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利用荧光显微镜鉴定驱动蛋白-1的货物分子

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DOI：

10.3791/53632

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2016年2月14日

1Department of Oncological Sciences, Icahn School of Medicine at Mount Sinai

本文内容

摘要

本文介绍了一种鉴定驱动蛋白-1（Kinesin-1）货物分子的实验方案。驱动蛋白-1重链（KIF5B）的一种无马达功能突变体会在细胞质中形成聚集体，并诱导其货物分子共同聚集。通过荧光显微镜可同时检测到这两类聚集体。该策略同样可用于鉴定其他马达蛋白的货物分子。

摘要

荧光显微镜可用于鉴定驱动蛋白-1（Kinesin-1）的运输货物。最近研究表明，驱动蛋白-1的重链（KIF5B）可将细胞核转录因子c-MYC转运至细胞质中进行蛋白酶体降解。本文所述方法涉及利用荧光显微镜研究一种无马达功能的KIF5B突变体。野生型和无马达功能的KIF5B蛋白均标记有荧光蛋白tdTomato。野生型tdTomato-KIF5B在细胞质中呈均匀分布，而无马达功能的tdTomato-KIF5B突变体则在细胞质中形成聚集体。无马达功能KIF5B突变体的聚集会诱导其运输货物c-MYC在细胞质中发生共聚集。因此，该方法提供了一种可视化手段，用于鉴定驱动蛋白-1的运输货物。类似策略也可用于鉴定其他马达蛋白的运输货物。

引言

驱动蛋白-1是一种介导其货物顺向运输的马达蛋白1,2。它是由两条驱动蛋白轻链1（KLC1）亚基和两条驱动蛋白重链（KHCs）亚基组成的异源四聚体。KIF5B1是驱动蛋白重链的一种，其N端含有一个马达结构域，可水解ATP并将化学能转化为机械能，从而沿微管移动。其C端区域包含二聚化结构域，可与KLC1相互作用，而KLC1则负责结合货物。驱动蛋白-1可运输囊泡、细胞器和mRNA等货物3,4。最近研究表明，KIF5B可将核转录因子c-MYC转运至细胞质中进行蛋白酶体降解5。已有三种方法被用于抑制驱动蛋白-1的功能：化学抑制剂、siRNA/shRNA以及显性负性突变体。这三种方法均导致c-MYC在细胞质中聚集。在最后一种方法中，c-MYC仅受到KIF5B显性负性突变体的影响，而不受另一种相关马达蛋白KIF5A显性负性突变体的影响，表明该突变体不会对细胞内组分（如微管结构破坏）或蛋白质聚集产生普遍影响。此外，KIF5B的显性负性突变体也不影响其他转录因子，说明其对转录因子无普遍作用。相反，这提示KIF5B显性负性突变体对其特定货物具有特异性作用。

显性负性突变体在运动蛋白研究领域中被广泛应用。此前已有研究使用类似的无马达功能的驱动蛋白（kinesin）和肌球蛋白（myosin）突变体，主要用于展示这些突变体对其所运输的货物在亚细胞定位方面或对细胞功能的影响6-12。然而，较少关注突变体与其影响的货物之间的空间关系。但在某些情况下，观察到这些突变体与其运输的货物存在共定位现象6,10。

KIF5B 及其相关蛋白之间的相互作用此前已通过实验验证 体内 酵母双杂交实验以及生化拉下实验，例如共免疫沉淀 体外 下拉实验13-16本文描述了一种利用荧光显微镜的附加可视化方法，用于鉴定KIF5B的货物蛋白。该方法利用一种无马达功能的KIF5B突变体，其作为显性负性突变体发挥作用。该突变体在细胞质中聚集，并诱导其货物蛋白发生共聚集。

