大规模扫描透射电子显微镜（纳米解剖学）对健康与损伤斑马鱼脑组织的成像

摘要

大规模二维电子显微镜（EM），即纳米解剖学，是指在组织范围内应用纳米级分辨率的电子显微镜技术。本文介绍了一种通用的纳米解剖学方法，用于研究健康状态下以及无创性脑损伤后的斑马鱼幼体脑组织。

摘要

大规模二维电子显微镜（EM），即纳米解剖学（nanotomy），是指在组织范围内应用纳米级分辨率的电子显微镜技术。此前，我们及其他研究者已将大规模电子显微镜技术应用于人类皮肤、胰岛、组织培养以及整条斑马鱼幼体^1-7。本文介绍一种普适性的组织尺度扫描电镜方法，用于无偏检测亚细胞和分子水平的结构特征。该方法被应用于研究健康状态及神经退行性病变的斑马鱼大脑。本方法基于标准化的电镜样品制备流程：先用戊二醛和四氧化锇固定，随后以环氧树脂包埋，超薄切片，并将超薄切片转移至单孔载网，再用醋酸铀和柠檬酸铅进行复染。大规模二维电镜拼接图像通过连接外部大面积扫描发生器的扫描电镜，利用扫描透射电镜（STEM）模式获取。大规模电镜图像通常约为 5–50 G 像素，最佳浏览方式是使用可在任何网页浏览器中打开的可缩放 HTML 文件，类似于在线地理地图。该方法适用于（人类）组织、整只动物的横切面以及组织培养样品^1-5。在此，我们利用非侵入性神经元消融模型分析了斑马鱼大脑。我们在单个数据集中可视化了组织、细胞及亚细胞水平的变化，并可在多种细胞类型（包括神经元和作为大脑巨噬细胞的小胶质细胞）中进行定量分析。此外，纳米解剖学还支持在同一组织样本上实现电镜与光学显微镜（CLEM）的关联分析⁸：先前通过荧光显微镜成像的大面积表面区域，可进一步进行大面积电镜成像，从而获得组织的纳米解剖结构（nanotomy）。综上，纳米解剖学实现了在全组织范围内对电镜水平特征进行无偏且可量化的检测。

引言

近年来的技术发展提高了电子显微镜（EM）的多功能性、适用性及其定量能力，从而推动了超微结构分析的复兴。技术进步包括三维电子显微镜（3D EM）、大规模二维电子显微镜（2D EM），以及用于关联光学显微镜与电子显微镜（CLEM）的改进方法和试剂，从而能够将其他显微分析模式直接与电子显微镜水平进行比较^8-10。大规模二维电子显微镜特别适用于对人类病理学中的（新）疾病特征进行定量或鉴定，研究疾病的动物模型以及组织培养模型。然而，由于电子显微镜通常视野较小，难以将高倍率下观察到的变化与整个组织尺度相关联，也难以对超微结构特征进行无偏倚且定量的分析。

用于人类组织的病理学分析或动物模型中病理学评估的苏木精和伊红（H&E）染色的甲醛固定石蜡包埋（FFPE）组织切片是常规方法。除了简单的H&E染色免疫标记也用于识别病理异常。若此类组织能在透射电镜（EM）水平进行分析，则可鉴定特定细胞类型及亚细胞结构的变化。大规模EM分析具有无偏倚性，有助于发现疾病的意外特征和新特征。通过大规模EM技术，可实现高达平方毫米面积的可视化。我们及其它研究团队此前已将纳米切片技术应用于大鼠胰岛⁴细胞培养²，大鼠脑³皮肤和黏膜⁷ 和完整的斑马鱼幼体^1,5 （www.nanotomy.org）。斑马鱼非常适用于 在体 成像，特别是用于可视化哺乳动物组织中难以获取的细胞类型，包括脑免疫细胞¹¹此处详细描述了纳米解剖（nanotomy）技术的操作流程，该技术应用于经神经元表达的硝基还原酶转化甲硝唑诱导条件性神经元消融的斑马鱼头部冠状切片（www.nanotomy.org）。^5,12-14.  所有原始数据均以可缩放的 HTML 文件形式呈现，可视化从分子到组织尺度的变化。原始数据的展示方式使得全球专家能够从不同角度对数据集进行无偏分析。

