利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

摘要

我们建立了光转换PSmOrange系统，作为一种强大、直接且成本低廉的工具，用于 体内 在GFP转基因背景下进行细胞示踪。本方案描述了其在斑马鱼模型系统中的应用。

摘要

透明的斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育迅速，结合细胞和组织的荧光标记，可直接在活体动物中观察发育过程。通过使用组织特异性启动子驱动荧光蛋白（FP）的表达，可对特定细胞进行标记，从而建立转基因品系。若采用荧光光转化蛋白，则可进一步精确追踪表达区域内的特定结构。通过照射目标区域的蛋白，可改变其发射光谱，使特定细胞或细胞簇呈现不同颜色，而其他转基因细胞仍保持原有颜色。目前的主要局限在于，斑马鱼中大量组织尚缺乏已知的特异性启动子。相比之下，基因捕获和增强子捕获筛选已产生了大量转基因资源，能够离散地标记几乎所有胚胎结构，其中大多数使用GFP，较少使用红色或黄色荧光蛋白。在上述转基因背景下追踪特定结构的一种策略是引入一种广泛表达的光转化蛋白，并在目标细胞中进行光转化。然而，现有的光转化蛋白通常具有绿色发射态，或较少情况下具有红色发射态¹，因此常常无法用于在已有转基因品系的荧光蛋白背景下追踪细胞。为解决这一问题，我们建立了适用于斑马鱼的PSmOrange系统^2,3。通过简单地显微注射编码该蛋白核定位形式的合成mRNA，可使所有细胞核呈现橙红色荧光。对目标区域的蛋白进行定向光转化后，其发射光谱可转变为远红光。由于该蛋白具有高量子效率和良好的稳定性，PSmOrange成为斑马鱼乃至其他真骨鱼类细胞示踪的优异工具。

引言

不断指数级改进的成像技术使得能够对发育过程进行长达连续约四天的时间序列追踪³。在斑马鱼及许多其他动物模型系统中，通常利用转基因表达的绿色荧光蛋白，有时也使用红色或黄色荧光蛋白，来标记特定的细胞、组织、轴突或血管结构，以方便观察。然而，在大多数转基因品系中，转基因并非仅在目标细胞中特异性表达，还会在其他额外结构中表达，这会阻碍对单个细胞或细胞群体的精确追踪。

荧光光转化蛋白非常适合在胚胎发育过程中进行细胞示踪。此类蛋白的应用需满足若干前提条件：具有较长的寿命、光转化后发射波长范围区分明显，以及荧光信号明亮。目前已有的光转化蛋白包括在光转化后发射波长发生变化的蛋白，如 Kaede⁴、KiGR⁵、mEos2⁶、PS-CFP2 或 Dendra2⁷，以及仅在光激活后产生荧光的蛋白（如 PAmCherry⁸、PAGFP⁹ 或 PATagRFP¹⁰）。然而，这些蛋白在现有的荧光蛋白转基因动物中用于细胞追踪时应用受限，因为它们通常具有绿色荧光状态，或未能完全满足上述所有条件。直到最近，Subach 及其同事才报道了 PSmOrange 蛋白，该蛋白在光转化后发射波长由橙红色转变为远红光，并已在培养细胞以及注射至小鼠体内的培养细胞中成功应用²。

为了研究该蛋白在活体胚胎中进行细胞示踪的适用性，我们构建了用于显微注射的核定位标记H2B-PSmOrange表达载体，并将其注入斑马鱼胚胎中。我们发现，该蛋白在斑马鱼胚胎发育的前4天（甚至更长时间）内，在GFP转基因背景下完全满足成功细胞示踪的所有先决条件。在此期间，鱼类中的大多数细胞迁移事件已经完成，因此PSmOrange系统成为斑马鱼研究工具箱中的极佳补充。