野生型及无动力突变型KIF5B与荧光蛋白tdTomato的标记17 通过荧光显微镜实现其可视化。标记的KIF5B蛋白可与候选蛋白共表达，该候选蛋白融合了另一种具有与KIF5B标签光谱特性适当分离的荧光蛋白。标记蛋白可在活细胞中直接通过荧光显微镜观察。若无动力域的KIF5B突变体能够诱导候选蛋白发生聚集，则可证实该候选蛋白为KIF5B的结合蛋白。 体内 KIF5B的货物蛋白。此外，可单独在细胞中表达tdTomato标记的KIF5B蛋白，以研究其对内源性货物蛋白的影响。随后进行免疫荧光显微镜分析，将转染的细胞固定，并用针对内源性候选蛋白的特异性抗体染色，再使用偶联荧光染料的适当二抗进行孵育。在此情况下，可研究生理水平下的内源性候选蛋白。类似地，可制备其他马达蛋白的无马达功能突变体，以鉴定其相应的货物蛋白。

方案

1. tdTomato标记的野生型和无动力KIF5B蛋白的克隆

  1. 使用 表1 中的引物、Taq DNA 聚合酶（100 μl 体系中加入 5 单位）、dNTP 混合物（每种脱氧核苷酸 2 mM）及其 10X 缓冲液，进行 30 个循环扩增人源野生型和无马达结构域的 KIF5B 蛋白的 cDNA。每个循环包括变性步骤（95 °C 持续 30 秒）、退火步骤（45 °C 持续 30 秒）和延伸步骤（72 °C 持续 3 分钟）。
  2. 用等体积的苯酚/氯仿（1:1）抽提扩增后的 DNA 产物。
    注意：苯酚易燃，可引起灼伤；氯仿具有危害性。避免直接接触，并在化学通风橱中操作。也可使用各类试剂盒纯化 PCR 产物。
    1. 在室温下以 18,000 × g 离心 1 分钟。将水相转移至新离心管中，再用等体积氯仿抽提一次。
    2. 在室温下以 18,000 × g 离心 0.5 分钟。将水相转移至新离心管中。
    3. 向水相中加入十分之一体积的 3 M 醋酸钠和两倍体积的无水乙醇，混匀。
    4. 在室温下以 18,000 × g 离心 5 分钟。弃去上清液。
    5. 用两倍体积的 75% 乙醇洗涤 DNA 沉淀。弃去上清液后，在室温下晾干 5 分钟。将 DNA 沉淀重悬于 34 μl 水中。
  3. 在终体积 40 μl 体系中，加入限制性内切酶 SalI（10 单位）和 BamHI（10 单位）及其 4 μl 10X 缓冲液，37 °C 消化扩增产物 2 小时。将消化产物在含溴化乙锭（0.2 μg/ml）的琼脂糖凝胶（1.0%，100 V）中电泳分离。
    注意：溴化乙锭为强效诱变剂，可通过皮肤吸收，因此应避免直接或间接接触。
  4. 切下正确大小的条带进行柱纯化。称量含有 DNA 片段的琼脂糖凝胶块，加入溶解缓冲液（每 0.1 g 凝胶加 300 μl），37 °C 溶解约 20 分钟。
  5. 将所得溶液加入纯化柱中，在室温下离心 5 秒。弃去穿流液。
  6. 用 0.5 ml 溶解缓冲液重复步骤 1.5 洗柱一次；再用 0.75 ml 洗涤缓冲液重复步骤 1.5 洗柱一次。最后离心 2 分钟以去除残留的洗涤缓冲液。
  7. 用 50 μl 水洗脱 DNA 片段（重复步骤 1.5）。取部分样品与 DNA 分子量标准物一同在含溴化乙锭（0.2 μg/ml）的琼脂糖凝胶（1.0%，100 V）中电泳，以估算 DNA 片段的浓度。
  8. 将纯化后的 PCR 产物（约 100 ng）与先前用相同限制性内切酶消化的 ptdTomato-C1 载体17（约 100 ng）在 10 μl 体系中连接，加入 T4 DNA 连接酶（2,000 单位）和 1 μl 10X 连接缓冲液，室温连接 16 小时。
    注意：野生型和无马达结构域突变体分别包含第 2 至 963 位和第 584 至 963 位氨基酸。此前研究中曾使用较大的无马达结构域 KIF5B 突变体以鉴定其功能9；本研究采用较小的无马达结构域 KIF5B 突变体，以提高其表达水平。

