利用光转换PSmOrange系统追踪GFP转基因斑马鱼中的细胞

摘要

我们建立了光转换PSmOrange系统，作为一种强大、直接且成本低廉的工具，用于 体内 在GFP转基因背景下进行细胞示踪。本方案描述了其在斑马鱼模型系统中的应用。

摘要

透明的斑马鱼（Danio rerio）胚胎发育迅速，结合细胞和组织的荧光标记，可直接在活体动物中观察发育过程。通过使用组织特异性启动子驱动荧光蛋白（FP）的表达，可对特定细胞进行标记，从而建立转基因品系。若采用荧光光转化蛋白，则可进一步精确追踪表达区域内的特定结构。通过照射目标区域的蛋白，可改变其发射光谱，使特定细胞或细胞簇呈现不同颜色，而其他转基因细胞仍保持原有颜色。目前的主要局限在于，斑马鱼中大量组织尚缺乏已知的特异性启动子。相比之下，基因捕获和增强子捕获筛选已产生了大量转基因资源，能够离散地标记几乎所有胚胎结构，其中大多数使用GFP，较少使用红色或黄色荧光蛋白。在上述转基因背景下追踪特定结构的一种策略是引入一种广泛表达的光转化蛋白，并在目标细胞中进行光转化。然而，现有的光转化蛋白通常具有绿色发射态，或较少情况下具有红色发射态¹，因此常常无法用于在已有转基因品系的荧光蛋白背景下追踪细胞。为解决这一问题，我们建立了适用于斑马鱼的PSmOrange系统^2,3。通过简单地显微注射编码该蛋白核定位形式的合成mRNA，可使所有细胞核呈现橙红色荧光。对目标区域的蛋白进行定向光转化后，其发射光谱可转变为远红光。由于该蛋白具有高量子效率和良好的稳定性，PSmOrange成为斑马鱼乃至其他真骨鱼类细胞示踪的优异工具。

引言

不断指数级改进的成像技术使得能够对发育过程进行长达连续约四天的时间序列追踪³。在斑马鱼及许多其他动物模型系统中，通常利用转基因表达的绿色荧光蛋白，有时也使用红色或黄色荧光蛋白，来标记特定的细胞、组织、轴突或血管结构，以方便观察。然而，在大多数转基因品系中，转基因并非仅在目标细胞中特异性表达，还会在其他额外结构中表达，这会阻碍对单个细胞或细胞群体的精确追踪。

荧光光转化蛋白非常适合在胚胎发育过程中进行细胞示踪。此类蛋白的应用需满足若干前提条件：具有较长的寿命、光转化后发射波长范围区分明显，以及荧光信号明亮。目前已有的光转化蛋白包括在光转化后发射波长发生变化的蛋白，如 Kaede⁴、KiGR⁵、mEos2⁶、PS-CFP2 或 Dendra2⁷，以及仅在光激活后产生荧光的蛋白（如 PAmCherry⁸、PAGFP⁹ 或 PATagRFP¹⁰）。然而，这些蛋白在现有的荧光蛋白转基因动物中用于细胞追踪时应用受限，因为它们通常具有绿色荧光状态，或未能完全满足上述所有条件。直到最近，Subach 及其同事才报道了 PSmOrange 蛋白，该蛋白在光转化后发射波长由橙红色转变为远红光，并已在培养细胞以及注射至小鼠体内的培养细胞中成功应用²。

