改善二维与三维皮肤模型 体外 使用大分子拥挤效应的模型

摘要

我们提出了一种利用大分子拥挤剂（MMC）获取富含细胞外基质蛋白的细胞衍生基质的实验方案。此外，我们还介绍了一种将MMC应用于三维类器官皮肤共培养体系构建的方案，该方法可在维持构建物成熟度的同时缩短培养时间。

摘要

胶原蛋白家族是一类糖蛋白，代表了人体内主要的结构蛋白，也是现代组织工程中所用生物材料的关键组分。目前面临的技术瓶颈是胶原蛋白的沉积问题 体外，因为其速度极慢，导致结缔组织形成不充分以及组织凝聚力较差，尤其是在皮肤模型中。本文介绍一种方法，通过向皮肤培养物中添加不同大小的蔗糖共聚物以产生大分子拥挤效应（MMC），从而显著增强胶原蛋白的沉积。特别是在MMC条件下，与对照组相比，真皮成纤维细胞沉积了大量I型、IV型、VII型胶原蛋白以及纤维连接蛋白。

该方案还描述了一种去细胞化密集细胞层的方法，通过免疫细胞化学证实，大量细胞外基质（ECM）保留在培养表面。利用干涉反射显微镜研究了基质的总质量及其分布模式。有趣的是，成纤维细胞、角质形成细胞以及共培养体系所产生的细胞来源基质（CDM）在组成和形态上各不相同。这些CDM可作为二次细胞接种的"生物支架"，从而避免目前常用的来源于异种动物的涂层或支架材料，推动其向更具临床相关性的应用方向发展。

此外，本方案描述了在三维类器官皮肤共培养模型的浸没阶段应用MMC，该处理足以增强真皮-表皮连接处（DEJ）的细胞外基质沉积，特别是作为锚定纤维主要成分的胶原蛋白VII。透射电子显微镜证实，与对照组相比，添加MMC培养的组织中存在锚定纤维。这一发现具有重要意义，因为锚定纤维可将真皮与表皮连接在一起，因此，预先形成成熟的DEJ可能有助于提高皮肤移植受体的移植物稳定性和整体伤口愈合效果。此外，使用MMC可将培养时间从5周缩短至3周即可获得成熟的皮肤结构，从而降低了成本。

引言

皮肤通过防止水分流失和病原体侵入形成保护屏障。皮肤主要由三个部分组成：富含基质的真皮¹、位于其上方的复层表皮^2,3,4，以及两者之间的真皮-表皮连接区^5,6。真皮主要由胶原纤维和弹性纤维构成，其中分布稀疏的成纤维细胞⁷。相比之下，细胞丰富的表皮由多层角质形成细胞组成。最内层的角质形成细胞具有增殖能力，可提供新的基底细胞，以更新并替代终末分化的角质形成细胞；这些终末分化的细胞持续向外迁移至皮肤最外层，失去细胞核和细胞质成分，最终形成经历脱屑的角化层。

真皮-表皮连接是一种特殊类型的基底膜，由相互连接的基质分子构成，将表皮锚定于真皮。真皮中的Ⅰ型胶原纤维与富含Ⅳ型胶原的致密板相连的Ⅶ型胶原锚定原纤维交织在一起。锚定原纤维（层粘连蛋白5、ⅩⅦ型胶原和整合素）进一步将致密板与基底角质形成细胞的半桥粒相连接。基底角质形成细胞（基底层）具有增殖更新的能力，也可分化并分层形成上基底层，包括棘层、颗粒层，最终形成角质层，后者构成皮肤与外界环境的接触面。 途中 从基底层到角质层，角质形成细胞会转换细胞角蛋白的表达模式，最终经历凋亡，并通过转谷氨酰胺酶的催化作用，将特定蛋白质共价交联形成角化包膜，将自身包裹其中。

重建皮肤及其各层结构 体外，包括真皮-表皮连接处和真皮细胞外基质的复杂结构，以及模拟角化过程，长期以来一直被视为科学家和生物工程师面临的一项挑战性任务。皮肤组织工程领域已取得显著进展，例如，已成功从患者活检组织中分离出皮肤细胞，并利用患者来源的皮肤细胞构建出皮肤类器官培养模型。⁸然而，皮肤细胞自身分泌细胞外基质蛋白能力较差的问题仍未解决，导致皮肤模型效果不理想。此外，目前生成三维类器官皮肤共培养模型所需时间介于四周至八周之间，若引入大分子拥挤剂，该周期有望缩短。缩短培养时间可降低试剂成本，减少细胞衰老的发生率，并在该产品用于临床时缩短患者的等待时间。