2. 免疫荧光显微镜技术

  1. 对于放大倍数为40倍或更低的活细胞或间接荧光成像，将0.2-0.3×10⁶个HeLa细胞接种于六孔板的每个孔中，每孔加入1 ml完全培养基[含10%胎牛血清（FBS）的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）]，在37 °C、5% CO2条件下培养。
  2. 对于放大倍数高于40倍的间接免疫荧光研究，在生物安全柜内将盖玻片（18 mm × 18 mm；厚度1.5）用无水乙醇短暂清洗，并在六孔板的孔中空气干燥，以避免污染。
    1. 在六孔板的每个孔中加入1 ml完全DMEM培养基，接种0.2-0.3×10⁶个细胞。
  3. 转染复合物的制备
    1. 次日，在生物安全柜内，将表达tdTomato标记的野生型或无马达结构域KIF5B的质粒（总量0.6 µg）溶于0.1 ml转染培养基中，同时可选择性加入或不加入候选货物蛋白的表达质粒（pTagCFP-c-MYC5），置于1.6 ml微量离心管中。
      注：质粒pTagCFP-c-MYC表达TagCFP标记的c-MYC蛋白。
    2. 在另一支1.6 ml微量离心管中，将1.8 µl转染试剂加入0.1 ml转染培养基中。通常，配制足够用于12个样品的稀释转染试剂主混合液。
    3. 室温孵育5分钟。
    4. 将稀释后的0.1 ml转染试剂加入稀释后的0.1 ml DNA溶液中，通过轻轻颠倒混匀管内液体。在微量离心机中短暂离心5秒。
    5. 室温孵育45分钟。
  4. 细胞洗涤
    1. 在转染复合物形成孵育期间，用磷酸盐缓冲液（PBS）对已接种的细胞洗涤三次。
    2. 将每孔中的细胞培养基更换为0.8 ml预热的转染培养基，并将培养板放回37 °C培养箱中。
  5. 细胞转染
    1. 孵育45分钟后，将0.2 ml DNA/转染试剂复合物（步骤3.5中制备）逐滴加入六孔板的每个孔中。
    2. 轻轻摇动六孔板5秒，然后将其放回37 °C培养箱中。
    3. 6-8小时后，更换为完全DMEM培养基。
  6. 活细胞荧光成像18
    1. 在37 °C继续孵育16小时后，向培养基中加入DNA嵌入染料Hoechst 33342，使其终浓度为1 µM。
      注：Hoechst 33342是一种可穿透细胞膜的DNA嵌入染料，可对细胞核进行染色。
    2. 将转染后的细胞在37 °C培养箱中孵育10分钟，然后使用40倍物镜通过荧光显微镜观察荧光蛋白的表达情况。DAPI、CFP、FITC和Cy3的滤光片组分别为（激发350 nm/发射460 nm）、（激发436 nm/发射480 nm）、（激发470 nm/发射525 nm）和（激发545 nm/发射605 nm）。
      注：若因完全DMEM培养基的自发荧光导致背景过高，可使用不含酚红的培养基。