方案

所有涉及斑马鱼幼鱼的实验均根据荷兰格罗宁根大学动物实验委员会的国家及欧盟指南批准通过。

1. 样品制备

1. 固定与包埋
   1. 固定
      1. 用添加了三卡因（0.003%）的E3溶液（5 mM NaCl，0.17 mM KCl，0.33 mM CaCl₂，0.33 mM MgSO₄）对鱼 larvae 进行麻醉₂，0.33 mM MgSO₄_4, 10 mM HEPES，pH 7.6）的斑马鱼养殖用水中，并在解剖显微镜下用200 µl移液器吸头轻轻触碰以检测麻醉深度，直至不再观察到运动反应（图1A).
      2. 在获取相关电镜样本之前处理样品时 体内 使用共聚焦或双光子成像技术在1.8%琼脂糖中进行成像，方法如前所述，^5,15 使用含 0.05% Triton-X-100 的 4% PFA PBS 溶液固定琼脂糖中的幼虫。
      3. 从琼脂糖中切出幼虫并进行大规模电镜制样⁵.
      4. 在塑料管中，于室温下用含0.05% Triton-X-100的4%新鲜多聚甲醛PBS溶液固定幼虫2小时。
         注：在培养中生长的细胞（体外) 可直接用戊二醛固定，具体步骤见下一步（1.1.1.5）。
      5. 去除溶液，加入100 µl含0.5% PFA、2%戊二醛（GA）和0.1 M二甲胂酸钠（pH 7.4）的混合液。4 °C下孵育过夜。用0.1 M二甲胂酸钠缓冲液清洗样品两次。
      6. 在延髓前方横切幼虫头部，以促进锇酸渗透。使用精细的注射器/镊子操作。
      7. 用1%四氧化锇（OsO₄）固定幼虫₄)/1.5% 亚铁氰化钾（K₄[Fe(CN)₆]) 在0.1 M二甲胂酸钠缓冲液中冰上固定2小时，再用双蒸水冲洗3次，每次5分钟₂O.
      8. 在逐步升高的乙醇浓度（50%、70%、100%三次）中各孵育20分钟进行脱水。
   2. 包埋
      1. 根据电子显微镜实验室常用的标准配方制备环氧树脂。
         注意：我们按如下方法使用环氧树脂：将19.8 g环氧氯丙烷-双酚A二缩水甘油醚（glycid ether 100）、9.6 g十二烯基琥珀酸酐（2-dodecenylsuccinic acid anhydride）和11.4 g甲基纳迪克酸酐（methylnadic anhydride）用磁力搅拌器混合。加入0.5 g DMP-30（三（二甲氨基甲基）苯酚，tris-(dimethylaminomethyl) phenol），再次搅拌混合。
      2. 在室温下，将幼虫置于50%环氧树脂乙醇溶液（v/v）中，旋转孵育过夜。
      3. 用纯树脂替换稀释的环氧树脂。室温孵育30分钟，加入新鲜树脂再次孵育30分钟。再次更换树脂，随后在室温下孵育3小时，接着在58 °C孵育15分钟，再于室温下在低压（200 mbar）条件下孵育1小时。
      4. 将头部在商用硅胶平底包埋模具中用解剖显微镜下以针或牙签进行定位，使头部前部朝向模具侧壁或根据需要调整方向 (图1B).
      5. 在58 °C下使环氧树脂聚合过夜。如果环氧树脂仍然过软，则在58 °C下继续聚合和硬化一天。使用镊子施加压力测试硬度。如果轻易留下压痕，则在58 °C下再延长一天进行聚合和硬化。当样品完全硬化后，进行修块和切片。
      6. 使用剃刀刀片修剪掉载片上多余的树脂（图1B).
2. 切片、染色与封片
   1. 切片
      1. 使用超薄切片机对环氧树脂包埋块进行切片。
      2. 使用玻璃刀或钻石组织切片刀切割半薄切片（500 nm），用于甲苯胺蓝/碱性品红染色图1D染色以检测定位是否正确。
      3. 用火焰封闭玻璃巴斯德移液管的尖端，借助该移液管将半薄切片转移至载玻片上。置于加热板上干燥，直至无水分残留。在加热板上用1%甲苯胺蓝水溶液染色10秒，流水冲洗后，再用含1%四硼酸钠的0.05%碱性品红溶液染色10秒。使用普通光学显微镜在10X至40X放大倍数下观察。
      4. 当到达脑内合适的位置/方向后，继续使用金刚石刀对环氧树脂块进行切片，以获得超薄切片（约 70 nm； 图1E)
      5. 利用大脑内部及周围易于识别的解剖结构（包括嗅窝、眼睛、灰质-白质边界）来确定超薄切片过程中的目标区域，并在样本发生倾斜时调整切片角度。
      6. 将切片置于单槽L2 x 1铜网上图1F），以避免网格条纹干扰成像。使用甲醛膜（Formvar）包被的载网支撑切片。
   2. 对比
      1. 在甲醇中用2%醋酸铀染色网格上的超薄切片2分钟，随后用Reynolds柠檬酸铅染色2分钟 ¹⁶.

