由于三维藻酸盐微球培养方法具有操作简便和可重复性高的优点，因此被选用于维持垂体腺瘤细胞的生长。实验步骤包括首先对肿瘤组织进行酶消化和机械解离，随后将获得的细胞悬液包埋于藻酸盐微球中。
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摘要
摘要
本文描述了一种三维培养方法，其中将垂体腺瘤原代细胞培养于海藻酸盐微珠中。海藻酸盐是一种来源于褐藻的多聚物。简而言之，将肿瘤组织切成小块后，用胶原酶和胰蛋白酶进行酶消化处理，随后获得细胞悬液。将肿瘤细胞悬液与1.2%的海藻酸钠混合，滴入CaCl2溶液中，海藻酸盐/细胞悬液在接触CaCl2后即刻凝胶化，形成球形微珠。嵌入海藻酸盐微珠中的细胞通过添加20%胎牛血清（FBS）的培养基获得营养供给。在海藻酸盐微珠中的三维培养可长期维持腺瘤细胞的活力，最长可达四个月。此外，可通过柠檬酸钠溶液洗涤微珠，将细胞从海藻酸盐中释放出来，并接种于玻璃盖玻片上，以进行后续的免疫细胞化学分析。利用该细胞培养模型，可实现肌动蛋白细胞骨架的固定与可视化，且其结构紊乱程度最小。综上所述，海藻酸盐微珠为垂体腺瘤细胞的维持提供了一种可靠的培养体系。
引言
三维支架已广泛应用于细胞培养，因为它们为培养的细胞提供了三维结构支持，并维持了细胞间的相互通讯1。来源于天然的聚合物材料已被用于制备三维支架，包括I型胶原蛋白、壳聚糖和海藻酸盐。海藻酸盐是一种从褐藻Macrocystis pyrifera（巨藻）中提取的天然聚合物。该聚合物由重复的β-D-甘露糖醛酸（M）和α-L-古洛糖醛酸（G）单元组成2，在某些二价阳离子（如钙离子和钡离子）存在下可形成稳定的凝胶。氯化钙（CaCl2）溶液通常被用作交联试剂以形成海藻酸盐微球。将海藻酸盐溶液滴入CaCl2溶液中后，会立即形成三维球形凝胶。当海藻酸盐溶液与细胞混合后，细胞即被包埋于海藻酸盐微球中3。
海藻酸盐具有多种特性，使其可作为包封多种细胞的基质，包括软骨细胞4、骨骼肌成肌细胞5和神经干细胞6。它是一种惰性材料，允许营养物质、氧气和代谢产物扩散，从而维持细胞的存活与功能；此外，与其他基于凝胶的培养系统不同，包埋在海藻酸盐微球中的细胞还可通过钙螯合剂（如柠檬酸钠）从支架中释放出来，进而收获细胞用于后续研究7。
垂体腺瘤通常是良性肿瘤，增殖率较低。大鼠垂体腺瘤细胞系已成功在二维培养系统中进行培养8。然而，分泌性人垂体细胞肿瘤的培养进展并不理想；离散的垂体瘤细胞在体外培养中生长状况差，细胞贴壁和铺展能力有限，通常在培养皿中形成漂浮的细胞团块9,10。
为了获得垂体瘤细胞悬液，已进行了多种尝试，包括酶消化与机械分散相结合的方法11、单纯机械分散法12以及肿瘤组织外植块培养法10。采用这些方法，不同研究者在不同时长内获得了具有活性的贴壁细胞培养物。肿瘤分泌细胞在这些二维培养系统中的存活能力取决于肿瘤类型及其增殖速率9。然而，在长期培养中，呈现成纤维细胞表型的细胞逐渐占据主导地位11,13。本文介绍一种从包埋于海藻酸盐微球中的垂体腺瘤细胞获取原代培养的方法，并进一步将细胞从海藻酸盐支架中释放，从而能够对其细胞生物学特性进行详细分析，例如细胞骨架的排列结构。
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方案