大分子拥挤效应（MMC）是指向培养基中添加特定的大分子物质，以产生排阻体积效应。这种效应会影响酶促反应速率，包括在标准水相培养条件下通常较慢的前胶原蛋白的蛋白水解切割过程^9-13。在MMC条件下，无需增加试剂用量即可加快酶促反应速度^14,15，就前胶原蛋白切割而言，表现为拥挤培养体系中I型胶原分子的生成量显著高于非拥挤对照组¹⁰。由于前胶原向胶原的转化能够促进胶原结构的组装，因此经MMC培养48小时的成纤维细胞所产生的I型胶原量明显多于常规非拥挤条件下培养长达四周的成纤维细胞^11,16,17。除了对影响细胞外基质（ECM）形成、稳定和重塑的酶活性具有作用外，MMC还被证实可直接促进并调控胶原纤维的形成^18,19。

本文介绍了一种增强皮肤细胞（特别是真皮成纤维细胞和表皮角质形成细胞）细胞外基质（ECM）生成的方法。此外，我们还证明了在单层培养条件下，经MMC处理后产生的富含细胞外基质的产物可去细胞化，并用作纯细胞来源基质（CDM）。

我们采用一种非常规方法来观察并充分认识皮肤细胞在有丝分裂抑制剂（MMC）存在下培养时所沉积的细胞外基质（ECM）。干涉反射显微镜通常用于研究细胞-基质相互作用或细胞与玻璃表面的接触点。在本系统中，该技术被用于观察沉积在玻璃表面的基质总量。通过将干涉反射显微镜与荧光免疫染色相结合，我们能够在有或无MMC的条件下，获得关于细胞外基质组成和分布模式的最全面信息。

类器官皮肤共培养是一种经典的皮肤建模方法 体外 在三维环境中。尽管二维共培养可能提供重要信息，但在将这些数据进行转化并重新应用于 体内 环境，其本质上是一种三维结构。特别是皮肤角质形成细胞具有极性，包含对维持稳态和细胞黏附至关重要的顶端和基底区段。此外，位于基底层之上的角质形成细胞中典型表层蛋白（如角蛋白1、角蛋白10和丝聚合蛋白）的表达，仅在角质形成细胞分层和终末分化过程中出现。由于典型的单层培养体系中几乎不发生终末分化，因此该培养系统通常无法实现表层蛋白的表达。为此，类器官培养最初在培养液中进行，随后被转移至气-液界面以促进角质形成细胞的分化。这种方法可诱导分层标志物的表达，甚至出现角化现象，从而更真实地反映表皮生理状态。尽管此前已有研究团队成功构建了类器官皮肤共培养体系，但功能性真皮-表皮连接区的建立仍是一大难题。本文介绍一种新型的类器官皮肤共培养方法，可在更短的时间内形成增强的基底膜，且不损害组织构建物的成熟度。该方法将为皮肤模拟物提供 体外 建模、皮肤生物学研究以及多种筛选实验。

方案

1. 二维皮肤细胞培养中的大分子拥挤效应

1. 在24孔板的每个孔中接种50,000个细胞（原代成纤维细胞、原代角质形成细胞，或原代成纤维细胞与角质形成细胞的共培养体系）。每孔加入1 ml对应细胞类型的生长培养基进行接种。
2. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中过夜，使其贴壁。
3. 弃去旧培养基，更换为含大分子拥挤剂和100 µM抗坏血酸的新鲜培养基1 ml。拥挤剂混合物包含37.5 mg/ml Ficoll 70和25 mg/ml Ficoll 400。成纤维细胞培养基（FM）使用DMEM，添加10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素抗生素。角质形成细胞培养于无血清培养基KSFM或CnT-57中。共培养体系则使用50% FM与50%无血清培养基的混合液进行维持。
4. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育6天，每隔2天更换一次培养基。