2. 图像采集

1. 大规模STEM
   注意：我们使用配备外部扫描发生器的扫描电子显微镜（SEM），结合STEM检测模式，以高分辨率获取多个大视野图像^3,5,7,17。通常，以此方式生成的一幅图像相当于约100张透射电子显微镜（TEM）图像的视野范围，显著减少了图像拼接的工作量。
   1. 将样品安装至显微镜中
      1. 将带有切片的载网放入多格样品 holder 中，并转移至SEM腔室。
   2. STEM探测器的对准
      1. 将带样品的载网置于电子束下，并向上移动，使其距离物镜极靴约5 mm。使用镜内探测器在20 kV条件下采集图像。
      2. 聚焦于载网边缘，并将工作距离调节至4.0 mm。
      3. 将样品台移至安全位置，然后引入STEM探测器。
      4. 在使用镜内探测器以最快速度成像的同时，旋转调节螺丝，使STEM探测器的孔居中于图像视野中。
      5. 小心地将样品台重新移回，使其刚好位于物镜极靴与探测器之间。
      6. 使用镜内探测器采集一幅图像，确认处于切片区域。
      7. 切换至STEM检测模式（增益设为中等，所有象限设为“负”），采集图像并选择待扫描区域。
      8. 将加速电压升至21 kV，等待电子束稳定（图像再次稳定），然后以2 kV为步长逐步升至29 kV。
   3. 图像采集
      1. 通过放大视野，使待扫描的整个区域刚好填满图像窗口，对样品进行预辐照（以防止电子束引起的亮度变化）。
      2. 更换为120 µm光阑（为保持探测器合适的动态范围，需将增益降低一级）。
      3. 散焦，使图像模糊。
      4. 使用“减小扫描区域”选项，尽可能缩小扫描范围。
      5. 设置扫描速度，使每帧图像扫描时间约为1–2秒。
         注意：根据样品大小和组织类型，此过程通常耗时½小时（100 × 100 µm视场）至最长3小时（1,000 × 500 µm）。
      6. 放大至少100倍，对一小区域扫描10秒。
         注意：若该区域亮度与其周围无变化，则预辐照已足够。
      7. 恢复使用30 µm光阑（并将STEM增益设为中等）。
      8. 对样品进行聚焦。
      9. 使用摇摆器（wobbler）对光阑进行对中（在约40,000倍放大倍数下）。
      10. 在聚焦状态下，选择最亮的区域/特征，设置扫描速度以确保细节可见。
      11. 在显微镜软件中，通过仔细观察直方图调节亮度和对比度，确保所有像素均处于动态范围内。对最暗区域/特征执行相同操作。
      12. 返回最亮区域再次检查，确保直方图两侧均留有一定余量。
      13. 缩小视野，使整个待扫描区域刚好填满成像窗口，然后启动大范围图像采集程序。
      14. 使用向导功能，通过在屏幕上选择区域来设置图像拼接。根据所需细节程度，设置像素尺寸为2–5 nm。STEM模式下使用3 µs的停留时间。
      15. 选择选项 "在前一块图像上自动对焦"，使用大尺度采集软件的自动对焦功能（采用厂商默认设置），勾选 "执行前验证设置"，并定义数据保存位置。
      16. 点击 "优化" 以检查显微镜设置。
          注意：此时将显示所需时间。对于1 × 0.5 mm的区域，该时间可能长达72小时。
      17. 在 "最大图块分辨率" 窗口中输入20,000，以确保单个图块不超过20k × 20k，避免边缘模糊效应。点击 "执行"。
      18. 当系统提示检查对焦及亮度/对比度（B/C）时，关闭外部扫描发生器，在显微镜软件中仔细调节对焦和像散。不要更改亮度/对比度（B/C）。
          注意：可移动样品台并更改放大倍数，但必须将放大倍数重新设置为所需的像素尺寸。
      19. 重新开启外部扫描发生器，然后点击 "继续"。