本研究使用人体材料的部分已获得当地医学机构伦理委员会以及国家理工学院研究中心与高等研究院伦理委员会的批准。
1. 肿瘤样本获取
- 通过经蝶窦手术从患者体内获取垂体腺瘤组织活检样本14。
- 收集垂体腺瘤样本，并将其放入含有50 ml新鲜199培养基（M199）的无菌玻璃瓶中，培养基中添加10%胎牛血清（FBS）、0.6 mg/ml碳酸氢钠、2.4 mg/ml HEPES和1%抗生素（青霉素/链霉素），pH值为7.4。将样本置于装有冰的玻璃瓶中保存。
注意：肿瘤组织可在手术后数小时内进行处理。 - 将肿瘤样本置于冰上的玻璃瓶中运送至实验室。
2. 酶解组织解离溶液、胰蛋白酶抑制剂溶液和海藻酸盐溶液的制备
注意：在进行细胞培养操作前，请预先配制以下溶液。使用前，所有溶液均需用 0.22 µm 滤膜过滤。
- 通过将 5 mg 胶原酶（I 型）溶解于 5 ml 无血清 M199 培养基中，制备 1% 胶原酶溶液。
- 通过将 0.01 g 胰蛋白酶溶解于 10 ml 含 0.3% EDTA 的 PBS 溶液中，制备 0.01% 胰蛋白酶溶液。
- 通过将 2 mg 大豆胰蛋白酶抑制剂溶解于 20 ml 无血清 M199 培养基中，制备 0.1% 胰蛋白酶抑制剂溶液。
- 将 20 µl 浓度为 134 U/ml 的 DNA 酶 I 加入 4 ml 胰蛋白酶抑制剂溶液中，制备 DNA 酶溶液。
- 通过将 22.8 mg EGTA 溶解于 40 ml 155 mM NaCl 溶液中，制备 EGTA 溶液（1.2 M），调节 pH 至 7.4，然后加水定容至 50 ml。
- 通过将 238 mg HEPES 溶解于 50 ml 155 mM NaCl 溶液中，制备 HEPES 溶液（20 mM）。
- 通过将 1.2 g 海藻酸钠溶解于 100 ml HEPES 溶液中，制备 1.2% 海藻酸溶液，并对溶液进行高压灭菌。
- 通过将 750 mg CaCl2 溶解于 50 ml HEPES 溶液中，制备钙溶液（102 mM），调节 pH 至 7.4。
3. 原代细胞培养与海藻酸盐包封
- 在超净工作台内，将肿瘤组织置于一个含有约 20 ml PBS（无 Ca2+ 和 Mg2+，pH 7.4）的 35 mm 培养皿中（PBS*）。
- 用手术镊夹取组织，转移至另一含有新鲜 PBS* 的培养皿中，轻轻洗涤组织。重复此步骤，直至红细胞和碎片被完全去除。
- 用手术镊固定垂体腺瘤组织，使用小型手术剪将其剪成小块。用边缘圆滑的巴斯德吸管将组织碎片和 PBS* 转移至 15 ml 离心管中，在室温下以 68 × g 离心 10 分钟。
注意：若需将巴斯德吸管边缘圆化，可将吸管尖端在本生灯火焰上轻微灼烧。 - 用巴斯德吸管吸除 PBS*，加入 3–5 ml 胶原酶溶液（每 65 mm3 组织约加 5 ml），通过反复倒置混匀 2–3 次。将组织在 37 °C 条件下，于胶原酶溶液中持续旋转孵育 30 分钟。
- 在室温下以 68 × g 离心 10 分钟，随后用巴斯德吸管吸除胶原酶溶液。
- 加入 5 ml DNA 酶溶液，通过倒置混匀 2–3 次，然后在室温下以 68 × g 离心 10 分钟。
