使用组织特异性水凝胶生物墨水打印细胞化结构

摘要

我们描述了一组联合使用的方案，可共同制备出具有组织模拟特性的水凝胶生物墨水，用于生物打印功能完整且存活的三维组织结构 体外 筛选应用。

摘要

生物打印已成为一种多功能的生物制造方法，可用于构建组织工程器官。这些结构有望作为器官替代物植入患者体内，同时，当以较小尺度构建时，可作为模型“类器官”使用，应用于 体外 用于药物和毒理学筛选的系统。

尽管已开发出多种多样的生物打印设备，但生物打印技术的应用仍可能受限于可用材料的范围，这些材料需既能加快生物打印过程，又能通过提供组织特异性信号来支持细胞的存活与功能。本文介绍一种基于透明质酸（HA）和明胶的多功能水凝胶体系，该体系采用多交联剂、两阶段交联方案，可提供组织特异性的生化信号，并模拟目标组织的力学性能。 体内 组织。

通过引入来源于组织的细胞外基质材料（包含强效生长因子）来提供生化因子。组织的力学性能则通过不同分子量、结构（线性或多臂）和官能团的聚乙二醇（PEG）交联剂组合进行调控，从而获得可挤出的生物墨水，并使最终构建物的剪切刚度在较宽范围内（100 Pa 至 20 kPa）可调。利用这些参数，采用肝组织特异性生物墨水进行水凝胶生物打印，将原代肝细胞球体打印成in vitro肝组织构建物，实现了高细胞存活率，并可检测到白蛋白和尿素的功能性分泌。该方法提供了一个通用框架，可为进一步定制用于多种组织构建物生物制造的水凝胶提供适应性基础。

引言

近年来，多种技术相继出现，旨在通过制造或生物制造功能性器官和组织来满足对替代来源的需求。其中，生物打印技术已成为最具前景的技术之一。生物打印可被视为一种对生物部件进行机器人化增材制造的技术，可用于构建或图案化出三维的、具有活性的类器官或类组织结构¹。在大多数情况下，生物打印采用由计算机控制的三维（3-D）打印设备，将细胞和生物材料精确地沉积到指定位置，从而重现模拟解剖结构的生理架构²。这些设备打印的是一种称为“"生物墨水"”的材料，其形式可以是细胞聚集体、包埋于水凝胶或黏性流体中的细胞、接种了细胞的微载体，也可以是提供机械支撑或作为无细胞占位结构的无细胞聚合物^3,4。在完成生物打印后，所获得的结构可进一步成熟为功能性组织或器官结构，并用于预期的最终应用^5,6。迄今为止，尚未成功打印出完整且完全功能化的人体尺寸器官，但这仍是生物打印研发的主要长期目标²。然而，目前小型的“"类器官"”组织结构已在多种应用中投入使用，包括病理建模、药物开发和毒理学筛选。

研究人员在应用生物打印技术时遇到的主要障碍之一是，专门用于生物打印的材料非常有限。要成功实现生物打印，生物材料必须满足四个基本要求：生物材料需要具备 1）适当的机械性能，以实现材料的沉积（无论是通过喷嘴挤出凝胶形式，还是以喷墨方式形成液滴）；2）在沉积后作为三维结构组分保持其形状的能力；3）....

方案

1. 水凝胶生物墨水的配方与制备

1. 为了提供组织特异性的生化谱型，按照先前描述的肝脏方法制备组织特异性的细胞外基质（ECM）消化液。²⁰
   注意：通常，该ECM消化液将占最终水凝胶生物墨水体积的40%。可制备数百毫升ECM消化液，分装后于-80 °C冷冻保存，以备将来使用。
2. 在配制水凝胶之前，将光引发剂2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮以0.1% w/v的浓度溶于水中。
   注意：可预先配制50–100 ml体积的溶液，避光保存于4 °C，可稳定数月。
3. 为形成水凝胶生物墨水，首先将透明质酸（HA）水凝胶试剂盒中的基础材料组分溶解于水-光引发剂溶液中。
   1. 将巯基化HA和巯基化明胶分别溶于水-光引发剂溶液（步骤1.2）中，配制成2% w/v的溶液。
   2. 将水凝胶试剂盒中的交联剂聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA）溶于水-光引发剂溶液（步骤1.2）中，配制成8% w/v的溶液。
   3. 将八臂聚乙二醇炔烃（PEG 8-Arm alkyne，分子量10 kDa）溶于水-光引发剂溶液（步骤1.2）中，配制成8% w/v的溶液。
4. 通常按照以下方案制备水凝胶，但也可根据需要进行额外定制。
   1. 将4份2%巯基化HA、4份2%巯基化明胶、1份交联剂1、1份交联剂2与8份组织ECM溶液及2份肝细胞培养基（HCM）混....