3. 数据分析

1. 打开大规模电子显微镜文件查看程序，并打开文件 "mosaic info"。这将加载所有拼接的 tif 文件。建议在另一台工作站上执行此操作，以避免干扰新的图像采集。
2. 选择“自动拼接整个图像拼贴”选项（参数设置为：重叠模式为一半，拼接阈值为 0.90，噪声抑制设为自动）。若无法满足拼接条件，可放大图像并手动将图像块放置到正确位置，然后点击“继续当前状态”）。
3. 将图像导出为 html 文件，或另存为单个 TIF 文件。
   注意：导出为 TIF 文件时可能需要进行降采样。请在文件名中包含最终的像素尺寸，以便后续进行测量。
4. 在图像编辑软件中打开 TIF 文件以进行标注。同时，在网页浏览器中打开可缩放的 html 文件，以便以最佳分辨率进行观察。

结果

1周龄斑马鱼幼鱼头部冠状切面的大规模电镜数据集，在单幅大尺度图像中展示了多种组织和细胞结构特征（www.nanotomy.org）。

对照脑组织切片的纳米解剖学分析揭示了前脑前端神经组织典型的超微结构特征，包括嗅觉纤维束、神经元细胞核以及神经元亚区室（如突触）（图2A，www.nanotomy.org）。头部中可区分的细胞类型包括下颌部具有大空泡的软骨细胞、嗅觉神经细胞中嗜锇性的髓鞘、小血管的内皮细胞；结构方面包括脑膜（zebrafish中的meninx，相当于哺乳动物脑部被膜的脑膜结构）。亚细胞结构包括表皮的糖萼、不同类型细胞中各异的细胞核形态及核内焦点，以及高尔基体、内质网（ER）、线粒体、突触小泡和突触后致密结构等细胞器。

出乎意料的是，衬在脑室壁的细胞核与其他在脑组织中更偏外侧分布的细胞相比，电子密度非常高。此外，这些脑室壁细胞核呈现出深染的灶状结构，而在脑内其他细胞中则不存在此类结构，且这些灶状结构在大小和形态上也不同于吞噬性小胶质细胞核内的异染色质（图2）。在发育中的斑马鱼中，衬于脑室壁的细胞主要包括放射状胶质细胞和神经前体细胞，这可能反映了其染色质状态与更趋分化的细胞有所不同。由于组织中的干细胞通常极为稀少，因此可通过纳米断层成像技术，将干细胞标志物的组织标记与组织尺度的电镜图像进行关联，从而用于鉴定干细胞的超微结构特征。

对经历神经元消融的斑马鱼幼体冠状切片进行的大规模电镜观察（www.nanotomy.org）揭示了许多在对照动物中未见的特定组织、细胞及分子特征。细胞特征包括具有吞噬功能的小胶质细胞以及大小与细胞相当的空泡，后者可能代表正在死亡的细胞（图2B，www.nanotomy.org）。既往电镜研究已在脊椎动物中鉴定出小胶质细胞^18,19。小胶质细胞的典型特征包括细长的细胞核、紧邻核膜分布的斑片状染色质团块、明显的高尔基体、游离的多聚核糖体、具有狭长池状结构的颗粒型内质网（ER）、相对深染/致密的细胞质，以及多种包涵体，如吞噬体、脂滴和溶酶体。所有这些通常归因于哺乳动物组织中小胶质细胞的标志性特征，在斑马鱼脑组织的这些细胞中也同样被观察到（图2B，www.nanotomy.org）。