2. 皮肤细胞培养物的荧光免疫染色

1. 用 1× PBS 将细胞培养物洗涤两次。
2. 根据抗体说明书，使用甲醇或甲醛固定细胞培养物。
   1. 甲醇固定
      1. 向每个孔中加入 500 µl 冷甲醇，在 -20 °C 下孵育 10 分钟。吸除固定液并丢弃甲醇废液。在超净工作台中风干。
   2. 甲醛固定
      1. 向每个孔中加入 500 µl 2% 甲醛溶液，在室温下孵育 15 分钟。吸除固定液并丢弃甲醛废液。
      2. 用 1× PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
      3. 向每个孔中加入 1 ml 1× PBS。
3. 使用抗体进行荧光免疫染色
   1. 向每个孔中加入 500 µl 3% 牛血清白蛋白（用 1× PBS 稀释）溶液，在室温下孵育 30 分钟。吸除封闭液并弃去。
   2. 一抗孵育
      1. 若直接从培养板成像：向每个孔中加入 200 µl 一抗溶液（用 10% 山羊血清按 1:100 稀释），在室温下孵育 90 分钟。
      2. 若使用盖玻片：取 50 µl 一抗溶液（用 10% 山羊血清按 1:100 稀释）滴加于一片平整的 Parafilm 上。将盖玻片细胞面（带有细胞的一侧）朝下接触溶液，确保完全覆盖细胞面且无气泡。在室温下孵育 90 分钟。
   3. 吸除一抗溶液并弃去。
   4. 用 1× PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。
   5. 二抗孵育
      1. 若直接从培养板成像：向每个孔中加入 200 µl 二抗溶液（用 10% 山羊血清按 1:400 稀释），在室温下孵育 30 分钟，同时用铝箔包裹培养板避光。
      2. 若使用盖玻片：取 50 µl 二抗溶液（用 10% 山羊血清按 1:400 稀释）滴加于一片平整的 Parafilm 上。将盖玻片细胞面朝下接触溶液，确保完全覆盖且无气泡。在室温下孵育 30 分钟，同时用铝箔覆盖 Parafilm 避光。
   6. 吸除二抗溶液并弃去。
   7. 用 1× PBS 洗涤三次，每次 5 分钟。向每个孔中加入 1 ml 1× PBS。
   8. 封片
      1. 若直接从培养板成像：无需封片，直接进行显微镜观察。
      2. 若对盖玻片成像：将盖玻片用封片剂封固于载玻片上，置于铝箔包裹的容器中避光过夜干燥。随后进行显微镜观察。
4. 使用配备 40X/1.30 油镜的共聚焦激光扫描显微镜采集图像。

3. 皮肤细胞培养物的蛋白质印迹分析

1. 用 1× PBS 洗涤细胞层两次。
2. 将 100 µl 裂解缓冲液（见材料列表）分装至每个孔中（6 孔板规格）。用细胞刮刀刮取细胞层，并将溶液转移至微量离心管中。
3. 在 4 °C 条件下，以 15,330 × g 离心 30 分钟。将上清液转移至另一微量离心管中，弃去沉淀。
4. 取每份样品 13 µl，加入 5 µl 上样缓冲液和 2 µl 还原剂（见材料列表）。在 95 °C 加热 10 分钟。
5. 以 15,330 × g 离心 1 分钟，收集冷凝液。将样品上样至预制的 PAGE 凝胶中，以 100 V 电泳约 1 小时。
6. 为将分离的蛋白质转移至硝酸纤维素膜，将凝胶和膜夹在大小相同的滤纸和海绵之间，确保凝胶、膜、滤纸和海绵之间无气泡。封闭夹心式转膜盒，在 70 V 条件下转膜 2 小时。
7. 为检测转膜是否完全，将膜与 10 ml 丽春红 S 溶液孵育。用 0.1% PBS-Tween-20 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
8. 用 10 ml 5% 脱脂牛奶在室温下封闭 1 小时。用 0.1% PBS-Tween-20 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
9. 加入 10 ml 一抗溶液孵育 90 分钟（小鼠抗胶原蛋白 VII 抗体，LH 7.2，用 5% 脱脂牛奶按 1:1,000 稀释）。用 0.1% PBS-Tween-20 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
10. 加入 10 ml 二抗溶液孵育 30 分钟（辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG，用 5% 脱脂牛奶按 1:2,000 稀释）。用 0.1% PBS-Tween-20 洗涤膜三次，每次 10 分钟。
11. 将膜转移至暗盒中，加入 1 ml ECL 检测试剂。在膜上覆盖一张透明的薄塑料片。
12. 为检测化学发光信号，将感光胶片置于塑料片上并关闭暗盒。2–5 分钟后取出胶片，放入显影仪中显影。