3. 用于间接免疫荧光研究

  1. 多聚甲醛溶液的配制
    1. 称取多聚甲醛粉末（每 100 ml PBS 加入 4 g），加入 PBS 中。
      注意：多聚甲醛为易燃固体，具有潜在致癌性，对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。因此，应避免接触或吸入多聚甲醛。
    2. 向溶液中加入 NaOH（每 100 ml 加入 150 µl 10 N NaOH）。
    3. 将溶液置于 37 至 42 °C 条件下，间歇性振荡，持续 2–3 小时。
    4. 待多聚甲醛粉末完全溶解后，向溶液中加入冰醋酸调节 pH 至 7.0（约每 100 ml 加入 75 µl）。
  2. 靶蛋白染色
    1. 转染细胞在 37 °C 继续孵育 16 小时后，在室温下用 PBS 洗涤一次，通过轻轻旋转六孔板 5 秒完成洗涤。
    2. 每孔加入 1 ml 新鲜配制的 4% 多聚甲醛溶液固定细胞，在室温下孵育 30 分钟。
    3. 用 PBS 洗涤细胞一次，通过旋转六孔板 5 秒完成，弃去溶液。
    4. 每孔加入 1 ml 0.1% Triton-X 100（溶于 PBS）溶液，在室温下孵育 30 分钟。Triton-X 100 作为去垢剂可通透细胞膜，使抗体能够进入细胞内结合靶标。
    5. 用 PBS 洗涤四次，每次旋转六孔板 5 秒，每次洗涤后弃去溶液。
    6. 每孔加入 1 ml 含 10% FBS 的 PBS 溶液稀释的一抗溶液（c-MYC 兔抗体或 p53 小鼠抗体；0.1 µg/ml），在室温下轻轻摇动孵育 4 小时。
    7. 用 PBS 洗涤四次，每次旋转六孔板 5 秒，每次洗涤后弃去溶液。
    8. 每孔加入 1 ml 含 10% FBS 的 PBS 溶液稀释的荧光标记二抗（Alexa Fluor 488 标记的抗兔或抗小鼠 IgG 抗体；0.5 µg/ml），在室温、避光条件下轻轻摇动孵育 2 小时。
    9. 用 PBS 洗涤四次，每次旋转六孔板 5 秒，每次洗涤后弃去溶液。
  3. 细胞核染色与封片
    1. 每孔加入 1 ml 含 DNA 插入染料 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI；0.5 µg/ml）的 PBS 溶液，在室温、避光条件下孵育 10 分钟。若未使用盖玻片，则直接进行步骤 3.4。
      注意：DAPI 是一种 DNA 插入染料，可对细胞核进行染色。
    2. 在每张载玻片上滴加 10 μl 封片液，将盖玻片覆盖于封片液上并置于载玻片上。
    3. 在室温、避光条件下孵育过夜。
    4. 用指甲油密封盖玻片边缘，置于通风橱内避光过夜，以去除指甲油挥发性气体。
  4. 荧光显微镜观察19
    1. 次日，使用 40X 物镜进行荧光显微镜观察。DAPI、CFP、FITC 和 Cy3 的滤光片设置分别为（激发 350 nm/发射 460 nm）、（激发 436 nm/发射 480 nm）、（激发 470 nm/发射 525 nm）和（激发 545 nm/发射 605 nm）。

结果

外源表达的野生型KIF5B在细胞质中呈均匀分布，而c-MYC主要位于细胞核中 （图1A）然而，无马达功能的KIF5B突变体在细胞质中形成了聚集体 （图1A）无动力域KIF5B的聚集诱导了c-MYC的聚集。在表达野生型KIF5B的细胞中，表达聚集性TagCFP标记c-MYC的细胞比例较低；然而，当共表达无动力域KIF5B时，该比例显著升高。 （图1A）突变型KIF5B与c-MYC的共定位现象 （图1） 表明KIF5B调控c-MYC的亚细胞定位，且c-MYC是驱动蛋白-1（Kinesin-1）的运输货物。下层面板包含了仅单独表达载体的阴性对照。 图1A结果显示，荧光发射未出现显著的串色现象。无马达结构域的KIF5B同样引起了内源性c-MYC的聚集。 （图1B） 以及转录因子p53（图2），表明 c-MYC 和 p53 均为驱动蛋白-1 的货物蛋白，KIF5B 调控这两种内源性蛋白的亚细胞定位。结合使用驱动蛋白-1 抑制剂玫瑰红乳素（RBL）的实验结果20 诱导c-MYC和p53形成高分子量复合物5p53 很可能是驱动蛋白-1 的运输货物。值得注意的是，核转录因子 p53 与 c-MYC 类似，也会从细胞核转运至细胞质，进而被蛋白酶体降解21,22KIF5B 对转录因子的转运似乎具有特异性，因为表达无马达功能的 KIF5B 突变体并不影响 c-Fos 的亚细胞定位，也不会导致其聚集图3). 上述数据表明，本文所采用的方法能够高特异性地鉴定驱动蛋白-1的货物分子。类似策略也可应用于其他马达蛋白。