方案

1. H2B-PSmOrange mRNA 体外 转录与mRNA纯化

1. 根据制造商说明，使用 NotI 限制性内切酶将含有 H2B-PSmOrange 的 pCS2+ 质粒线性化。
   注意：进行后续步骤时应采取适当的防护措施，例如佩戴手套和实验服，以防止 mRNA 污染和降解。
2. 根据制造商方案，使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚-氯仿法纯化线性化 DNA。
3. 根据制造商说明，使用 1 µg 线性化模板 DNA 进行 Sp6-mRNA 转录。
4. 加入 1.0 U 无 RNase 的 DNaseI，在 37 °C 下孵育 10–20 分钟以去除 DNA。
5. 根据制造商方案，使用 RNA 纯化试剂盒对 mRNA 进行纯化。
6. 为提高 mRNA 纯度和浓度，加入 6 µl 乙酸钠（3.0 M，pH 5.2）和 150 µl 96% 乙醇沉淀 mRNA。将混合溶液在 -20 °C 下孵育至少 30 分钟，最长可达 24 小时。
7. 在 4 °C 下以 18.407 × g 离心 45 分钟收集 mRNA。弃去上清液，将 mRNA 重悬于 150 µl 70% 乙醇中。混匀后在 4 °C 下再离心 15 分钟。弃去液体，将沉淀在冰上干燥 5 分钟，然后将 mRNA 重悬于 20 µl 超纯无 RNase 水中。
8. 通过分光光度法测定 1:100 稀释的 mRNA 溶液（1 µl mRNA 加 99 µl 超纯无 RNase 水）来评估 mRNA 的浓度和纯度。
9. 短期储存时，将 mRNA 溶液保存在 -20 °C；长期储存时，将 mRNA 保存在 -80 °C。

2. 斑马鱼胚胎中H2B-PSmOrange mRNA的显微注射

1. 在注射前一晚设置交配对，使用 tg(foxD3:GFP); tg(flh:GFP) 双转基因鱼（或其他任何GFP转基因鱼）。通过在鱼之间放置隔离板使其保持分离，以控制交配时间。
2. 在注射当天早晨移除隔离板，让鱼交配20分钟。
3. 在交配期间，将H2B-PSmOrange mRNA用无RNase水稀释至终浓度为130 pg/nl，并用微量进样器吸头将6 µl注射液转移至显微注射毛细管中。使用校准过的玻璃载片检查注射体积。调节注射压力，使每次注射2 nl mRNA溶液（260 pg）。
4. 将受精卵收集到含有1x 胚胎（E3）培养基的无菌塑料培养皿中。
5. 用塑料巴斯德吸管将20至30个胚胎转移至注射用培养皿中。
6. 在单细胞阶段，将含有2 nl mRNA的溶液注射入细胞内或紧贴细胞下方的卵黄中¹¹。
7. 将注射后的胚胎转移至含有1x E3培养基的培养皿中，去除未受精或发育异常的胚胎，并在28 °C下培养。
   注意：整个实验过程中无需对胚胎进行避光保护。
8. 在1x E3培养基中培养斑马鱼胚胎，在原肠胚形成后加入0.2 mM PTU（1-苯基-2硫脲）以抑制色素形成。每天更换两次培养基，以尽量减少细菌污染的风险。

3. 胚胎包埋

1. 使用配备荧光灯和适当发射滤光片的双目显微镜，筛选出共表达GFP（绿色）和PSmOrange（橙色/红色）的胚胎。将阳性胚胎转移至含有1x E3培养基的无菌培养皿中。
2. 在体视显微镜下使用镊子去除胚胎的绒毛膜¹²。
3. 用剪口吸头（P200）将一个胚胎转移至含有1.0 ml预热的1.0%低熔点琼脂糖（LMA）的1.5 ml离心管中，LMA使用超纯水配制。注意：将LMA加热至80 °C后，于室温冷却3–5分钟，再进行胚胎包埋。
4. 将胚胎连同150 µl LMA转移至玻璃底共聚焦培养皿中，使用细塑料吸头调整胚胎方向，例如在本实验所描述的倒置共聚焦激光扫描显微镜A1R+（或其他合适的显微镜）中，使胚胎背侧朝下。待LMA凝固后，向腔室内加入含有0.2 mM PTU和0.02%甲磺酸乙酯-3-氨基苯甲酸（Tricaine）的养鱼水以进行麻醉。
5. 成像前需等待15分钟，以确保Tricaine发挥麻醉效果。麻醉可防止胚胎移动，可通过配备明场照明的体视显微镜监测胚胎状态。
   注意：培养腔室可重复使用两次。