4. 细胞来源基质的制备与使用

1. 在24孔板的每个孔中接种50,000个细胞（原代成纤维细胞、原代角质形成细胞，或原代成纤维细胞与角质形成细胞的共培养体系）。
2. 将细胞置于37 °C、5% CO₂的培养箱中过夜，使其贴壁。
3. 弃去旧培养基，更换为含有大分子拥挤剂和100 µM抗坏血酸的新鲜培养基。拥挤剂混合物包含37.5 mg/ml Ficoll 70和25 mg/ml Ficoll 400。成纤维细胞培养基（FM）为添加了10%胎牛血清（FBS）和1%青霉素-链霉素（pen-strep）的DMEM。角质形成细胞使用无血清培养基KSFM或CnT-57进行培养。共培养体系使用50% FM与50% KSFM或CnT-57的混合培养基维持。
4. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中培养6天，每2天更换一次培养基。
5. 对细胞层进行脱细胞处理，以获得细胞来源的基质（f-mat = 成纤维细胞来源基质，k-mat = 角质形成细胞来源基质，co-mat = 成纤维细胞与角质形成细胞共培养来源的基质）。
   1. 用1× PBS洗涤细胞层两次。
   2. 加入250 µl 0.5%脱氧胆酸钠，冰上孵育10分钟，随后吸除细胞裂解物。
   3. 重复步骤4.5.2三次。
   4. 用蒸馏H₂O洗涤细胞来源基质两次，之后将基质保存在1× PBS中。基质可在4 °C下储存最多1周。
6. 制备次级细胞悬液（例如，在f-mat上接种角质形成细胞）。
   1. 吸除1× PBS。
   2. 在细胞来源基质（f-mat）上接种50,000个角质形成细胞，置于37 °C、5% CO₂的培养箱中过夜，使其贴壁。
      注意：可直接在贴壁细胞上进行相关检测。

5. 细胞来源基质的表征

1. 荧光免疫染色：参见方案2。
2. 干涉反射显微镜
   1. 按照方案4.1–4.5，将细胞接种于玻璃盖玻片上。
   2. 获得细胞来源的基质后，按照方案2.2固定样品。
      注意：抗体染色为可选步骤。如需进行，请参见方案2.3。
   3. 使用配备40X/1.30油镜的共聚焦激光扫描显微镜进行图像采集。将针孔设为74 mm。
   4. 干涉反射显微镜（IRM）通道的滤光片使用LP 505，荧光红色通道使用BP 575-615 IR；分光镜设置：IRM通道使用NT 80/20，荧光红色通道使用HFT 405/488/561、NFT 565分光镜板。激光设置如下：荧光红色通道使用DPSS 561-10（波长561 nm）激光，功率设为1.1%；IRM通道使用HeNe633（波长633 nm）激光，功率设为5.0%。