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图1：无马达结构域的KIF5B突变体表达可诱导c-MYC在细胞质中聚集。（A）HeLa细胞转染了tdTomato标记的野生型（WT）KIF5B（红色）和TagCFP标记的c-MYC（蓝色）。tdTomato标记的野生型KIF5B主要定位于细胞质，而TagCFP标记的c-MYC主要定位于细胞核。然而，tdTomato标记的无马达结构域KIF5B突变体（红色）在细胞质中形成丝状或点状聚集物。无马达结构域KIF5B的表达诱导了c-MYC的聚集。突变型KIF5B与c-MYC在细胞质中共定位（粉红色）。图中显示了出现CFP-c-MYC聚集物的细胞百分比（%）。结果以均值±标准差表示（N = 3）。下图显示了阴性对照组，即分别单独表达tdTomato标记的KIF5B蛋白或TagCFP标记的c-MYC，并共转空载体（V）的情况。（B）当表达tdTomato标记的野生型或无马达结构域KIF5B蛋白（红色）时，内源性c-MYC（绿色）也观察到类似结果。tdTomato标记的无马达结构域KIF5B突变体在细胞质中形成聚集物，并诱导内源性c-MYC发生聚集。两种聚集物在细胞质中共定位（橙色）。细胞核使用Hoechst 33342或DAPI染色。比例尺：20 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：无马达结构域的KIF5B突变体表达可诱导内源性p53在细胞质中聚集。 在HeLa细胞中，外源表达的tdTomato标记的野生型（WT）KIF5B（红色）主要位于细胞质中，而内源性p53（绿色）则主要位于细胞核中。相比之下，tdTomato标记的无马达结构域KIF5B突变体（红色）在细胞质中形成聚集体。表达无马达结构域的KIF5B可诱导p53发生聚集，导致KIF5B与p53在细胞质中共定位（黄色）。该实验重复进行了三次。细胞核使用DAPI染色。比例尺：20 μm。请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：表达无马达结构域的KIF5B突变体不会诱导c-Fos在细胞质中聚集。 tdTomato标记的野生型（WT）KIF5B（红色）主要位于HeLa细胞的细胞质中，而EGFP-c-Fos（绿色）主要位于细胞核内。相反，tdTomato标记的无马达结构域KIF5B突变体（红色）在细胞质中形成聚集体。表达无马达结构域的KIF5B并未诱导c-Fos发生聚集。该实验重复进行了四次。细胞核用DAPI染料染色。比例尺：20 μm。 请点击此处查看该图的放大版本。

通用反向引物5’-AGAGGATCCTTACACTTGTTTGCCTCCTC-3’
野生型 KIF5B 正向引物5’- AGAGTCGACGCGGACCTGGCCGAGTGCAACATCAAAGT-3’
无马达结构域 KIF5B 正向引物5’- AGAGTCGACGATGAAGAGTTCACTGTTGC-3’

表1：克隆野生型和无马达结构域KIF5B蛋白的引物序列。

讨论

本方法利用了无马达功能的KIF5B突变体的特性，该突变体虽丧失了沿微管移动的能力，但仍能与野生型KIF5B形成二聚体，从而使得四聚体蛋白可与野生型KIF5B相同的货物蛋白相互作用。因此，无马达功能的KIF5B作为显性负性突变体，会与其货物蛋白共同形成错位聚集物。该方法已被证实可用于鉴定驱动蛋白-1的货物蛋白c-MYC（图1）5。在本文中，使用相同的无马达功能KIF5B突变体，鉴定出p53是驱动蛋白-1的另一个潜在货物蛋白（图2）。这表明该方法适用于鉴定驱动蛋白-1的其他货物蛋白。此外，该突变体的特异性由其对阴性对照蛋白c-Fos无影响的结果所证实（图3）。

在本实验方案中，将tdTomato标记的野生型或无动力结构域的KIF5B蛋白与另一种荧光蛋白标记的候选货物蛋白共同表达。在此情况下，进行活细胞荧光显微镜观察和成像。通过延时成像可追踪聚集体的形成过程。 alternatively，可单独表达tdTomato标记的蛋白，并利用特异性抗体通过间接免疫荧光显微镜检测生理水平下的候选货物蛋白。选择荧光蛋白tdTomato是因其具有高亮度和良好的光稳定性17。若因完全DMEM培养基的自发荧光导致背景过高，应使用不含酚红的培养基。