注意：若组织未完全解离，可使用胰蛋白酶进行第二次酶消化，37 °C 孵育 3 分钟。加入两倍体积的胰蛋白酶抑制剂溶液以终止消化反应。 - 用巴斯德吸管吸弃上清液。将沉淀物重悬于 1 体积 EGTA 溶液中，并与 2 体积海藻酸钠溶液混合。
- 使用巴斯德吸管轻轻吹打，使细胞悬液与海藻酸钠充分混匀。取一支无菌 21 G 针头的注射器，拔出活塞；用移液器将海藻酸钠-细胞混合液装入注射器中。
- 将活塞轻轻插入注射器，小心地将海藻酸钠-细胞混合液逐滴推入盛有约 30 ml 富钙溶液的玻璃烧杯中。
- 将注射器针头置于 CaCl2 溶液液面上方约 5 cm 处。海藻酸钠-细胞悬液在接触 CaCl2 后立即形成球形凝胶珠。将海藻酸钠珠在钙溶液中保持 5 分钟。
注意：在滴加珠粒时，用手缓慢做圆周运动搅动烧杯，防止珠粒相互粘连。 - 用巴斯德吸管小心吸除钙溶液，并用含 20% 胎牛血清（FBS）的 M199 培养基洗涤珠粒两次，每次 3–5 ml。
- 用无菌刮铲将海藻酸钠珠转移至标准 T25 组织培养瓶中，加入 4–5 ml 含 20% FBS 的 M199 培养基，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中孵育。每隔三天更换一次培养基。
4. 从海藻酸盐中释放细胞
注意：在从海藻酸盐微珠中释放细胞之前，先用多聚-D-赖氨酸包被直径为13 mm的盖玻片。
警告：硫酸是一种强腐蚀性酸，APTS 可引起眼睛和皮肤刺激。操作这些试剂时应佩戴乳胶手套。
- 在通风橱中，使用尖头镊子将盖玻片浸入盛有20%硫酸水溶液的玻璃培养皿中，室温下处理1小时。
- 倾去硫酸，用蒸馏水洗涤盖玻片，每次5分钟，共洗涤五次。使用尖头镊子将洁净的盖玻片放入含有0.1 M NaOH的培养皿中，室温下处理5分钟。15.
- 倾倒出 NaOH，用蒸馏水洗涤一次，吸去水分并干燥盖玻片。
- 使用微量移液器将APTS（aminopropyl-triethoxysilane）均匀涂覆在盖玻片上，作用4分钟（6个盖玻片使用500 µl）；用蒸馏水充满培养皿，迅速吸去水分，并继续用蒸馏水洗涤，用尖头镊子轻轻移动盖玻片，使水能够渗入其下方。
- 吸去水分，干燥盖玻片，用尖头镊子将盖玻片放入洁净的培养皿中，并在微波炉中分3次进行灭菌，每次45秒。将100 µg聚-D-赖氨酸（0.1 mg/ml）溶于1,000 µl无菌水中。
- 将盖玻片与约 50 µl 多聚-D-赖氨酸在室温下孵育 5 分钟。彻底吸除多聚-D-赖氨酸。
注意：这一点很重要，因为培养基中可溶性的聚-D-赖氨酸会抑制细胞增殖。 - 用无菌水将盖玻片冲洗五次，每次5分钟。吸除无菌水，将盖玻片置于超净工作台中晾干。
- 为分析肌动蛋白细胞骨架，需将垂体细胞从海藻酸盐中释放出来。用1 ml移液器吸头从培养瓶中取出部分海藻酸盐微珠，转移至15 ml离心管中。
- 加入5 ml 55 mM柠檬酸钠（溶解323.6 mg Na3C6H5O7, 2 H2在20 ml HEPES溶液中重悬，于室温下以68 × g离心10分钟。吸除上清液并弃去。
- 将沉淀重悬于1 ml含20% FSB的预热M199培养基中；用巴斯德吸管轻轻混匀细胞悬液。