6. 三维类器官皮肤共培养

1. 在细胞培养插件（6孔板格式）中制备包裹成纤维细胞的胶原凝胶。
   1. 取10 ml大鼠尾部I型胶原至预冷的烧杯中。
   2. 加入1 ml预冷的DMEM。加入0.5 ml的1 M NaOH以中和酸性胶原。加入0.5 ml成纤维细胞悬液（含1,200,000个成纤维细胞）。
   3. 使用预冷的移液器将溶液转移至6孔板中的细胞培养插件内。将总共12 ml溶液均匀分配至6个细胞培养插件中。
   4. 将凝胶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。
   5. 凝胶凝固后，将其浸入FM培养基中。24小时后，弃去旧培养基，更换为含大分子拥挤剂的新鲜培养基。向细胞培养插件内部加入2 ml培养基，外部也加入2 ml培养基。
2. 24小时后，在胶原凝胶表面接种角质形成细胞。
   1. 使用0.125%胰蛋白酶/螯合剂在37 °C下消化角质形成细胞5分钟。轻轻敲击培养瓶侧面使细胞脱落，并用含血清的培养基中和胰蛋白酶。计数细胞并制备角质形成细胞悬液（每块凝胶接种300,000个角质形成细胞，悬浮于200 µl培养基中）。
   2. 吸除细胞培养插件中的旧培养基。将角质形成细胞接种至凝胶表面。
   3. 将凝胶置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育1小时。
   4. 待角质形成细胞贴附于凝胶表面后，向细胞培养插件内部加入2 ml KSFM或CnT-57培养基，外部加入2 ml FM培养基，使凝胶处于气液界面以下。
3. 24小时后，弃去旧培养基，更换为含大分子拥挤剂的新鲜培养基。
4. 经过7天的浸没培养后，将培养体系转移至气液界面。
   1. 将细胞培养插件转移至深孔板中。向细胞培养插件外部加入10 ml分层培养基。保持细胞培养插件内部干燥。
5. 将培养物置于37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育，在接下来的14天内每3天更换一次培养基。
   注：在气液界面培养2周后，皮肤等效物已成熟，可进行收获（可速冻或福尔马林固定）。

7. 器官型皮肤等效物的收获与表征

1. 吸除分层培养基。
2. 使用镊子将培养插件转移至纸巾上，轻轻吸干插件底部残留的培养基。
3. 使用手术刀沿培养插件内缘进行环形切割。
4. 固定类器官皮肤共培养组织（连同PET膜）。
   1. 速冻固定
      1. 将凝胶结构转移至冷冻模具中，用OCT包埋剂覆盖模具内壁，然后将模具浸入液氮中10秒。
      2. 用镊子从液氮中取出已冻结的模具，用铝箔包裹，并将冷冻样品储存于-80 °C冰箱中。
      3. 使用冷冻切片机对冷冻样品进行切片，切片厚度为7 µm。
   2. 福尔马林固定
      1. 将“活检海绵垫”放入“活检盒”中，将凝胶结构置于海绵垫上，再轻轻放置另一块海绵垫覆盖于凝胶结构上方，关闭活检盒。
      2. 将活检盒完全浸入10%中性缓冲福尔马林溶液中，室温固定48小时。取出活检盒并妥善处理废液。
      3. 通过乙醇梯度脱水后，逐步用石蜡渗透样品，将固定后的样品包埋于石蜡块中，随后使用切片机对石蜡块进行切片。
5. 皮肤等效物的表征
   1. 免疫染色
      1. 适用于冷冻切片：
         1. 将切片在含10%山羊血清（以1×PBS稀释）的溶液中室温孵育1小时，随后用1×PBS洗涤以去除山羊血清。
         2. 将切片与一抗（以10%山羊血清按1:100稀释）在室温下孵育90分钟，再用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
         3. 将切片与二抗（以10%山羊血清按1:400稀释）在室温下避光孵育30分钟（容器需用铝箔包裹），再用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
         4. 使用封片剂将切片封固于盖玻片上，样品用铝箔覆盖，室温避光过夜干燥。
         5. 使用共聚焦显微镜配合40X/1.30油镜进行成像。
      2. 适用于福尔马林固定石蜡包埋切片：
         1. 使用递减浓度的乙醇进行脱蜡和水化（二甲苯 → 100%乙醇 → 90%乙醇 → 80%乙醇 → 70%乙醇 → 水），确保样品完全浸没于各溶液中，每步3分钟。
         2. 将切片在1%过氧化氢溶液中孵育30分钟，随后用1×PBS洗涤5分钟。
         3. 将切片置于柠檬酸溶液（10 ml柠檬酸溶液溶于90 ml水中）中，120 °C处理20分钟，随后室温冷却过夜。再用1×PBS洗涤三次，每次5分钟。
         4. 将切片在含10%山羊血清（以1×PBS稀释）的溶液中室温孵育1小时，随后用1×PBS洗涤以去除山羊血清。
         5. 将切片与一抗（以10%山羊血清按1:100稀释）在室温下孵育90分钟，再用1×PBS洗涤三次，每次10分钟。
         6. 将切片与未稀释的HRP标记聚合物在室温下孵育30分钟，随后用1×PBS洗涤三次，每次10分钟。
         7. 在微量离心管中，将1 ml DAB底物（3,3'-二氨基联苯胺）与1滴显色剂混合，将切片与此溶液孵育15秒至5分钟（出现棕褐色为阳性信号）。
         8. 用流动水冲洗切片以终止反应。
         9. 用苏木精对细胞核进行复染，持续5分钟，随后用流动水冲洗。
         10. 将切片在酸性乙醇溶液中孵育1分钟，随后用流动水冲洗。
         11. 将切片在Scott氏自来水溶液中孵育2分钟，随后用流动水冲洗。
         12. 可选：将切片与伊红孵育1分钟，随后用流动水洗涤。
         13. 使用递增浓度的乙醇进行脱水至二甲苯（70%乙醇 → 80%乙醇 → 90%乙醇 → 100%乙醇 → 二甲苯），确保每步样品完全浸没，每步3分钟。
         14. 使用封片剂将切片封固于盖玻片上，室温空气干燥过夜。
         15. 使用共聚焦显微镜配合40X/1.30油镜进行成像。
   2. 透射电子显微镜（用于观察锚定纤维）
      1. 将样品在2.5%戊二醛中固定72小时。
      2. 用1×PBS洗涤样品三次，每次10分钟。
      3. 将样品切成小块（1 mm³），在1%四氧化锇（pH 7.4）中室温后固定1小时，随后用蒸馏水洗涤。
         注意：四氧化锇具有剧毒，操作时应在通风橱中小心处理。
      4. 通过递增浓度的乙醇系列（25%乙醇 → 50%乙醇 → 75%乙醇 → 95%乙醇 → 100%乙醇 → 丙酮）进行脱水，每步20分钟。
      5. 用100%丙酮与Araldite树脂按1:1比例浸泡样品，室温30分钟；随后按1:3比例浸泡1小时，再按1:6比例浸泡过夜；接着用新鲜Araldite树脂在室温浸泡2小时，再更换新鲜树脂于40 °C浸泡1小时；第三次更换新鲜树脂于45 °C浸泡1小时，第四次更换新鲜树脂于50 °C浸泡1小时。
      6. 将样品在60 °C孵育24小时以完成聚合。
      7. 使用玻璃刀切片，获得厚度为1 µm的半薄切片，用亚甲蓝染色以观察组织学结构；再切得70 nm的超薄切片，将每片收集至铜网上。
      8. 先用5%醋酸铀溶液染色15分钟，再用3%柠檬酸铅溶液染色10分钟。
      9. 使用透射电子显微镜（100 kV）在30,000倍放大倍数下采集图像。

