本文介绍了一种基于c-FOS蛋白免疫组织化学检测的实验方案，该技术是一种经典方法，用于鉴定参与特定生理反应的神经元群体 体内 和 离体.
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本文内容
摘要
摘要
许多研究致力于识别并绘制参与特定生理调节的脑区。原癌基因 c-fos即刻早期基因 c-FOS 会在神经元受到多种刺激后表达。其蛋白产物可通过免疫组织化学技术 readily 检测，因此常利用 c-FOS 的检测来定位活动发生改变的神经元群体。本文重点探讨参与低氧或高碳酸血症通气适应的脑干神经元群体的鉴定。文中描述了两种用于鉴定相关神经元群体的方法。 体内 在动物中 离体 在去传入性脑干制备中。 体内动物被暴露于高碳酸气体或低氧气体混合物中。 离体，去传入性神经支配的制备标本用低氧或高碳酸人工脑脊液进行表面灌流。在这两种情况下，均分别设置对照 体内 动物或 离体 在常氧和常二氧化碳条件下维持制备样本。通过比较这两种方法，可确定神经元激活的来源。 即，周围和/或中枢。 在体 和 离体脑干被采集、固定并切片。切片制备完成后，通过免疫组织化学方法检测c-FOS蛋白，以鉴定在低氧或高碳酸血症刺激下被激活的脑干细胞群。在脑干呼吸相关结构中对标记细胞进行计数。与对照条件相比，低氧或高碳酸血症增加了多个特定脑干区域中c-FOS标记细胞的数量，表明这些区域构成了参与中枢呼吸驱动适应的神经通路组成部分。
引言
c-fos 该基因于1980年代初首次被鉴定1,2 其产物于1984年被鉴定为一种具有基因激活特性的核蛋白3,4它参与了与神经元刺激相关的长期机制。事实上，神经元刺激引起的某些变化 神经元活动引发第二信使信号级联反应，从而诱导即刻早期基因的表达 c-fos 可诱导转录因子 c-FOS 的产生。后者启动晚期基因的表达，从而参与 神经系统对多种不同类型刺激的适应性反应4因此，自20世纪80年代末以来5,6c-FOS蛋白检测常被用于研究外源性因素对基因转录的普遍影响4 以及中枢神经系统（CNS）的活动，以绘制参与不同生理状态的神经通路。
基础状态下的 c-fos 表达已在多种物种中得到研究，包括小鼠、大鼠、猫、猴和人类4。因此，其表达动力学已相对明确。转录激活迅速（5 至 20 分钟）7,8，mRNA 积累在刺激开始后 30 至 45 分钟达到峰值9，并以约 12 分钟的短半衰期迅速下降。c-FOS 蛋白的合成紧随 mRNA 积累之后，可在刺激后 20 至 90 分钟 通过免疫组织化学方法检测到6。
分析 c-fos 表达....
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方案
注意：c-FOS 检测是一种标准化的程序，包含多个步骤（图1）。所有实验均在大鼠或小鼠上进行。实验方案经查尔斯·达尔文动物实验伦理委员会（Ce5/2011/05）批准，遵循2010年9月22日欧洲共同体理事会关于动物保护的指令（2010/63/EU），并依照法国动物护理法律法规实施。
1. 溶液的配制
- 制备 0.2 M 磷酸钠缓冲液：加入 6.24 g NaH₂PO₄2PO4*2H2O 和 22.56 g Na2HPO4H*2在搅拌的同时加入 0 至 1 L 蒸馏水。
- 配制4%多聚甲醛（PFA）：将20 g多聚甲醛加入150 ml水中 蒸馏水。在搅拌的同时将溶液加热至 80 °C。为澄清溶液，调低温度并加入 1 至 2 滴 1 N NaOH 以助溶解 多聚甲醛溶解，用蒸馏水定容至250 mL，再加入250 mL 0.2 M 磷酸盐缓冲液（pH 7.4）。4 °C 保存。使用这些试剂时应采取适当防护措施。操作时佩戴手套和实验服， 在化学通风橱内佩戴安全护目镜。
注意：在灌注前一天配制4% PFA。根据动物的年龄、数量和物种确定4% PFA的体积。 - 配制冷冻保护液：在250 ml 0.2 M....