4. PSmOrange 光转换

1. 将样品置于共聚焦显微镜下，使用488 nm和561 nm激光分别对GFP和PSmOrange进行成像，扫描样本以确定需要光转化的区域。
   注意：使用由显微成像软件控制的倒置共聚焦激光扫描显微镜A1R+（配备倒置载物台TiE），该系统配有用于光转化和成像的488 nm、561 nm和640 nm激光器。然而，只要具备用于转化和成像的激光谱线，本应用并不局限于该型号显微镜。
   1. 安装20倍空气物镜（NA：0.75；WD：1.0 mm；视场：0.64 × 0.64 mm）。
   2. 在光转化前使用以下显微镜设置检测PSmOrange蛋白：561 nm激光，物镜上方焦平面测得功率为0.74 mW。
      注意：在此系统中相当于40%输出功率（在焦平面测量是确定有效功率的唯一方法）。根据实验需求调整激光功率，因为H2B-PSmOrange注射效率可能因样本而异。
   3. 增加放大倍数以突出目标区域。更高的放大倍数可缩短图像采集时间，从而降低光毒性。
2. 使用488 nm和561 nm激光以逐行扫描模式（line mode 1->4）获取覆盖目标结构的z轴层扫图像。固定z轴步进在1.0至2.0 µm之间。可通过线平均和扫描频率优化图像质量。
3. 扫描样品并选择“感兴趣区域”（ROI）工具以标记待光转化区域，将ROI设定为刺激区域。选择“光激活/漂白”模块，勾选对应选项以启用488 nm激光，并将488 nm激光设为80%（在物镜处测得激光功率为1 mW）。将扫描速度设为0.5秒/帧。
4. 打开光转化工具（ND Stimulation），设定光转化参数。
   1. 点击"添加"命令以设定光转化程序。
   2. 在"采集/刺激"菜单中将"阶段"1设为"采集"，并在"循环"菜单中指定光转化前需采集的图像数量。
   3. 将"阶段"2设为"刺激"，并输入将执行的刺激次数。
   4. 按照"阶段"1的设定方式调整"阶段"3。可选操作：在"阶段"2之后插入一个等待"阶段"，输入在最后一轮图像采集前的等待时间。
   5. 所有参数设定完成后，应用刺激设置并运行光转化。
      注意：每次光转化的激光功率、扫描频率和循环次数可能因胚胎不同而有所变化。一个可作为起始参考的设置见表1。
5. 使用488 nm、561 nm和640 nm激光，按照上述设置获取最终的z轴层扫图像。将640 nm激光设为高功率（最高达4.5 mW）以观察转化后的PSmOrange。

5. 从LMA上卸下胚胎

1. 从显微镜上取下含有胚胎的培养室。用镊子小心地将胚胎从琼脂糖中取出。
2. 将胚胎转移至新的灭菌塑料培养皿中，或转移至含有1x E3和0.2 mM PTU的灭菌6孔板中。在28 °C下孵育胚胎，直至达到所需发育阶段。

