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方法文章

c-FOS蛋白免疫组织化学检测：作为标记特定生理反应相关中枢通路的有效工具 在体 内 和 离体

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DOI：

10.3791/53613

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2016年4月25日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Sorbonne Paris Cité, Laboratory “Hypoxia & Lung” EA2363, University Paris 13, 2UPMC Univ Paris 06, INSERM, UMR_S1158 Neurophysiologie Respiratoire Expérimentale et Clinique, Sorbonne Universités, 3Laboratory of Excellence GR-Ex, 4Laboratory MOVE (EA 6314), University of Poitiers

本文内容

摘要

本文介绍了一种基于c-FOS蛋白免疫组织化学检测的实验方案，该技术是一种经典方法，用于鉴定参与特定生理反应的神经元群体 体内 和 离体.

摘要

许多研究致力于识别并绘制参与特定生理调节的脑区。原癌基因 c-fos即刻早期基因 c-FOS 会在神经元受到多种刺激后表达。其蛋白产物可通过免疫组织化学技术 readily 检测，因此常利用 c-FOS 的检测来定位活动发生改变的神经元群体。本文重点探讨参与低氧或高碳酸血症通气适应的脑干神经元群体的鉴定。文中描述了两种用于鉴定相关神经元群体的方法。 体内 在动物中 离体 在去传入性脑干制备中。 体内动物被暴露于高碳酸气体或低氧气体混合物中。 离体，去传入性神经支配的制备标本用低氧或高碳酸人工脑脊液进行表面灌流。在这两种情况下，均分别设置对照 体内 动物或 离体 在常氧和常二氧化碳条件下维持制备样本。通过比较这两种方法，可确定神经元激活的来源。 即，周围和/或中枢。 在体 和 离体脑干被采集、固定并切片。切片制备完成后，通过免疫组织化学方法检测c-FOS蛋白，以鉴定在低氧或高碳酸血症刺激下被激活的脑干细胞群。在脑干呼吸相关结构中对标记细胞进行计数。与对照条件相比，低氧或高碳酸血症增加了多个特定脑干区域中c-FOS标记细胞的数量，表明这些区域构成了参与中枢呼吸驱动适应的神经通路组成部分。

引言

c-fos 该基因于1980年代初首次被鉴定1,2 其产物于1984年被鉴定为一种具有基因激活特性的核蛋白3,4它参与了与神经元刺激相关的长期机制。事实上，神经元刺激引起的某些变化 神经元活动引发第二信使信号级联反应，从而诱导即刻早期基因的表达 c-fos 可诱导转录因子 c-FOS 的产生。后者启动晚期基因的表达，从而参与 神经系统对多种不同类型刺激的适应性反应4因此，自20世纪80年代末以来5,6c-FOS蛋白检测常被用于研究外源性因素对基因转录的普遍影响4 以及中枢神经系统（CNS）的活动，以绘制参与不同生理状态的神经通路。

基础状态下的 c-fos 表达已在多种物种中得到研究，包括小鼠、大鼠、猫、猴和人类4。因此，其表达动力学已相对明确。转录激活迅速（5 至 20 分钟）7,8，mRNA 积累在刺激开始后 30 至 45 分钟达到峰值9，并以约 12 分钟的短半衰期迅速下降。c-FOS 蛋白的合成紧随 mRNA 积累之后，可在刺激后 20 至 90 分钟 通过免疫组织化学方法检测到6。