警告：鬼笔环肽（PHALLOIDIN）和DAPI具有毒性，操作时需佩戴手套。 - 为计数细胞，将125 µl的0.4%台盼蓝溶液转移至1.5 ml离心管中，加入75 µl M199培养基和50 µl上一步获得的细胞悬液（稀释倍数 = 5），充分混匀。
- 使用微量移液器吸头将约10 µl台盼蓝-细胞悬液加入血细胞计数板的计数室中。
- 使用倒置显微镜在相差照明下用血细胞计数板进行细胞计数。计数中央1 mm²大方格及四个角上的1 mm²大方格内的所有细胞。将每个大方格的平均细胞数乘以稀释倍数（即10），计算出每毫升的细胞密度。4例如，若每个方格的平均计数为45个细胞，则细胞浓度为45 × 5 × 10⁴ = 2.25 × 10⁶ 个细胞/毫升。
注意：计数血细胞计数板 chamber 中十个方格内的细胞。不计数接触底部和右侧中线的细胞。 - 将35,000个细胞接种于经多聚-D-赖氨酸包被的13 mm直径玻璃盖玻片上。
5. 肌动蛋白细胞骨架排列
- 培养 48 小时后，用巴斯德吸管移除培养基，迅速向每个盖玻片加入 500 µl PBS，立即吸除 PBS。
- 每张盖玻片加入 500 µl 固定透化缓冲液（0.1 M PIPES，pH 6.75，4% PEG-6000，1 mM EGTA，1 mM MgSO4，0.5% Triton X-100 和 2% 甲醛），在 37 °C 下固定和透化细胞 10 分钟。
- 吸除固定液，每张盖玻片加入 500 µl 含 3.5% 多聚甲醛的 PBS 溶液，室温孵育 30 分钟，随后移除多聚甲醛溶液。
- 用 PBS 洗涤盖玻片三次，每次每张盖玻片加入 500 µl PBS，每次洗涤 5 分钟，在室温下持续振荡冲洗。
- 用 50 mM 氯化铵室温孵育细胞 10 分钟，吸除氯化铵溶液后重复步骤 5.4。
- 用含 1% BSA（无 IgG、无蛋白酶）的 PBS 溶液室温孵育细胞 30 分钟，吸除 BSA 溶液后重复步骤 5.4。
- 用 50 µM 罗丹明标记的鬼笔环肽室温孵育细胞 7 分钟，重复步骤 5.4。
- 用 PBS 稀释的 255 µM DAPI 室温孵育细胞 5 分钟，重复步骤 5.4。最后用封片剂封片，并用指甲油封固。
- 使用共聚焦激光扫描显微镜，配备 63X 物镜，在激发波长 541 nm 下采集肌动蛋白细胞骨架结构的图像。
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结果
该方案已成功应用于腺瘤性垂体细胞在海藻酸盐微球中的培养与长期维持。 图1 显示了培养三个月后包埋于海藻酸盐微球中的细胞；在倒置光学显微镜下，这些细胞呈现双折射的圆形结构（图1）。 图2 显示了包埋于海藻酸盐中的大鼠垂体腺瘤细胞中 N-钙黏蛋白的定位。N-钙黏蛋白定位于细胞间连接处（图2A 和 2C），细胞核则显示染色质呈伸展状态（图2B 和 2C）。
藻酸盐微珠中的肿瘤细胞在培养中可保持活性长达4个月；因此，可在不同时间点从藻酸盐微珠中释放细胞，从而允许对同一细胞培养物中的细胞生物学不同方面进行分析。例如，通过检测Ki-67的免疫反应性，测得10例无功能性人垂体腺瘤的增殖指数，平均标记指数为19.2 ± 1.5%（均值...