方案

1. H2B-PSmOrange mRNA 体外 转录与mRNA纯化

1. 根据制造商说明，使用 NotI 限制性内切酶将含有 H2B-PSmOrange 的 pCS2+ 质粒线性化。
   注意：进行后续步骤时应采取适当的防护措施，例如佩戴手套和实验服，以防止 mRNA 污染和降解。
2. 根据制造商方案，使用 PCR 纯化试剂盒或苯酚-氯仿法纯化线性化 DNA。
3. 根据制造商说明，使用 1 µg 线性化模板 DNA 进行 Sp6-mRNA 转录。
4. 加入 1.0 U 无 RNase 的 DNaseI，在 37 °C 下孵育 10–20 分钟以去除 DNA。
5. 根据制造商方案，使用 RNA 纯化试剂盒对 mRNA 进行纯化。
6. 为提高 mRNA 纯度和浓度，加入 6 µl 乙酸钠（3.0 M，pH 5.2）和 150 µl 96% 乙醇沉淀 mRNA。将混合溶液在 -20 °C 下孵育至少 30 分钟，最长可达 24 小时。
7. 在 4 °C 下以 18.407 × g 离心 45 分钟收集 mRNA。弃去上清液，将 mRNA 重悬于 150 µl 70% 乙醇中。混匀后在 4 °C 下再离心 15 分钟。弃去液体，将沉淀在冰上干燥 5 分钟，然后将 mRNA 重悬于 20 µl 超纯无 RNase 水中。
8. 通过分光光度法测定 1:100 稀释的 mRNA 溶液（1....

结果

图1展示了一个PSmOrange光转化系统的示例。松果体复合体是脊椎动物间脑背侧一个保守的结构。与其他许多脊椎动物类似，该复合体由位于间脑中央的松果体器官以及位于左侧的副松果体细胞组成。此前优雅但耗时的光解笼锁实验表明，副松果体细胞起源于松果体器官的前部¹³。在tg(foxD3:GFP); tg(flh:GFP)转基因胚胎中，松果体和副松果体细胞在发育过程中均被标记。为了评估PSmOrange系统的适用性，我们利用这些胚胎重现了已报道的松果体复合体发育过程。将编码PSmOrange核定位形式（H2B-PSmOrange）的260 pg mRNA注射到单细胞期的双转基因胚胎中，以实现在所有细胞核中表达该蛋白。注射后的胚胎在28 °C下孵育至受精后24小时（hpf），筛选出具有GFP和强H2B-PSmOrange表达的胚胎，并将其包埋于带有腔室的盖玻片系统中的LMA中，使胚胎背侧朝向底部。将样本置于倒置共聚焦激光扫描显微镜下，显微镜由成像软件控制，配备488 nm、561 nm和640 nm激光器以及20倍空气物镜，用于.......

讨论

携带荧光报告基因的转基因胚胎已从根本上帮助人们理解胚胎发育过程。然而，目前仍迫切需要特异性启动子，以实现对特定结构的可视化观察。在缺乏此类启动子的情况下，研究人员依赖于荧光蛋白光转化等技术，以探究其目标结构的起源与发育过程。而这一点反过来又是识别其发育过程中所涉及的分子机制的关键前提。斑马鱼领域的技术进步现已允许通过CRISPR-Cas9介导的基因敲入方法，将转基因品系中的荧光蛋白（FP）替换为例如可光转化蛋白^14,15。然而，该技术相对耗时，且并非总能成功。相比之下，在GFP背景（以及可能的其他转基因背景）中普遍表达H2B-PSmOrange是一种直接有效的方法，可用于追踪胚胎发育过程中的细胞动态。

例如，斑马鱼腹侧缰核是脊椎动物间脑背侧保守神经传导系统的一部分，其起源直到最近才被揭示，因此此前一直未能发现调控其发育的基因级联机制。通过使用PSmOrange系统和长期延时成像分析来追踪迁移的细胞，我们发现，与位于松果体两侧的背侧缰核不同，腹侧缰核神经元在丘脑中起源于该区域后方³。这一发现使我们得以鉴定出经典Wnt信号通路下游基因Tcf7.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104
mMESSAGE mMACHINE SP6 体外转录试剂盒	Ambion	AM1340
RNeasy MiniElute 纯化试剂盒	Qiagen	74204
塑料巴斯德吸管	alpha laboratories	LW4000
原始 H2B-PSmOrange 质粒	Addgene	31920	文中描述的质粒可在 Carl 实验室获得
FemtoJet 微注射仪	Eppendorf	5247 000.013
镊子（5 Inox）	NeoLab	2-1633
Lab-Tek II 带 #1.5 德国盖玻片的腔室系统	Nunc	155382
Nikon A1R+	Nikon GmbH Germany	No Number
Nikon PLAN Apo λ 20X 干镜物镜	Nikon GmbH Germany	No Number
NIS Elements AR 软件（v. 4.30.02）	Nikon GmbH Germany/Laboratory Imaging	No Number