图1：斑马鱼大脑大规模组织电子显微镜工作流程。（A） 7日龄斑马鱼幼体。（B） 并排包埋于环氧树脂中的斑马鱼幼体头部。（C） 用于半薄切片及样品定向的玻璃刀。（D） 代表性半薄切片（甲苯胺蓝染色），显示两个并排包埋的斑马鱼幼体。（E） 用于切割超薄切片（70 nm）的钻石刀。（F） 对（D）中图像进行编辑，展示位于单孔载网上的一整片斑马鱼幼体脑切片，以标明位置。（G） 本研究中用于大规模二维电子显微镜成像的显微系统。（H） 图像处理流程。请点击此处查看该图的放大版本。

图2： 纳米解剖学结果：从大分子到组织。 （A） 受精后7天对照组大脑的纳米解剖学结果，与（B） 处理组（神经元消融；图1）对比，显示神经元消融后退化脑组织的特有特征。（B） 这些特征包括吞噬性小胶质细胞、正在进行细胞死亡的深染细胞以及神经组织的海绵样外观（（A） 和 （B））。上排图像（改编自⁵）：中排图像中标注区域的10倍放大视图。中排图像：下排图像中标注区域的10倍放大视图。（A，中排） 神经网高倍放大图像，显示突触结构（A， 下排），突触小泡（SVs）和突触后密度（PD）。（B，中排） 阿米巴样小胶质细胞或可能是巨噬细胞（中排，M）的高倍放大图像，显示典型的阿米巴样小胶质细胞特征（下排），包括明显的高尔基体（G）以及包含溶酶体空泡（L）在内的包涵体。比例尺：50 µm（顶部）、5 µm（中部）和0.5 µm（底部）。本图改编自⁵。请点击此处查看此图的放大版本，或访问在线完整数据（nanotomy.org）。

讨论

透射电镜（EM）能够在生物环境中以高分辨率成像大分子，从而分析细胞背景。然而，这种方法通常限制了视野范围。大尺度三维电镜特别适用于通过生成纳米级分辨率的三维重构图像来绘制神经元连接图谱，但需要复杂的数据处理¹⁰。相比之下，二维大尺度电镜仅需单一切片并对成像数据进行拼接，任何拥有网络浏览器的人都可以对数据进行评估。我们及其他研究团队此前已利用大尺度电镜分析组织和完整动物。与大多数方法一样，基于透射电镜（TEM）和扫描电镜（SEM）的图像拼接各有优势。本文采用扫描透射电镜（STEM），可在高分辨率下获得大视野图像。通常情况下，一幅STEM图像的视野相当于约100幅TEM图像的视野，在高分辨率下成像大视野时可显著减少拼接工作量。若需要更高分辨率，TEM可能更具优势。STEM相较于TEM的优势在于，即使未染色的样品也能获得良好的超微结构对比度⁶。

此外，本文所述方法可简单调整后用于安装在硅晶圆上的切片进行背散射电子检测（BSD），从而扩展至多种显微镜系统的应用。可进行HTML缩放的组织电镜文件在定量分析、共享尚未充分挖掘的数据、整合光镜与电镜数据（CLEM）⁸、科学研究中的成果展示、患者数据分析以及教学方面均具有重要价值。在大规模扫描电镜（SEM）研究中，可使用硅晶圆（透射电镜TEM中则不可），其具有两个主要优势：一是可采用背散射电子检测（BSD），而BSD在扫描电镜上比STEM检测更为普遍；二是大尺寸切片（>1 mm²感兴趣区域）的安装更为简便。相比之下，单槽载网的切片安装过程费时费力且技术难度较高。关于TEM、SEM与STEM的详细对比，可参见其他文献⁶。BSD成像的一个缺点是与STEM相比，图像噪声更高。这一问题可通过延长像素驻留时间部分补偿，但会导致采集时间显著增加。

尽管样品制备需要相对标准的透射电镜处理流程（固定、包埋和切片）^5-7，但在技术上要切出完全无伪影的大面积超薄切片仍具挑战性。切片非常脆弱，在成像过程中容易断裂、折叠或被破坏，而每次数据集的采集通常需要数小时。然而，由于原始无偏数据可在线共享，未来将更便于与已发表的数据进行比较，并可将开放领域中已发表的数据集用作对照。目前，具备大规模分析能力的电镜设备较少，因此该技术的可及性仍有一定限制，但大多数成像中心欢迎合作研究。

