生物印刷细胞化构造使用组织特异性水凝胶生物油墨

Summary

我们描述一组一起提供组织模仿水凝胶生物油墨与官能的和可行的3-D组织构建可bioprinted在体外筛选应用中使用的协议。

Abstract

生物打印已成为一种用于创建组织工程器官构建的多功能生物制造方法。这些构建体可能用作植入患者体内的器官替代物，并且在较小尺寸范围内创建为模型"类器官"，可用于体外系统进行药物和毒理学筛选。

尽管开发了各种各样的生物打印设备，但生物打印技术的应用可能会受到现有材料的限制，这些材料既能加快生物打印程序，又能通过提供组织特异性线索来支持细胞活力和功能。在这里，我们描述了一种多功能的透明质酸 （HA） 和基于明胶的水凝胶系统，该系统由多交联剂、2 级交联方案组成，它可以提供组织特异性生化信号并模拟体内组织的机械特性。

生化因子是通过掺入组织来源的细胞外基质材料（包括有效的生长因子）提供的。组织力学性能是具有不同分子量、几何形状（线性或多臂）和官能团的基于 PEG 的交联剂的受控组合，以产生可挤出的生物墨水和较宽范围（100 Pa 至 20 kPa）的最终构建剪切刚度值。使用这些参数，使用水凝胶生物墨水在肝脏特异性生物墨水中生物打印初级肝脏球体，以创建具有高细胞活力和可测量功能性白蛋白和尿素输出的体外肝脏构建体。该方法提供了一个通用框架，可以适应未来用于各种组织构建类型的生物制造的水凝胶定制。

Introduction

近年来，各种各样的技术已经变得可用，通过谋求制造，或biofabricate，他们解决了对功能的器官和组织的替代来源的需求。生物印刷已成为最有希望的，这些技术中的一个。生物印刷可以被认为是生物份的机器人添加剂制造的一种形式，可以使用3维建立或图案上可行的器官样或组织样结构^。1在大多数情况下，生物印刷采用3维（3 -D），其由计算机涉及细胞和生物材料存入的精确位置，从而扼要打印装置解剖学-模仿生理结构^。2这些设备打印"生物油墨"，它可以采取细胞聚集体的形式，包封在水凝胶的细胞或粘性流体或细胞接种微载体，以及无细胞聚合物，其提供机械结构或作为无细胞PLAceholders ^3,4继生物印刷过程中，所得到的结构可以成熟为功能性的组织或器官的结构，并用于其预期的最终应用^。5,6-迄今为止，一个完整的全功能人大小器官尚未印制，但它仍然是生物印刷的研究和开发的主要长期目标^。2然而，小规模的，目前正在在许多应用，包括病理学建模，药物开发和毒理学筛选实施"类器官"组织构建。

一位研究人员在生物印刷应用技术已经遇到的主要障碍是，很少有材料已用于生物印刷的明确目的开发的。要有效地生物印刷成功，生物材料必须符合4个基本要求。生物材料需要有1）的适当的机械性能，以允许沉积（无论是通过一个喷嘴作为凝胶或一个i-挤出nkjet作为液滴），2），以保持它的形状作为淀积后的3-D结构的一个组成部分的....

Protocol

1.水凝胶生物油墨配方及制备方法

1. 为了提供组织特异性生化型材，制备如前对肝所述组织特异性的ECM消化的解决方案^。20
   注意:一般来说，此ECM摘要将包括被使用的最终水凝胶生物油墨体积的40％。的ECM的消化溶液数百毫升可以制备，等分，并在-80℃下以供将来使用冷冻。
2. 到水凝胶制剂，溶解光引发剂，2-羟基-4'前 - 在0.1％的（2-羟基乙氧基）-2-甲基苯丙酮，水重量/体积。
   注意:卷在50-100毫升范围可提前制备，并在4℃避光保存屏蔽几个月。
3. 为了形成水凝胶bioinks，首先溶解在水中，光引发剂溶液的透明质酸（HA）的水凝胶的试剂盒的基材组件。
   1. 分别溶解巯基HA和硫醇盐明胶在水净化hotoinitiator溶液（步骤1.2），以使2％w / v的溶液。
   2. 溶解聚乙二醇二丙烯酸酯（PEGDA），在水凝胶的试剂盒的交联剂，在水 - 光引发剂溶液（步骤1.2），以使8％w / v的溶液。
   3. 在水 - 光引发剂溶液（步骤1.2）溶解聚乙二醇（PEG）8-臂炔（10 kDa的MW），以使8％w / v的溶液。
4. 在一般情况下，形成使用下面的方案水凝胶，虽然附加的定制是可能的。
   1. 结合4份2％的硫醇化的HA，4份2％的硫醇化明胶，1份交联剂1，1份交联剂2与8份组织的ECM溶液和2份肝细胞培养基（HCM）（或10份水作为一种通用的....