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讨论
该方案包含若干关键步骤。首先是微珠尺寸的均一性，这是保持所有细胞培养中营养物质和气体扩散条件一致所必需的。根据我们的经验，使用21 G针头制备海藻酸盐微珠，可有效获得尺寸均一的微珠培养物。第二个重要因素是针头与液面之间的距离；该距离不得超过5 cm，以避免海藻酸盐/细胞溶液流冲击氯化钙溶液液面时造成微珠变形和细胞死亡。第三个关键步骤是玻璃棒搅拌，将微珠滴入搅拌中的溶液以防止其相互粘连。粘连会导致细胞包封不均。
根据具体的研究问题，可对本实验方案进行一些修改。例如，根据我们的经验，可将海藻酸钠溶液与基底膜蛋白（如 IV 型胶原）混合，然后按照前述方案操作，制备出三维海藻酸盐支架。另一种可能性是在直径为 15 mm 的孔中制备悬浮的海藻酸盐凝胶垫；细胞可接种于这些凝胶的表面或内部。当使用海藻酸盐进行实验时，若需要调整 Ca2+ 或 Mg2+ 的浓度，则可能需要进行故障排查，因为水凝胶的稳定性可能因此受到影响。值得注意的是，Ba2+ 和 Cu2+ 交联的海藻酸盐凝胶在水溶液中相对稳定，但遗憾的是，这些...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢 O. Rios 先生提供的技术支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| 199 培养基 | Invitrogen | 31100-027 | 用于细胞培养，使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 胎牛血清 | PAA | A15-751 | |
| 碳酸氢钠 (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| N-(2-羟乙基)哌嗪-N´-2-乙磺酸 (HEPES) | Sigma | H-4034 | |
| 青霉素/链霉素 | PAA | P11-010 | |
| PBS（杜氏磷酸盐缓冲液） | Invitrogen | 21600-044 | |
| I 型胶原酶 | Worthington | 4176 | |
| 胰蛋白酶 | Invitrogen | 27250-018 | |
| 乙二胺四乙酸 (EDTA) | Research Organics | 3002E | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Invitrogen | 17075-029 | |
| 脱氧核糖核酸酶 (DNAse) | Worthington | 2139 | |
| 海藻酸，来源于巨藻 (Macrocystis Pyrifera) | Sigma | A-2158 | |
| 氯化钙 (CaCl2) | J.T. Baker | 1332 | |
| 柠檬酸钠 (Na3C6H5O7) | J.T. Baker | 3646 | |
| 哌嗪-N,N′-双(2-乙磺酸) (PIPES) | Research Organics | 9624P | |
| 聚乙二醇 6000 (PEG 6000) | Calbiochem | 528877 | |
| 乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸 (EGTA) | Research Organics | 9574E | |
| 硫酸镁 (MgSO4) | J.T. Baker | 2500 | |
| 吐温-100 (Triton-X 100) | Sigma | X100 | |
| 甲醛 | J.T. Baker | 2106 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | P6148 | |
| 氯化铵 (NH4Cl) | J.T. Baker | 660 | |
| 牛血清白蛋白 (BSA)，免疫球蛋白 G 缺失型 | Jackson Immuno Research | 001-000-161 | |
| 鬼笔环肽-四甲基罗丹明异硫氰酸酯 (Phalloidin–Tetramethylrhodamine B isothiocyanate) | Sigma | P1951 | 有毒。操作时需戴手套 |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐 (DAPI) | Invitrogen | D1306 | 有毒。操作时需戴手套 |
| 硫酸 (H2SO4) | J.T. Baker | 9681 | 强腐蚀性。操作时需戴手套 |
| 氢氧化钠 (NaOH) | Merck | 1.06498 | 可能引起眼睛和皮肤刺激。操作时需戴手套 |
| (3-氨基丙基)三乙氧基硅烷 (APTS) | Sigma | A-3648 | |
| 聚-D-赖氨酸氢溴酸盐 | Sigma | P7280 | |
| 台盼蓝溶液 | Sigma | T8154 | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备 | 有毒：可能致癌。操作时需戴手套 | ||
| 旋转混合仪 | Boekel Scientific | 型号 230300 | |
| 离心机 | DuPont Corporation | 型号 Sorvall TC6 | |
| 摇床 | Lab-line Instruments | 型号 314-820 |
参考文献
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