMF（7 ml）中溶胀3–4小时。
  4. 监测合成过程
    1. 使用凯氏（茚三酮）试验或氯醌试验快速判断合成进展。也可选择进行小规模裂解反应，以确定合成肽的纯度和分子量。详见第9节。
      注：如需进一步排查问题，请参见表3。
  5. 根据需要重复步骤2.1和2.2，以合成目标肽：Arg(Pbf)-Asn(Trt)-Gly-Gln(Trt)-Cys(Trt)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Mtt)-Gly-Gly-Tyr(But)-Gly-Arg(Pbf)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Gln(Trt)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)-Arg(Pbf)。

3. 酸酐/酸偶联

  1. 酸酐偶联
    1. 用 NMP 洗涤树脂。向树脂中加入 NMP，洗涤 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排掉溶液。重复三次。
    2. 将 10 当量的相应酸酐溶于 NMP（5 ml）中，加入 1 当量 4-二甲氨基吡啶（DMAP）和 10 当量 DIEA（表 1）。
    3. 将酸酐/DMAP/DIEA 按 10:1:10 的比例混合后加入树脂中，在 75 °C 下孵育 300 秒（25 W，表 2），然后排掉溶液。
    4. 用 NMP 洗涤树脂。向树脂中加入 NMP，洗涤 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排掉溶液。重复三次。
  2. 酸偶联
    1. 用 DMF 洗涤树脂。向树脂中加入 DMF，洗涤 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排掉溶液。重复三次。
    2. 将 10 当量的相应二元羧酸溶于 DMF（5 ml）中，加入 1 当量 DMAP 和 10 当量 N,N'-二异丙基碳二亚胺（DIC）（表 1）。
    3. 将混合物搅拌 30 分钟进行预活化。
    4. 将预活化后的混合物加入树脂中，在 75 °C 下孵育 300 秒（25 W，表 2），然后排掉溶液。
    5. 用 DMF 洗涤树脂。向树脂中加入 DMF，洗涤 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排掉溶液。重复三次。

4. N-甲基三苯甲基（Mtt）保护基的脱保护

注意：赖氨酸侧链采用 N-甲基三苯甲基（Mtt）81进行保护，该保护基可在酸性条件下选择性脱保护82,83。在摇床中手动脱除 Mtt 保护基，避免使用微波能量。

  1. 将树脂转移至配备有塞子和活塞的聚丙烯柱中。
  2. 用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂。向树脂中加入 DCM，振荡 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤三次。
  3. 每克树脂加入 15–25 ml 含 1% 三氟乙酸（TFA）、5% 三异丙基硅烷（TIS）和 94% DCM 的混合液至聚丙烯柱中。
    注意：TFA 为强酸，具有腐蚀性，对皮肤、眼睛和肺组织有强烈刺激性。
    1. 浓 TFA 溶液必须始终存放于通风橱内。
    2. 操作时应穿戴适当的个人防护装备（护目镜、实验服和手套），并在通风良好的通风橱内进行。若手套接触 TFA，应立即更换；如有泄漏，须立即清理。若皮肤或眼睛接触该酸，应立即用大量水冲洗受影响区域，并持续清洗至少 15 分钟。
  4. 将聚丙烯柱置于摇床上，在室温下振荡 5 分钟。
  5. 通过施加真空抽滤，排空聚丙烯柱中的溶液。
  6. 重复步骤 4.3–4.5，共三次。
  7. 用 DCM 洗涤树脂。向树脂中加入 DCM，振荡 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤五次。

5. 线性肽的环化

  1. 用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂。向树脂中加入二氯甲烷，洗涤120秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤五次。
  2. 在50 ml聚丙烯管中，将5当量的苯并三唑-1-氧基-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐（PyBOP）溶于二溴甲烷（DBM，5 ml）中，再向溶液中加入10当量的N,N-二异丙基乙胺（DIEA）（表1）。
  3. 将上述混合液加入树脂中，于25 W、75 °C条件下孵育300秒（表2），然后排空溶液。
  4. 用二氯甲烷（DCM）洗涤树脂。向树脂中加入二氯甲烷，洗涤120秒（7 ml，0 W，室温），然后排空溶液。重复此步骤三次。