对于大尺度切片，组织样本必须在整个范围内得到充分固定。因此，通常将快速但固定效果适中的固定剂PFA与缓慢但固定效果强的固定剂GA混合使用。无伪影地切割和拾取大尺寸切片较为困难。与在单孔载网上收集切片相比，采用晶圆片结合BSD的方法操作更为简便。相较于传统的透射电镜（TEM），重金属后染色过程更为关键，因为整个切片都会被成像，任何伪影都将清晰可见。由于操作方式的差异，习惯使用透射电镜（TEM）的研究人员通常难以转向扫描电镜（SEM）的操作。

定量分析与数据共享 - 在单张电镜图像中对亚细胞特征进行定量分析具有挑战性。大尺度图像的自由缩放功能可便捷地识别出感兴趣的细胞，并可在同一数据集中对细胞内部进行纳米级测量。这些数据集表明，基于多尺度可检测的特征，可在大范围组织切片中快速、无偏倚地识别和定量特定细胞类型。例如，小胶质细胞可根据其形态和致密的细胞质进行识别。随后，通过放大至单个细胞，可在同一数据集中进一步测量这些细胞的纳米级亚细胞和分子特征，正如我们先前在大规模电镜组织培养数据集中对内质网宽度所进行的测量²。纳米解剖学（nanotomy）的另一个优势在于，将大规模数据集在线共享后，其他研究者可重新检视数据，寻找其他特征，并据此提出新的假设。

CLEM - 除了有助于定量的电镜分析外，大规模电镜成像还更便于将光学显微镜下的标记与电镜水平的结构进行关联⁸。在本示例中，展示了斑马鱼消融模型中存在吞噬性小胶质细胞的现象。神经科学领域的一个重要问题是：小胶质细胞以及其他潜在的吞噬性和免疫细胞来源各自具有怎样的个体功能和贡献？早期的电镜研究表明，小胶质细胞在疾病状态下具有独特的亚细胞特征¹⁸。然而，由于小胶质细胞在基因表达、形态和功能上与其他免疫细胞存在较大重叠，因此特别在病理条件下难以对其进行特异性标记。因此，尚不清楚小胶质细胞在超微结构水平上是否以及何时会与其他来源的免疫细胞（包括单核细胞来源的浸润性巨噬细胞）存在差异。明确这些细胞之间是否存在超微结构差异，将为分析其功能差异提供一个起点。结合特异性的转基因标记或表达标记与CLEM技术，可实现对特定细胞群体所独有的超微结构特征的检测。

诊断 & 展示与教育 - 通过在同一数据集中实现从纳米级到微米级的可视化，电子显微镜数据得以更广泛地被受众理解。随着相关联技术及大规模电子显微镜技术的可能性和工具不断增加，我们预期电子显微镜将在基础与医学研究中迎来复兴。本文所展示的方法已应用于斑马鱼脑损伤模型⁵，但已用于人体组织⁷，大鼠脑³在糖尿病大鼠模型中⁴ 以及在细胞培养中²，也可与基于透射电子显微镜（TEM）的方法联合使用¹ 展示了该方法的多功能性。显微镜操作者不再记录经过高度筛选因而存在偏倚的图像，而是记录所有大量超微结构特征，供全球范围内的分析使用。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
化学试剂
低熔点琼脂糖	VWR	444152G
三卡因（Tricaine）	Sigma	E10521
吐温-X-100（Triton-X-100）	Sigma	X100
戊二醛	Polysciences	1909
二甲胂酸钠	Sigma	C0250
四氧化锇	Electron Microscopy Sciences	19114
亚铁氰化钾（K4[Fe(CN)]6）	Merck	4984
乙醇	VWR	20821.365
醋酸铀酰	Merck	8473
四硼酸钠	Merck	1063808
甲苯胺蓝	Merck	1273
碱性品红	BDH	340324
柠檬酸铅	BDH	discontinued
EPON
十二烯基琥珀酸酐	Serva	20755
甲基纳迪克酸酐	Serva	29452
环氧甘油醚 100	Serva	21045
DMP-30	Polysciences	553
标准平底包埋模具	Electron Microscopy Sciences	70901
金刚石切片刀	Diatome Inc.
铜网	Electron Microscopy Sciences
双面碳导电胶带	Electron Microscopy Sciences
蔡司 Supra55 扫描电镜	Zeiss
Leica EM UC7 超薄切片机	Leica
Atlas 外部扫描发生器	Fibics