分析 c-fos 表达在经典上常用于 体内 研究旨在确定参与低氧或高碳酸血症通气反应的中枢呼吸网络10-14最近，该工具也被用于 离体 脑干制备物用于研究中枢呼吸网络对低氧或高碳酸血症的适应性15-18确实，这些制备能够产生一种节律性活动，传统上将其等同于中枢呼吸驱动19因此，这种制备方法的优势在于完全去除了传入神经支配，从而在相关研究中获得的结果 c-fos 表达仅反映中枢刺激的后果，而不涉及任何外周结构的干预。

c-FOS 的检测可通过免疫组织化学或免疫组织荧光方法进行。间接免疫检测需要使用针对 c-FOS 的一抗以及针对一抗来源物种的二抗。在免疫组织化学方法中，二抗与一种酶（例如过氧化物酶）偶联，该酶作用于底物（如过氧化物酶作用于 H2O2）。酶促反应的产物通过生色剂（如 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐）显色，可在光学显微镜下观察。可使用硫酸镍铵增强反应信号。这些方法可用于检测在不同生理刺激过程中被激活的神经元，从而实现对参与相应生理反应的外周和中枢通路的识别和/或定位。

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方案

注意：c-FOS 检测是一种标准化的程序，包含多个步骤（图1）。所有实验均在大鼠或小鼠上进行。实验方案经查尔斯·达尔文动物实验伦理委员会（Ce5/2011/05）批准，遵循2010年9月22日欧洲共同体理事会关于动物保护的指令（2010/63/EU），并依照法国动物护理法律法规实施。

1. 溶液的配制

  1. 制备 0.2 M 磷酸钠缓冲液：加入 6.24 g NaH₂PO₄2PO4*2H2O 和 22.56 g Na2HPO4H*2在搅拌的同时加入 0 至 1 L 蒸馏水。
  2. 配制4%多聚甲醛（PFA）：将20 g多聚甲醛加入150 ml水中 蒸馏水。在搅拌的同时将溶液加热至 80 °C。为澄清溶液，调低温度并加入 1 至 2 滴 1 N NaOH 以助溶解 多聚甲醛溶解，用蒸馏水定容至250 mL，再加入250 mL 0.2 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。4 °C 保存。使用这些试剂时应采取适当防护措施。操作时佩戴手套和实验服， 在化学通风橱内佩戴安全护目镜。
    注意：在灌注前一天配制4% PFA。根据动物的年龄、数量和物种确定4% PFA的体积。
  3. 配制冷冻保护液：在250 ml 0.2 M 磷酸盐缓冲液中，加入 5 g 聚乙烯吡咯烷酮、150 g 蔗糖和 2.5 g 氯化钠。待完全溶解后，加入 150 ml 乙二醇并定容至500 ml 用蒸馏水。将冷冻保护液在 4 °C 下保存。
  4. 配制0.1 M磷酸盐缓冲液（PBS）：在搅拌条件下，将18 g NaCl加入1 L蒸馏水中。待完全溶解后，加入1 L 0.2 M磷酸钠缓冲液。
  5. 配制含 0.3% Triton X100 的磷酸盐缓冲液（PBST）：加入 3 ml 的Triton X100加入至997 ml PBS。
  6. 配制 0.05 M Tris-缓冲液（pH 7.6）：将 3.03 g Tris-盐酸盐和 0.70 g Tris-碱加入 500 ml 水中 蒸馏水，同时搅拌。
  7. 用PBST配制2%的山羊血清：每块板需配制30 ml 溶液。加入 600 µl 山羊血清至30 ml PBST 并充分混匀。加入 2.5 ml 每孔
    注意：所使用的血清必须来源于用于生产二抗的物种
  8. 用含牛血清白蛋白（0.25%）的PBST稀释兔多克隆抗体抗c-FOS蛋白（1:4000，sc-52），每板配制30 ml 溶液中。将75 mg牛血清白蛋白加入30 ml PBST 并充分混匀。然后，加入 7.5 µl 兔抗c-FOS蛋白多克隆抗体
  9. 用含0.25%牛血清白蛋白的PBST缓冲液稀释生物素化山羊抗兔抗体（1:500）。每块板准备30 ml 溶液中。将75 mg牛血清白蛋白加入30 ml PBST 并充分混匀。然后，加入 60 µl 生物素标记的山羊抗兔抗体
  10. 在PBST中配制亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（1:250）（ABC溶液）。每块板准备30 ml 溶液中。加入 120 µl 试剂A的量和120 µl 将试剂B加入30 ml PBST 中并充分混匀。
    注意：ABC溶液必须至少提前30分钟配制 使用前
  11. 制备底物溶液。 使用前立即按下述方法配制溶液（适用于一块板）：加入20 mg硫酸镍铵 以及将10 mg的3.3-二氨基联苯胺四盐酸盐加入50 ml Tris缓冲液。过滤并避光保存。加入2.0 ml 每孔。在剩余的溶液（25 ml）中加入17 µl H的2O2 (H2O2 30% H 溶液2O）。加入 2.0 ml 每孔
    注意：使用这些试剂时应采取适当的防护措施。操作时需佩戴手套和实验服。