6. 侧链基团的裂解与脱保护

  1. 用二氯甲烷和乙醚洗涤树脂。
    1. 向树脂中加入二氯甲烷，处理 120 秒（7 ml，0 W，室温），然后排出溶液。重复两次。
    2. 向树脂中加入二乙醚，处理120秒（7 ml，0 W，室温），然后排出溶液。重复此步骤两次。
  2. 在室温下，将树脂置于真空干燥器中，以氢氧化钾（KOH，1–10 g）为干燥剂干燥至少3小时。
  3. 称取干燥的树脂，并转移至聚丙烯柱中。
  4. 加入10 ml预冷的三氟乙酸（TFA）裂解混合液（例如， 每克树脂加入90% TFA、2.5% 水、2.5% TIS 和 5% 苯酚。
  5. 室温下振荡3小时。
  6. 使用12 ml聚丙烯柱中的烧结滤片，将树脂过滤至50 ml聚丙烯管中，收集三氟乙酸（TFA）裂解液。
  7. 向试管中加入冷的乙醚（35 ml）。
  8. 4 °C、1,207 × g 离心 5 分钟。
  9. 倾析出醚层。
  10. 重复步骤 6.7 至 6.9，共五次。

7. 骨架环肽的干燥

  1. 将沉淀的多肽保留在同一管中，并在通风橱中干燥30分钟。
  2. 用等体积的水和乙腈（ACN）混合液溶解该多肽。
  3. 用液氮冷冻最终产物溶液。
  4. 对最终产物进行冻干。

8. 骨架环肽的表征

  1. 取少量产物样品（1 mg）溶于水（400 µl）中。
  2. 将溶解的肽溶液（10–200 µl）注入反相高效液相色谱（RP-HPLC）系统，检测肽的纯度34。
  3. 使用基质辅助激光解吸电离质谱法（MS-MALDI）检测肽的分子量84。
    1. 取1 µl（100 µM）肽溶液，与等体积（1:1, v/v）乙腈:水混合，再加入1 µl基质溶液（5 mg/ml，α-氰基-4-羟基肉桂酸），该基质溶于含0.1%三氟乙酸（TFA）的乙腈:水（1:1, v/v）混合液中。
    2. 取1 µl混合液点样至MS-MALDI靶板上。
    3. 干燥样品后，放入质谱仪中进行检测。
  4. 称量肽产物并计算产率百分比。
  5. 于-20 °C保存。

9. 监测合成过程

  1. 凯氏（茚三酮）试验 85
    1. 配制试剂溶液。
      1. 将16.5 mg氰化钾（KCN）溶于25 ml蒸馏水中，配制溶液A。取上述溶液1 ml，用49 ml吡啶稀释。
      2. 将1 g茚三酮溶于20 ml乙醇中，配制溶液B。
      3. 将40 g苯酚溶于20 ml乙醇中，配制溶液C。
    2. 使用凯氏试验检测氨基酸偶联反应是否完成或保护基是否已脱除。
      1. 从树脂中取出少量珠粒转移至试管中。
      2. 向试管中加入每种溶液（A、B和C）各三滴（约100 µl），混匀。
      3. 将试管置于110 °C加热块中加热5分钟。
        注：珠粒呈蓝色（阳性结果）表明偶联反应不完全或Fmoc保护基尚未脱除。
  2. 氯醌试验 86
    1. 每次试验前需新鲜配制以下试剂。
      1. 配制2%氯醌的DMF溶液，即溶液A。
      2. 配制2%乙醛的DMF溶液，即溶液B。
    2. 进行氯醌试验以检测氨基酸偶联反应是否完成或保护基是否已脱除。
      1. 在1.5 ml离心管中混合100 µl溶液A与100 µl溶液B。
      2. 将树脂珠粒加入管中，轻轻振荡5分钟。
        注：珠粒呈深棕色（阳性结果）表明Fmoc保护基已脱除或偶联反应不完全。
  3. 小规模裂解反应
    1. 取少量树脂置于配有塞子和活塞的3 ml聚丙烯柱中。
    2. 加入2 ml含95%三氟乙酸（TFA）、2.5%水和2.5%三异丙硅烷（TIS）的混合液进行处理。
    3. 室温下振荡反应30分钟。
    4. 通过聚丙烯柱内的烧结滤板过滤除去树脂，并用氮气流吹干溶剂。
    5. 将残留物溶于水中，采用HPLC和/或质谱（MS）分析产物。

10. Leishmania donovani 前鞭毛体体外培养存活率检测

  1. Leishmania donovani（L. donovani）的培养与处理条件
    1. 在含有4.5 g/L葡萄糖、L-谷氨酰胺和丙酮酸钠的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中，于26 °C培养L. donovani前鞭毛体。
    2. 用环状肽（100 µM）处理L. donovani前鞭毛体，于26 °C孵育24小时。
  2. Leishmania donovani（L. donovani）活力检测
    1. 按照制造商说明书，使用20 µl alamarBlue检测寄生虫活力。
    2. 通过测定荧光（激发波长570 nm，发射波长590 nm）来确定alamarBlue的还原程度。荧光值越高，表明代谢活性越强，寄生虫活力越高。