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结果
c-FOS 检测是一种有用的工具，可用于在低氧和高碳酸血症等特定条件下识别被激活的细胞群 体内 (图2A）或在模拟这些条件的情况下 离体 (图2B). 在体将新生、幼年或成年啮齿类动物置于密闭箱中，箱内气体环境通过成分精确设定的混合气体持续更新，持续时间为30至180分钟13,25,26 (图 2A由于刺激作用于全身，相关的c-FOS变化可能反映中枢和外周激活的通路。 离体, 包含延髓和脊髓的去传入制备被置于一个持续用不同氧浓度 aCSF 灌流的 chamber 中2 或调节pH以模拟缺氧或高碳酸血症条件（图2B30 分钟16-18,27由于刺激仅在这些去传入准备中起作用，因此可以得出结论：c-FOS 鉴定出的结构中细胞的激活仅涉及中枢机制。
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讨论
c-fos 是一种即刻早期基因，其产物 c-FOS 蛋白的检测通常用于鉴定参与特定呼吸反应的神经元群体，无论是在 体内11,13,25,28 还是 离体16-18,27,32,33 条件下。
方案中的关键步骤
灌注步骤需谨慎操作。4% PFA 溶液必须充分配制，固定和后固定步骤必须足够长时间，以获得最佳切片和染色效果。此外，显色是该实验流程中最为关键的步骤；应控制染色强度，避免背景噪音。
该技术的优势及其相对于现有方法的重要性
尽管某些神经元似乎不表达 c-fos 基因5，但该方法已被证明可用于确定在化学刺激条件下呼吸节律适应过程中被激活的神经通路。与其他即早基因相比，在无刺激状.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了巴黎第十三大学的支持。ASPT 获得了巴黎第十三大学博士后奖学金以及“法国 Ondine 综合征协会”的资助。FJ 获得了卓越实验室 GR-Ex 博士后奖学金的支持。GR-Ex（项目编号 ANR-11-LABX-0051）由法国国家科研署“未来投资计划”（项目编号 ANR-11-IDEX-0005-02）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 12孔细胞培养板 | 科斯塔 | 35/3 | |
| 15 mm 带网状聚酯膜的Netwell插件 | 康宁 | 3477 | 15毫米直径的培养小室含有74µ聚苯乙烯插件连接的聚酯纤维网底 |
| 一抗（兔抗c-Fos蛋白多克隆抗体） | Santa Cruz Biotechnology | sc-52 | |
| Vectastain Elite ABC试剂盒 | Vector Laboratories | PK-6101 | |
| （兔IgG二抗） | |||
| NaH2PO4*2H2O | Sigma | 71505 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S7907 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| 0.1N NaOH | Sigma | 43617 | |
| 聚乙烯吡咯烷酮 | Sigma | PVP-360 | |
| 蔗糖 | Sigma | S7903 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| 乙二醇 | Sigma | 33068 | |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | |
| Trisma HCl | Sigma | T5941 | |
| Trisma Base | Sigma | T1503 | |
| 3,3-二氨基联苯胺四盐酸盐 | Rockland | DAB50 | |
| 硫酸镍铵 | Alfa Aesar | 12519 | |
| H2O2 | Sigma | H1009 | |
| 二甲苯 | Sigma | 33817 | |
| Entellan Neo | 默克密理博 | 107961 | |
| 载玻片 | 赛默飞世尔科技 | 1014356190 | Superfrost ultraplus |
| 盖玻片 | 赛默飞世尔科技 | Q10143263NR1 | 24 x 60毫米 |
| BSA | Sigma | A2153 |
参考文献
- Curran, T., Teich, N. M. Identification of a 39,000-dalton protein in cells transformed by the FBJ murine osteosarcoma virus. Virology. 116, 221-235 (1982).
- Curran, T., MacConnell, W. P., van Straaten, F., Verma, I. M.
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重印与许可