2. c-fos 诱导及体内组织处理 In Vivo

注意：实验在大鼠（Sprague Dawley）或小鼠（C57BL/6）中进行。

  1. 将动物置于密闭箱中，通入低氧（O2 8%，N2 平衡）或高碳酸（CO2 4%，O2 21%，N2 平衡）气体混合物，持续 2 小时 （图 2A）。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥（100 mg/kg）对动物进行麻醉。经心脏灌注 4% 多聚甲醛20。操作时需小心，并在化学通风橱内戴手套进行。
  3. 灌注完成后，取出脑组织20 ，将其完全浸入装有 7 ml 4% 多聚甲醛的 15 ml 离心管中，在 4 °C 下固定 48 小时 。随后 将脑组织从多聚甲醛中取出，完全浸入冷冻保护液中，于 -18 °C 保存（图 3）。其余动物尸体应通过适当的废弃物处理途径进行处置。
    注意：冷冻保护是多聚甲醛固定与冷冻之间的步骤，通过使用可形成非晶态冰的溶液减少细胞内冰晶的形成。固定后的样本必须在冷冻保护液（按步骤 1.3 配制）中浸渍至少 24 小时 ，温度为 4 °C。操作时需小心，并在化学通风橱内戴手套进行。

3. c-fos 诱导及离体组织 处理 Ex Vivo

注意：实验仅在新生大鼠或小鼠中进行。

  1. 按照Suzue所述方法分离中枢神经系统19将其置于记录室中，并持续用人工脑脊液进行灌流。 以 7.5 ml/min 的流速在 26 °C 下 21 （人工脑脊液，aCSF，单位：mM：130.0 NaCl，5.4 KCl，0.8 CaCl₂）2，1.0 MgCl2，26.0 NaHCO₃3，30.0 D-葡萄糖；用O₂饱和2 并通过通入95% O₂调节pH至7.42 和5% CO2) (图 2B).
  2. 用 aCSF 替换 脱氧aCSF（相同成分，用95% N₂混合5% CO₂气体饱和）2 和5% CO2，pH 7.4）用于缺氧条件，或通过酸化aCSF（标准aCSF中加入NaHCO₃调节pH）3 降至10.0 mM，用95% O₂2 和5% CO₂2）以诱导高碳酸血症。持续刺激 30 分钟（图2B）.
  3. 离体，诱导期结束后，将新生小鼠或大鼠的中枢神经系统组织转移至2.5 ml 4% PFA 溶液中的 2.5 ml 48 小时管中培养 并在-18 °C条件下用冷冻保护液保存以备后续使用（图3).
    注意： 离体，无需对动物进行灌注。先前的研究表明，直径小于10 mm的小型样本可以 通过简单扩散固定22醛类固定剂的渗透速率（固定剂扩散进入组织的距离，单位为 mm）约为 2 或 3 mm/hr。