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结果

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本文描述了一种靶向利什曼原虫（Leishmania）关键蛋白质-蛋白质相互作用（PPIs）并具有抗寄生虫活性的骨架环化肽小分子聚焦文库的构建（有关靶向PPIs作为抗寄生虫剂的肽类化合物综述见文献87）。通过合成新型骨架环化肽，可在可扩展尺寸的支架结构中保留药效团。本研究所提出的聚焦文库的优势在于能够在改变肽支架尺寸的同时，通过环化作用限制其构象自由度。所有骨架环化肽的合成均采用Fmoc/tBu策略，在固相载体上利用自动化微波合成仪完成。环化反应通过连接子（酸酐/酸）与赖氨酸侧链氨基之间形成酰胺键实现。最终的裂解及侧链脱保护步骤为手动操作，未使用微波能量（合成路线及最终产物结构见图3）。产物经制备型HPLC纯化后获得25 mg白色粉末，储存于-20 °C。取样品进行质谱分析（图4），并采用分析型HPLC测定其纯度（图5）。每种环化肽均送样进行生物学筛选。其中四种环化肽之一（pL1）对引起内脏利什曼病（人类最严重的利什曼病类型）的杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani...

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讨论

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本文描述了利用全自动微波合成仪合成源自利什曼原虫（Leishmania）LACK蛋白的一类骨架环肽聚焦文库的方法。该聚焦环肽文库具有保守的药效团结构，并引入了多种不同的连接基团。通过添加戊二酸酐、琥珀酸酐、己二酸、庚二酸、赖氨酸、鸟氨酸及其他构建单元等不同连接基团，可拓展环肽构象空间的多样性。构建聚焦型环肽文库有助于研究人员筛选出最优的构象空间。由于环肽的构象受环大小和连接位置等参数影响而各不相同，因此可生成多种具有不同构象的类似物，这些类似物在生物大分子构效关系研究中可能具有重要应用价值88。

固相多肽合成（SPPS）中的一个主要挑战是难以判断合成进程并进行问题排查，因为中间产物不会被分离出来。因此，可采用多种比色检测方法来监测反应进程，例如通过凯撒试验（Kaiser试验）和氯化镍试验（Chloranil试验）来鉴定游离氨基。如果凯撒试验或氯化镍试验结果不明确（例如，由于脯氨酸和羟基脯氨酸的α-氨基参与形成五元环结构，无法像其他氨基酸一样与茚三酮发生相同反应），则可采用小规模裂解反应结合质谱分析来监测合成进程。

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披露

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作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