6. 分析光转化PSmOrange蛋白表达细胞的命运

1. 按照第 3.3 和 3.4 步所述重新包埋胚胎。
2. 将样品置于共聚焦显微镜下，扫描样本以在目标 GFP 转基因结构（488 nm）中识别光转化细胞（640 nm）。
3. 使用 488 nm、561 nm 和 640 nm 激光以顺序模式（线扫描模式 1->4）采集覆盖目标结构的 z 轴层扫图像。z 轴步长固定在 1.0 至 2.0 µm 之间。可通过设置线平均和扫描频率来优化图像质量。
4. 采用以下方法之一识别共表达 GFP 与光转化蛋白的细胞。
   1. 自定义的 Fiji ImageJ 宏程序³
      1. 使用 "GaussianBlur" 插件对原始图像栈进行卷积（→ Process → Filters → GaussianBlur），然后使用 "Image Calculator" 插件（→ Process → Image Calculator）将平滑后的图像栈从原始图像中减去。此步骤可用于突出显示目标结构并减少后续分析的计算时间。
      2. 对绿色和远红通道应用特定阈值，以突出光转化细胞（→ Image → Adjust → Threshold）。使用 "Analyze Particles" 工具在合适参数下检测阈值区域（→ Analyze → Analyze Particles）。
      3. 打开 "Image Calculator" 插件，显示绿色与远红通道中重叠的感兴趣区域（ROI），重叠区域以黄色呈现（→ Process → Image Calculator）。
   2. 显微镜成像软件用于三维数据评估
      1. 使用“显示体积视图”选项以三维方式显示图像栈（→ 3D Visualization Menu → Show Volume View）。通过图形界面选择绿色、红色和远红通道，调节亮度与对比度，并对三维图像栈进行裁剪以突出光转化区域（图 1）。
         注意：大多数常用的图像分析软件均提供类似的数据分析方法。

结果

图1展示了一个PSmOrange光转化系统的示例。松果体复合体是脊椎动物间脑背侧一个保守的结构。与其他许多脊椎动物类似，该复合体由位于间脑中央的松果体器官以及位于左侧的副松果体细胞组成。此前优雅但耗时的光解笼锁实验表明，副松果体细胞起源于松果体器官的前部¹³。在tg(foxD3:GFP); tg(flh:GFP)转基因胚胎中，松果体和副松果体细胞在发育过程中均被标记。为了评估PSmOrange系统的适用性，我们利用这些胚胎重现了已报道的松果体复合体发育过程。将编码PSmOrange核定位形式（H2B-PSmOrange）的260 pg mRNA注射到单细胞期的双转基因胚胎中，以实现在所有细胞核中表达该蛋白。注射后的胚胎在28 °C下孵育至受精后24小时（hpf），筛选出具有GFP和强H2B-PSmOrange表达的胚胎，并将其包埋于带有腔室的盖玻片系统中的LMA中，使胚胎背侧朝向底部。将样本置于倒置共聚焦激光扫描显微镜下，显微镜由成像软件控制，配备488 nm、561 nm和640 nm激光器以及20倍空气物镜，用于...

讨论

携带荧光报告基因的转基因胚胎已从根本上帮助人们理解胚胎发育过程。然而，目前仍迫切需要特异性启动子，以实现对特定结构的可视化观察。在缺乏此类启动子的情况下，研究人员依赖于荧光蛋白光转化等技术，以探究其目标结构的起源与发育过程。而这一点反过来又是识别其发育过程中所涉及的分子机制的关键前提。斑马鱼领域的技术进步现已允许通过CRISPR-Cas9介导的基因敲入方法，将转基因品系中的荧光蛋白（FP）替换为例如可光转化蛋白^14,15。然而，该技术相对耗时，且并非总能成功。相比之下，在GFP背景（以及可能的其他转基因背景）中普遍表达H2B-PSmOrange是一种直接有效的方法，可用于追踪胚胎发育过程中的细胞动态。

例如，斑马鱼腹侧缰核是脊椎动物间脑背侧保守神经传导系统的一部分，其起源直到最近才被揭示，因此此前一直未能发现调控其发育的基因级联机制。通过使用PSmOrange系统和长期延时成像分析来追踪迁移的细胞，我们发现，与位于松果体两侧的背侧缰核不同，腹侧缰核神经元在丘脑中起源于该区域后方³。这一发现使我们得以鉴定出经典Wnt信号通路下游基因Tcf7...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute 纯化试剂盒	Qiagen	74204
塑料巴斯德吸管	alpha laboratories	LW4000
原始 H2B-PSmOrange 质粒	Addgene	31920	文中描述的质粒可在 Carl 实验室获得
FemtoJet 微注射仪	Eppendorf	5247 000.013
镊子（5 Inox）	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II 带 #1.5 德国盖玻片的腔室系统	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X 干镜物镜	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR 软件（v. 4.30.02）	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number