4. 脑干切片

注意：从本步骤开始直至结束，该实验方案对所有样本均完全相同 体内 和 离体 诱导。

  1. 切片前，将一个单独的插件放入12孔板中，并在每个孔中加入2.5 ml PBS。
  2. 使用冷冻切片机对脑干进行连续冠状切片（40 µm），并将切片收集到 12孔板中。对于完整的成年脑干，大约制作70片切片（图3）。
    注意：可以在一个孔板中同时对来自 多个动物的组织进行切片。

5. 免疫组织化学实验步骤（表1）

注意：在整个操作过程中，切片始终保留在孔板插件中。

  1. 第1天——内源性过氧化物酶活性灭活、非特异性结合位点封闭及与一抗孵育（图4）
    1. 将切片洗涤 10 分钟 在室温下用 0.1 M PBS 冲洗 （2.5 ml 每孔重复3次。
    2. 通过将冠状切片孵育30分钟以抑制内源性过氧化物酶活性 在室温下用过氧化氢 H2O2，0.1 M PBS 中的 3%（2.5 ml） 每孔
    3. 将切片洗涤10分钟 用0.1 M PBS在室温下孵育（2.5 ml） 每孔重复3次。
    4. 用含2%山羊血清的PBST在室温下孵育冠状切片1小时，以封闭非特异性结合位点。
    5. 在含有牛血清白蛋白（0.25%）的PBST中，加入针对c-FOS蛋白的兔多克隆抗体（1:4000，sc-52），于4 °C孵育冠状切片48小时（2.5 ml） 每孔
  2. 第3天——与二抗孵育及显色反应的显色（图4）
    1. 将切片洗涤10分钟 用0.1 M PBS在室温下孵育（2.5 ml 每孔）。重复3次。
    2. 在室温下，用含0.25%牛血清白蛋白的PBST缓冲液稀释的生物素化山羊抗兔抗体（1:500），孵育冠状切片1小时（2.5 ml） 每孔
      注意：研究者还可以 此时使用与荧光探针偶联的二抗。在此情况下，停止实验步骤，直接用荧光显微镜观察。
    3. 将切片洗涤10分钟 在室温下用 PBST 洗涤（2.5 ml 每孔重复3次。
    4. 在PBST（2.5 ml）中，将冠状切片与亲和素-生物素-过氧化物酶复合物（1:250）于室温孵育1小时 每孔
    5. 将切片洗涤10分钟 在室温下用 PBST 洗涤（2.5 ml） 每孔）。重复2次。
    6. 将切片洗涤10分钟 用 0.05 M Tris-缓冲液在室温下（2.5 ml） 每孔）。重复2次。
    7. 在室温下，将冠状切片与0.02% 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐、0.04% 硫酸镍铵和0.01% 过氧化氢溶于0.05 M Tris缓冲液（pH 7.6）中孵育（2.0 ml） 每孔）。在剩余的溶液（25 ml）中加入 17 µl H2O2 (H2O2 30% H 溶液2O)（2.0 ml 每孔
      注意：研究者应在光学显微镜下确定发育时间。然而，5至10分钟 提供良好的染色强度。
    8. 当染色强度达到最佳时（在光学显微镜下控制，参见 图5 和 图6），通过用溶液清洗切片10分钟来终止反应 用0.1 M PBS在室温下孵育（2.5 ml 每孔重复4次。然后用蒸馏水洗涤切片。
  3. 样品安装（在化学通风橱内戴手套小心操作）
    1. 将切片按顺序贴附于载玻片上并自然晾干。操作时，用毛笔小心地将切片按头尾方向依次展开排列在载玻片上。根据样品清晰标记载玻片。
    2. 用无水乙醇脱水：将玻片浸入30秒 在室温下 在无水乙醇浴中重复两次。
    3. 用二甲苯透明：将切片浸入二甲苯溶液中 3 分钟 室温下重复两次。
    4. 用封片剂封片。具体操作为：在载玻片上滴加5滴封片剂，然后盖上盖玻片，排除气泡。室温下干燥48小时。