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感谢Lauren Van Wassenhove、Sunhee Hwang和Daria Mochly-Rosen提供的有益讨论。本研究工作由美国国立卫生研究院资助项目NIH RC4 TW008781-01 C-IDEA（SPARK）支持，授予N.Q.。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
固相载体，Rink Amide AM 树脂 MLCBLBR-1330载量：0.49 mmol/g
Fmoc-Ala-OHAdvanced ChemtechFA2100
Fmoc-Arg(Pbf)-OHAdvanced ChemtechFR2136
Fmoc-Asn(Trt)-OHAdvanced ChemtechFN2152
Fmoc-Asp(OBut)-OHAdvanced ChemtechFD2192
Fmoc-Cys(Trt)-OHAdvanced ChemtechFC2214
Fmoc-Gln(Trt)-OHAdvanced ChemtechFQ2251
Fmoc-Glu(OtBu)-OHAdvanced ChemtechFE2237
Fmoc-Gly-OHAdvanced ChemtechFG2275
Fmoc-His(Trt)-OHAdvanced ChemtechFH2316
Fmoc-Ile-OHAdvanced ChemtechFI2326
Fmoc-Leu-OHAdvanced ChemtechFL2350
Fmoc-Lys(Boc)-OHAdvanced ChemtechFK2390
Fmoc-Met-OHAdvanced ChemtechFM2400
Fmoc-Phe-OHAdvanced ChemtechFF2425
Fmoc-Pro-OHAdvanced ChemtechFP2450
Fmoc-Ser-(tBu)-OHAdvanced ChemtechFS2476
Fmoc-Thr(tBu)-OHAdvanced ChemtechFT2518
Fmoc-Trp(Boc)-OHAdvanced ChemtechFW2527
Fmoc-Tyr(But)-OHAdvanced ChemtechFY2563
Fmoc-Val-OHAdvanced ChemtechFV2575
1-甲基-2-吡咯烷酮（NMP）Sigma328634注意 有毒/高度易燃/刺激性。
N,N-二甲基甲酰胺（DMF）Alfa Aesar43465注意 有毒。
使用高质量 DMF 以避免因 DMF 分解产生的二甲胺杂质引发 Fmoc 去除等副反应。
二氯甲烷（DCM）SigmaD65100注意 有害
二溴甲烷（DBM）SigmaD41868注意 有害
三氟乙酸（TFA）SigmaT62200注意 腐蚀性/有毒
高效液相色谱级三氟乙酸（TFA）Sigma91707注意 腐蚀性/有毒
乙醚Sigma31690注意 高度易燃/有害
三异丙基硅烷（TIS）Sigma233781注意 刺激性/易燃
水，高效液相色谱级Sigma270733
乙腈，高效液相色谱级（ACN）Fisher ScientificA998-4注意 易燃/刺激性/有害
N,N-二异丙基乙胺（DIEA）Sigma3440注意 腐蚀性/高度易燃
哌啶SigmaW290807注意 有毒/高度易燃
吡啶Sigma270970注意 高度易燃/有害
乙醇（EtOH）Sigma459844注意 高度易燃/刺激性
1-羟基苯并三唑水合物（HOBt）Sigma157260注意 高度易燃/刺激性/有害
O-(苯并三唑-1-基)-N,N,N′,N′-四甲基脲六氟磷酸盐（HBTU）Sigma12804注意 刺激性/有害
苯并三唑-1-基氧-三吡咯烷基磷六氟磷酸盐（PyBOP）Advanced ChemtechRC8602注意 刺激性
茚三酮Sigma454044注意 有害
苯酚SigmaP3653注意 腐蚀性/有毒
氰化钾（KCN）Sigma11813注意 剧毒
氢氧化钾（KOH）Sigma221473注意 有毒
N,N’-二异丙基碳二亚胺（DIC）Sigma38370注意 易燃/有毒
4-二甲氨基吡啶（DMAP）Sigma522805注意 有毒/刺激性
戊二酸酐SigmaG3806注意 易燃/刺激性/有害
琥珀酸酐Sigma239690注意 刺激性/有害
己二酸SigmaA26357注意 有毒/刺激性
庚二酸SigmaP45001注意 有毒/刺激性
四氯苯醌Sigma23290注意 有毒/刺激性
乙醛Sigma402788注意 易燃/有毒
设备
离心机Beckman CoulterAllegra 6R 离心机
冻干机LabconcoFreeZone 4.5
真空泵Franklin Electric型号 1101101416，配备 3/4 HPAlcatel 泵配 Franklin 电机 
12 ml 聚丙烯柱Applied Separation2419
12 ml 聚丙烯柱密封塞Applied Separation8157
3 ml 聚丙烯柱Applied Separation2413
3 ml 聚丙烯柱密封塞Applied Separation8054
聚四氟乙烯（PTFE）旋塞Applied Separation2406
50 ml 平底管VWR21008-240
萃取装置，20 位，16 x 100 mm 试管WatersWAT200609
摇床，BD Adams Nutator 混合器Fisher Scientific22363152
Nalgene HDPE 窄口 IP2 瓶，125 mlFisher Scientific03-312-8
锥形瓶Fisher ScientificFB-501，500 ml
加热块Thermolyne1760 Dri Bath
一次性硼硅酸盐玻璃试管，平口Fisher Scientific14-961-25
移液器及吸头 FinnpipetteThermo20–200 和 100–1,000 μl
高效液相色谱小瓶 - 微型 PP 400 µl PK100  VWR69400-124
高效液相色谱小瓶 - 蓝色 Snap-It 盖VWR66030-600
分析型高效液相色谱柱Peeke ScientificU1-5C18Q-JJUltro 120 5 µm C18Q，4.6 mm 内径 × 150 mm
制备型高效液相色谱柱，XBridge WatersOBD C18 5 µm 柱19 mm × 150 mm
质谱仪Applied BiosystemsVoyager DE-RP 
氮气钢瓶
干燥器
分析型反相高效液相色谱系统 Shimadzu LC-20配备：CBM-20A 系统控制器、SPD-20A 检测器、CTO-20A 柱温箱、2 × LC-20AD 溶剂输送单元、SIL-20AC 自动进样器、DGU-20A5 脱气装置（Shimadzu，MD，USA）。
制备型反相高效液相色谱系统 Shimadzu LC-20配备：CBM-20A 系统控制器、SPD-20A 检测器、CTO-20A 柱温箱、2 × LC-6AD 溶剂输送单元和 FRC-10A 馏分收集器（Shimadzu，MD，USA）。

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