无马达结构域的KIF5B突变体可与野生型KIF5B按化学计量比形成二聚体。因此，表达足量的无马达结构域KIF5B突变体以与野生型蛋白形成二聚体，从而抑制其功能并诱导聚集体形成，是至关重要的。为解决这一问题，必须优化该突变体的表达水平。可通过使用包含二聚化结构域的小型无马达突变体来实现这一目标。此外，还需优化合适的转染试剂及转染方案。已在HeLa细胞中优化了HeLa细胞与DNA/转染试剂共孵育的时间，以兼顾外源蛋白的表达效率和细胞存活率。其他细胞系可能需要对孵育时间进行相应优化。

对于4X至40X的放大倍数，无需使用盖玻片，可直接在孔中观察细胞。因此，该方案在此情况下具有成本低且操作简便的优点。对于高于40X的放大倍数，需在孔中的盖玻片上培养细胞，染色后将盖玻片置于载玻片上，使用油浸物镜进行观察。

由于细胞质体积的限制，对无马达结构域的KIF5B蛋白聚集体的观察受到一定限制。在许多哺乳动物细胞中，这些聚集体易于检测；然而，在神经元细胞中，当细胞核周围及神经突起内的细胞质体积较小时，观察这些聚集体则相对困难。

该方案用于展示KIF5B与其货物蛋白之间的相互作用关系，此外还包括 体内 酵母双杂交和生物化学下拉实验13-16所有这些检测方法在不同的物理条件下测定相互作用，其结果可以相互补充。此外，该荧光检测方法相较于其他检测的优势在于，能够显示KIF5B对货物分子亚细胞定位的调控作用图1 和 2).

该方案不仅限于KIF5B，还可用于鉴定其他马达蛋白（如某些其他驱动蛋白马达）的货物分子3 以及一些肌球蛋白马达23,24 用于细胞内货物运输3这些运动蛋白还含有沿微管运动的马达结构域（驱动蛋白类马达）或沿微丝运动的马达结构域（肌球蛋白类马达），以及用于寡聚化的卷曲螺旋结构区段。它们大多数形成同源二聚体。3,23因此，可以通过构建其无动力结构域的显性负性突变体来鉴定它们的货物分子，从而对它们采用类似的研究策略。

披露

本文的免费访问出版和制作由罗氏公司付费。

致谢

罗氏出版资助计划（Roche's Publication Grant）为本文的免费开放获取出版及制作提供了支持。作者还感谢 E. Premkumar Reddy、Richard V. Mettus、Stephen C. Cosenza、Sau Ying Yip 和 Sol D. Gloria 对本手稿的支持与审阅。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无水乙醇（200 proof）Fisher ScientificBP2818
DAPISigma-AldrichD9542
Hoechst 33342Sigma-AldrichB2261
Opti-MEM-I（转染培养基）Life Technologies51985
ProLong Diamond 抗荧光淬灭封片剂Life TechnologiesP36961
甲醛，对位Fisher ScientificO4042-500
Triton-X100Fisher ScientificBP151-500
X-tremeGENE 9 DNA 转染试剂Roche6365787001
Taq DNA 聚合酶Life Technologies10342020
PCR 级核苷酸混合物（dNTP 混合物）Roche12111424
显微镜盖玻片Fisher Scientific12-541A
GeneRuler 1 kb Plus DNA MarkerLife TechnologiesSM1333
PureLink 快速凝胶回收试剂盒Life TechnologiesK210012
BamHINew England BiolabR0136
SalINew England BiolabR0138
T4 DNA 连接酶 New England BiolabM0202T
溴化乙锭Thermo Scientific17898
DMEMLife Technologies11995-065
c-MYC 兔单克隆抗体Cell Signaling5606
p53 小鼠单克隆抗体Santa Cruzsc-126
Alexa Fluor 488 标记的抗兔 IgG 抗体Life TechnologiesA11008
Alexa Fluor 488 标记的抗小鼠 IgG 抗体Life TechnologiesA11059
荧光显微镜 Olympus IX71_Fluoview
成像用计算机软件 cellSens 

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KIF5B tdTomato c MYC p53

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