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方法文章

日本鹌鹑胚胎卵黄囊膜原代内胚层上皮细胞培养

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DOI：

10.3791/53624

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2016年3月10日

 ,  ,  , 
1Department of Animal Science and Technology, National Taiwan University

本文内容

摘要

为了研究鸟类胚胎发育后期卵黄囊膜中脂质利用的机制，我们建立了一种日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞的原代培养体系。

摘要

我们建立了一种内胚层上皮细胞培养模型（EEC），用于研究特定酶和蛋白质在鸟类胚胎发育过程中介导营养物质利用的功能。将受精的日本鹌鹑卵在37 °C条件下孵育5天后，收集卵黄囊膜（YSM）以建立EEC培养体系。从YSM中分离出胚胎内胚层，将膜切成2–3 mm大小的组织块，经胶原酶部分消化后接种于24孔培养板中。EECs从组织块中增殖迁移而出，可用于细胞培养研究。我们发现，EECs具有YSM的典型特征 体内例如脂滴的积累、固醇O-酰基转移酶和脂蛋白脂肪酶的表达。部分消化处理显著提高了肠上皮细胞（EEC）培养的成功率。利用所获得的EECs，我们证实SOAT1的表达受cAMP依赖性蛋白激酶A相关通路的调控。该原代日本鹌鹑EEC培养体系是研究胚胎期脂质转运以及阐明在鸟类胚胎发育过程中卵黄囊膜（YSM）介导营养物质利用相关基因功能的有力工具。

引言

禽类胚胎的主要营养来源是卵黄，其成分为33%的脂质、17%的蛋白质和1%的灰分。1 在胚胎发育过程中，卵黄囊膜（YSM）从胚胎腹腔内开始生长，并逐渐覆盖卵黄表面。自胚胎发育第2天起，YSM中与脂质代谢和血管生成相关的基因表达逐渐增强，同时YSM缓慢形成绒毛样突起。8,9 这些突起可增加对卵黄营养物质的吸收，以支持胚胎发育。YSM是一种胚外组织，包含内胚层、中胚层和外胚层三个胚层。14 卵黄囊外胚层面向蛋清，并与卵黄膜相连，轻柔地覆盖在卵黄囊表面。内胚层上皮细胞则直接面向卵黄，作为营养物质利用的门户。6 随着YSM的扩展，内胚层上皮细胞（EECs）可根据形态和功能分为两个区域：卵黄区（area vitelline）和血管区（area vasculosa）。7

卵黄区由内胚层细胞组成，位于远离胚胎的位置；血管区由中胚层细胞组成，并覆盖有分化后的卵黄囊内胚层上皮细胞（EEC），其上分布有血管和结缔组织。至胚胎发育第5天，卵黄已完全被卵黄囊外胚层和内胚层覆盖，血管区域也迅速扩展。卵黄囊外胚层（YSM）吸收、重组并将脂质（以卵黄来源的极低密度脂蛋白形式）和蛋白质释放到胚胎循环系统中9, 2。因此，我们建立了一种日本鹌鹑胚胎内胚层上皮细胞的原代培养体系，用于研究鸟类胚胎发育过程中卵黄囊外胚层（YSM）脂质利用的机制。

甘油三酯、卵磷脂、磷脂和胆固醇酯（CE）等脂质是禽类胚胎的主要能量来源。在发育早期，卵黄脂质中仅含有1.3%的CE，至禽类胚胎发育中期则上升至10-15%3, 11。胆固醇酯由禽类胚胎卵黄囊膜中的固醇O-酰基转移酶1（SOAT1）催化胆固醇合成4。

胆固醇的储存形式是胆固醇酯（CE），CE由脂蛋白携带，并通过循环系统运输至各组织13。在孵化前一周，禽类胚胎迅速生长，此阶段约有68%的卵黄残留脂质被吸收10。通过体外胚胎绒毛尿囊膜培养（EEC）研究模型，可阐明卵黄脂质利用的机制。为此研究目标，已建立鸡胚EEC培养方案2, 9。然而，由于组织外植体的成功率较低，亟需改进EEC细胞培养方法，以研究特定酶和蛋白质在禽类胚胎发育过程中介导营养物质利用的功能。

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方案

注意：本实验步骤改编自 Bauer et al. 2013 年和 Nakazawa et al. 2011 年建立的鸡胚模型培养方案2,9。

1. 从日本鹌鹑中获取健康的孵化第5天胚胎

  1. 将1只雄性与3只雌性性成熟的日本鹌鹑共同置于同一笼中饲养，提供饲料和饮水 随意摄取将动物房的光照调节为14小时光照和10小时黑暗。
  2. 每天下午用塑料袋收集受精卵，并置于16 °C冰箱中以减缓胚胎发育速度。
  3. 在两周内收集到足够数量的卵后，将受精卵置于通风良好的37 °C培养箱中孵育五天。