Results

当上述过程被正确执行，水凝胶应包含特异于靶组织类型的生物化学信息^，20允许对生物印刷和最终弹性模量^，34的高度控制和支持存活功能性细胞中的组织构建。

水凝胶定制
到最 ​​好的模拟天然肝，水凝胶生物油墨是由肝脏ECM解决方案和生长因子阵列补充 ²⁰ ECM解决方案包含多种生长因子和细胞因子（以pg / ml时， 图1A示出）。这些包括脑源性神经营养因子（BDNF）和bFGF，骨形态发生蛋白5（BMP-5），FGF-4，胰岛素样生长因子结合蛋白2（IGFBP-2），TGF-B1，BMP-7，EGF ，FGF-7，生长激素（GH），肝素结合EGF样生长因子（HB-EGF），肝细胞生长因子和neurotrophin -3（NT-3）。此外，ECM解决方案包含其他结构部件，其通过比色测.......

Discussion

有几个部件是当试图biofabricate三维组织构建，以便最终使用在人类或用于体外筛选应用考虑的关键。使用适当的细胞成分决定了端电位的功能，而生物制造装置本身确定的通用方法用于到达末端构建体。第三成分，该生物材料，是同样重要的，因为它提供双重角色。具体地，生物材料组件必须与两个生物制造硬件（ 即 ，bioprinters），并且还支持潜在脆弱生物细胞组分相容。优化这两个要求是很困难的，因为bioprintable材料需要满足几个关键参数:1）具有相应的化学，机械，和时间特性以利于有效和未支配印刷; 2）在准备阶段，bioprin支持细胞活力婷程序; 3），并提供最能增强细胞活力及以下生物印刷最终组织构建功能的好客的环境。我们采用在这里所描述满足这些要求的方法所描述的模块化的水凝胶生物油墨系统。首先，通过将生长因子，胶原，聚糖，和来自特定组织类型的ECM来源弹性蛋白，就可以实现一种生化信息是令人联想到靶组织类型的。第二，通过采用2相似，但独立的交联反应，我们能够实现软挤出材料，其是与大多数挤压型，它可与所述第二交联步骤可以进一步改变，以达到符合目标的确定的材料的弹性模量兼容选择的组织^{。34<.......}

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
透明质酸	Sigma	53747
明胶	Sigma	G6144
2-羟基-4′-（2-羟乙氧基）-2-甲基苯丙酮	Sigma	410896
透明质酸和明胶水凝胶试剂盒 （HyStem-HP）	ESI-BIO	GS315	试剂盒包含成分 Heprasil（硫醇化和肝素化透明质酸）、Gelin-S（硫醇化明胶）和 Extralink （PEGDA）
PEG 8 臂炔烃，10 kDa	Creative PEGWorks	PSB-887
原代人肝细胞	三角研究实验室	HUCPM6
原代人肝星状细胞	ScienCell	5300
原代人库普弗细胞	Life Technologies	HUKCCS
肝细胞基础培养基 （HBM）	Lonza	CC-3199
肝细胞培养基补充套件	Lonza	CC-3198	HCM SingleQuot 套件（含有抗坏血酸，0.5 毫升;牛血清白蛋白 [不含脂肪酸]，10 毫升;硫酸庆大霉素/两性霉素 B， 0.5 毫升;氢化可的松 21-半琥珀酸酯，0.5 毫升;胰岛素，0.5 毫升;人重组表皮生长因子，0.5 毫升;转移， 0.5 ml）
Triton X-100	Sigma	T9284	其他制造商还可以。
氢氧化铵	Fischer Scientific	A669	其他制造商还可以。
新鲜猪尸体组织	n/a	n/a
冻干机	任何	n/a
冷冻磨	任何	n/a
生物打印机	n/a	n/a	此处描述的生物打印机是内部定制的。一般来说，其他设备只要支持基于计算机控制的基于挤压的水凝胶材料打印就足够了。
悬滴式细胞培养板	InSphero	CS-06-001	InSphero GravityPlus 3D 培养平台