结果

若正确执行上述操作步骤，水凝胶应具有针对目标组织类型的特定生化谱²⁰，能够对生物打印过程及最终弹性模量进行高度控制³⁴，并支持组织构建物中细胞的存活与功能。

水凝胶定制
为了更好地模拟天然肝脏，向水凝胶生物墨水中添加肝脏细胞外基质（ECM）溶液和生长因子阵列,²⁰ ECM溶液中含有多种生长因子和细胞因子（浓度单位为pg/ml，图1A）。这些因子包括脑源性神经营养因子（BDNF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、骨形态发生蛋白5（BMP-5）、成纤维细胞生长因子4（FGF-4）、胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2）、转化生长因子β1（TGF-β1）、骨形态发生蛋白7（BMP-7）、表皮生长因子（EGF）、成纤维细胞生长因子7（FGF-7）、生长激素（GH）、肝素结合性.......

讨论

在尝试生物制造用于人体或其它用途的三维组织构建物时，有几个关键组成部分需要重点考虑 体外 筛选应用。选择合适的细胞组分决定了最终的功能潜力，而生物制造设备本身则决定了实现最终结构的总体方法。第三个组分——生物材料——同样至关重要，因其具有双重作用。具体而言，生物材料必须与生物制造硬件兼容（即生物打印机）并为可能脆弱的生物细胞组分提供支撑。优化这两个要求可能十分困难，因为可用于生物打印的材料需要满足若干关键参数：1）具备适当的化学、力学和时间特性，以实现高效且无阻碍的打印过程；2）在制备阶段和生物打印过程中维持细胞活性；3）在生物打印完成后，提供有利于细胞存活并促进最终组织构建物功能发挥的微环境。本研究采用此处所述方法中描述的模块化水凝胶生物墨水系统，以满足上述要求。首先，通过引入来源于特定组织类型细胞外基质（ECM）的生长因子、胶原蛋白、糖胺聚糖（GAGs）和弹性蛋白，可构建出与目标组织类型生化特征相似的生化谱型。其次，通过采用两种相似但相互独立的交联反应，我们能够获得一种柔软且可挤出的材料，该材料适用于大多数基于挤出的生物打印系统，并可通过第二步交联进一步调节，以达到与选定目标组织相匹配的特定材料弹.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
透明质酸	Sigma	53747
明胶	Sigma	G6144
2-羟基-4′-(2-羟基乙氧基)-2-甲基苯丙酮	Sigma	410896
透明质酸和明胶水凝胶试剂盒（HyStem-HP）	ESI-BIO	GS315	试剂盒包含以下组分：Heprasil（巯基化和肝素化透明质酸）、Gelin-S（巯基化明胶）和Extralink（PEGDA）
8臂聚乙二醇炔烃，10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
原代人肝细胞	Triangle Research Labs	HUCPM6
原代人肝星状细胞	ScienCell	5300
原代人库普弗细胞	Life Technologies	HUKCCS
肝细胞基础培养基（HBM）	Lonza	CC-3199
肝细胞培养基补充剂试剂盒	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot试剂盒（包含抗坏血酸0.5 ml；牛血清白蛋白[无脂肪酸]，10 ml；硫酸庆大霉素/两性霉素B，0.5 ml；氢化可的松21-半琥珀酸酯，0.5 ml；胰岛素，0.5 ml；人重组表皮生长因子，0.5 ml；转铁蛋白，0.5 ml）
吐温X-100	Sigma	T9284	其他厂家产品亦可使用。
氢氧化铵	Fischer Scientific	A669	其他厂家产品亦可使用。
新鲜猪尸体组织	n/a	n/a
冷冻干燥机	任意	n/a
冷冻研磨机	任意	n/a
生物打印机	n/a	n/a	本文所述生物打印机为实验室自行定制。通常情况下，其他设备也可使用，只要其支持基于计算机控制的水凝胶材料挤出式打印即可。
悬滴细胞培养板	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D培养平台