2. 准备基础培养基和洗涤溶液

  1. 使用 DMEM/F-12 培养基（调节至 pH 7.2）作为生长培养基，并添加 10% 新生牛血清（NBCS）和 1% 青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液（PSA；青霉素，105 单位/L；链霉素，100 mg/L；两性霉素 B，0.25 mg/L）。
  2. 配制 10 倍浓度的磷酸盐缓冲液（PBS）用于储存；使用 1 倍 PBS 溶液（含 NaCl，137.93 mM；KCl，2.667 mM；KH2PO4，1.471 mM；Na2HPO4-7H2O，8.06 mM；调节至 pH 7.2）在分离内胚层与卵黄及卵白时洗涤并润湿卵黄囊膜。
  3. 使用 DMEM 培养基（调节至 pH 7.2）重悬内胚层沉淀。

3. 从日本鹌鹑卵黄囊膜中收集原代 EECs

  1. 将收集的鸡蛋在 5 天内进行孵育（步骤 1.3）。使用验卵灯检查鸡蛋，以确认胚胎发育正常。
    注意：在胚胎发育第 5 天，卵黄囊中胚层的边界非常清晰，且三个胚胎层之间的连接较松散，因此易于获取内胚层。仅使用表现出正常毛细血管循环发育的鸡蛋进行卵黄囊中胚层（YSM）的收集。
  2. 用新鲜水和 75% 乙醇小心清洁蛋壳。用剪刀从气室位置打开蛋壳，用镊子轻轻剥离并完整取出卵黄囊中胚层（YSM），放入盛有 37°C 1× PBS 的 10 cm 培养皿中。
  3. 使用剪刀去除胚胎、卵黄和蛋白，并用 1× PBS 轻柔清洗卵黄囊中胚层（YSM）三次，然后将卵黄囊中胚层（YSM）置于 PBS 溶液中，放入 10 cm 培养皿内。
  4. 使用镊子和剪刀从卵黄囊中胚层（YSM）上去除外胚层。使用两把镊子，一把牢固夹住内胚层细胞层，另一把夹住毛细血管中胚层。
  5. 在解剖显微镜下，从靠近胚胎的一侧开始，沿中胚层边缘将内胚层轻轻撕离并分离。用移液器收集淡黄色的内胚层，放入 50 ml 离心管中，并转移至含有 15 ml 培养基的 37 °C 水浴中，直至完成全部组织收集。

4. 胶原酶消化法消化内胚层切片

  1. 将 6.5 单位的 IV 型胶原酶新鲜溶解于 10 ml DMEM 中。
  2. 在室温下以 130 × g 离心 50 ml 离心管（3.4）3 分钟。吸除上清液，并用移液器将所有内胚层组织转移至一个 6 cm 培养皿中。向该培养皿中加入 1 ml 胶原酶溶液。
  3. 用一对弯头剪刀将来自 2 枚鹌鹑胚胎的内胚层组织切成碎片，使每片大小约为 2 至 3 mm。使用滴管将所有组织碎片连同 9 ml 新鲜胶原酶溶液一起收集至一个 50 ml 离心管中。
  4. 在 37 °C、175 rpm 摇动水浴中用胶原酶消化组织 30 分钟。此部分消化步骤旨在促进外植体细胞的增殖。
  5. 在室温下以 130 × g 离心 3 分钟，用移液器轻柔地移除上清液。用 20 ml DMEM 重悬沉淀进行洗涤，然后在 130 × g 条件下离心 3 分钟后再次移除上清液。
  6. 用 12 ml 生长培养基（DMEM/F12 加 10% NBCS 和 1% PSA）重悬沉淀，并轻轻且均匀地接种至 24 孔板中（每孔加入 500 µl 细胞悬液）。
  7. 将组织外植体在 37 °C、5% CO2 空气氛围中孵育 2 天，以允许细胞从组织中迁移并增殖。
  8. 继续将细胞孵育 2 天，并按照细胞活力检测方案进行细胞活力表征。15
    注意：活细胞在其胞质溶胶内维持还原性环境。刃天青（resazurin）是该检测中的活性成分，为一种无毒且可穿透细胞的蓝色化合物，几乎无荧光。当添加至细胞培养物中时，刃天青在胞质溶胶中被线粒体酶还原为试卤灵（resorufin）。试卤灵呈红色且具有强荧光。活细胞持续将刃天青转化为试卤灵，从而增加细胞周围培养基的整体荧光强度和颜色变化。
  9. 按照所述方法进行内胚层上皮细胞总 RNA 提取、逆转录及标志基因 mRNA 表达的定量实时 PCR 分析。16,17
    1. 采用逆转录 PCR 检测 SOAT1 mRNA（正向引物：5'-GAAGGGGCCTATCTGGAACG-3'；反向引物：5'-ATCTGCACGTGACATGACCA-3'；PCR 产物 = 168 bp），作为 EEC 细胞的特异性标志物。以 β-Actin mRNA（正向引物：5'- TGGTGAAGCTGTAGCCTCTC-3'；反向引物：5'- GTGATGGACTCTGGTGATGG-3'；PCR 产物 = 151 bp）作为看家基因和内参对照。
    2. 采用凝胶电泳检测 RT-qPCR 产物的大小。制备 1% 琼脂糖凝胶，将 10 μl qPCR 产物与 2 μl 上样染料混合。取 10 μl 混合液加入 1% 琼脂糖凝胶的每个加样孔中，在 100 V 条件下电泳运行 30 分钟。