6. 数据与统计分析

  1. 在光学显微镜下观察切片。利用标准解剖标志，在高倍镜（200×）下对FLI神经元进行目视计数23,24。c-Fos的点状染色定位于神经元细胞核内。
  2. 对每个分析区域，统计每张切片中c-FOS阳性细胞的数量，并比较对照组与刺激组之间的平均值。根据数据的正态性，采用非配对student's t检验或Mann-Whitney检验进行分析。当P<0.05时，认为差异具有统计学意义。使用显微镜配备的绘图管将FLI神经元的分布绘制在图上（放大倍数100×），并用数码相机拍照记录（图5）。

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结果

c-FOS 检测是一种有用的工具，可用于在低氧和高碳酸血症等特定条件下识别被激活的细胞群 体内 (图2A）或在模拟这些条件的情况下 离体 (图2B). 在体将新生、幼年或成年啮齿类动物置于密闭箱中，箱内气体环境通过成分精确设定的混合气体持续更新，持续时间为30至180分钟13,25,26 (图 2A由于刺激作用于全身，相关的c-FOS变化可能反映中枢和外周激活的通路。 离体, 包含延髓和脊髓的去传入制备被置于一个持续用不同氧浓度 aCSF 灌流的 chamber 中2 或调节pH以模拟缺氧或高碳酸血症条件（图2B30 分钟16-18,27由于刺激仅在这些去传入准备中起作用，因此可以得出结论：c-FOS 鉴定出的结构中细胞的激活仅涉及中枢机制。

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讨论

c-fos 是一种即刻早期基因，其产物 c-FOS 蛋白的检测通常用于鉴定参与特定呼吸反应的神经元群体，无论是在 体内11,13,25,28 还是 离体16-18,27,32,33 条件下。

方案中的关键步骤

灌注步骤需谨慎操作。4% PFA 溶液必须充分配制，固定和后固定步骤必须足够长时间，以获得最佳切片和染色效果。此外，显色是该实验流程中最为关键的步骤；应控制染色强度，避免背景噪音。

该技术的优势及其相对于现有方法的重要性

尽管某些神经元似乎不表达 c-fos 基因5，但该方法已被证明可用于确定在化学刺激条件下呼吸节律适应过程中被激活的神经通路。与其他即早基因相比，在无刺激状...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了巴黎第十三大学的支持。ASPT 获得了巴黎第十三大学博士后奖学金以及“法国 Ondine 综合征协会”的资助。FJ 获得了卓越实验室 GR-Ex 博士后奖学金的支持。GR-Ex（项目编号 ANR-11-LABX-0051）由法国国家科研署“未来投资计划”（项目编号 ANR-11-IDEX-0005-02）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
12孔细胞培养板科斯塔35/3
15 mm 带网状聚酯膜的Netwell插件康宁347715毫米直径的培养小室含有74µ聚苯乙烯插件连接的聚酯纤维网底
一抗（兔抗c-Fos蛋白多克隆抗体）Santa Cruz Biotechnologysc-52
Vectastain Elite ABC试剂盒 Vector LaboratoriesPK-6101
（兔IgG二抗）
NaH2PO4*2H2OSigma71505
Na2HPO4SigmaS7907
多聚甲醛SigmaP6148
0.1N NaOHSigma43617
聚乙烯吡咯烷酮SigmaPVP-360
蔗糖SigmaS7903
NaClSigmaS7653
乙二醇Sigma33068
Triton X100SigmaT8787
Trisma HClSigmaT5941
Trisma BaseSigmaT1503
3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐 RocklandDAB50
硫酸镍铵Alfa Aesar12519
H2O2SigmaH1009
二甲苯Sigma33817
Entellan Neo默克密理博107961
载玻片 赛默飞世尔科技1014356190Superfrost ultraplus
盖玻片赛默飞世尔科技Q10143263NR124 x 60毫米
BSASigmaA2153

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