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结果

为了建立一个稳定且具有实用价值的细胞模型，我们需要延长并稳定禽类EECs的增殖速率和功能表现。我们比较了将内胚层直接孵育（不进行酶消化）与使用蛋白水解酶（如胶原酶或胶原酶联合0.6 U分散酶）对内胚层进行部分消化的方法。分散酶是一种氨基内肽酶，可水解非极性氨基酸残基的N端肽键。与未消化组相比，蛋白酶消化处理显著提高了细胞增殖能力（图1）；但在孵育5天后，两种酶处理之间的细胞生长情况无明显差异（图2）。然而，胶原酶处理组获得了更理想的生长曲线，显示EECs可持续稳定增殖6–9天（图2）。因此，采用部分胶原酶消化法可有效促进来自离体组织外植块的EECs生长，推荐用于获取数量充足且功能完整的EECs。

培养4天后，经甲醛固定和油红O染色，可见子宫内膜上皮细胞（EECs）呈现出类似脂肪细胞的形态（图3），表明培养的细胞具有正确...

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讨论

由于先前的培养体系成功率有限，因此需要一种更优的培养体系。日本鹌鹑卵黄囊中胚层内胚层在体外组织块培养中需要使用蛋白酶（如胶原酶）处理，以松解细胞间连接，从而获得更好的生长效果。我们的数据显示，在接种培养2天后，经部分消化处理所得的细胞数量多于未消化组织培养（图1）。因此，部分蛋白酶消化是提高YSM细胞得率的关键步骤。

当前培养方案中的关键改进步骤是部分蛋白酶消化。该处理显著提高了细胞产量以及成功获得活的子宫上皮细胞（EECs）的比率。消化时间非常关键，因为过度消化会导致细胞从组织中分离，从而使细胞无法贴附于培养板；而消化不足则会导致从组织外植体中获得的细胞数量减少。我们发现，在上述条件下消化30至40分钟最为理想。

目前的方案需要较高的技术训练才能获得卵黄囊内皮细胞（EECs）。收集EECs的时间点受到限制，例如，我们仅在胚胎发育第5天（embryonic day 5）进行收集。原因是随着鸟类胚胎的发育，卵黄囊膜各层之间的连接变得更加复杂，从而降低了成功收集EECs的几率。该方案可用于获取早期...

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披露

不存在竞争性经济利益或其他利益冲突。我们未从任何私营公司获得资金支持。

致谢

本方案的开发特别得到了中国台湾国立台湾大学“迈向顶尖大学计划”（项目编号：104R350144）以及中国台湾科技部（项目编号：MOST 104-2313-B-002-039-MY3）的资助。我们特别感谢国立台湾大学生物技术中心为本研究提供了动物饲养室和实验室空间。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科改良伊格尔培养基Gibco by Life technologies12800-017 10 X 1 L用于洗涤 EECs 沉淀
D-MEM/F-12Gibco by Life technologies12400-024 10 X 1 L作为培养 EECs 的基础培养基
NBCSGibco by Life technologies16010-159作为培养 EECs 时的补充血清
青霉素-链霉素-两性霉素 B 溶液BI (Biological Industries)03-033-1B 100 ml用于减轻可能发生的感染 
IV 型胶原酶Gibco by Life technologies17104-019 1 g 胶原酶是一种蛋白酶，特异性作用于 Pro-X-Gly-Pro 序列中中性氨基酸（X）与甘氨酸之间的肽键。用于从原代组织中解离细胞。
24 孔板FALCON®REF-353047用于 EECs 的贴壁与扩展
50 ml 聚丙烯离心管Corning® CentriStarTM430829用于膜组织和酶消化过程的转运
带盖 50 ml 锥底管PRO TECHCT-50-PL-TW用于膜组织和酶消化过程的转运
往复式摇床DEAGLESB302用于促进膜组织的酶消化效果

参考文献

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