结果

大分子拥挤效应能够增强细胞外基质（ECM）的沉积，特别是与对照组培养物相比，成纤维细胞沉积了更多的I型胶原、IV型胶原和纤连蛋白（图1，细胞层；1A，I型胶原；1B，IV型胶原；1C，纤连蛋白）。在去细胞化后，明显可见与角质形成细胞相比，成纤维细胞是I型胶原、IV型胶原和纤连蛋白的主要沉积细胞（图1，基质）。

在 图2观察到成纤维细胞而非角质形成细胞是VII型胶原的主要产生细胞。这是首次成功沉积VII型胶原的报道 体外 （Benny 等, 2015).

通过使用特异性抗体进行免疫荧光染色来表征细胞...

讨论

通过向细胞培养体系中添加大分子拥挤剂，可利用排阻体积效应促进蛋白酶对前肽的切割，从而获得增强的细胞外基质。这使得细胞外基质（尤其是胶原蛋白）的加工速度加快，并更高效地沉积于培养表面。尽管其他研究团队也曾获得较厚的成纤维细胞层，但所需培养时间长达数周²⁰。相比之下，本实验方案中描述的MMC（大分子拥挤）技术显著缩短了培养时间，同时增加了细胞外基质的产量。在拥挤的细胞培养环境中反应速率的提升，也已在软骨细胞基质沉积²¹、细胞外基质组装^22,23以及脂肪生成过程²⁴中得到报道。

在去除致密细胞层的细胞成分后，收集细胞来源的基质并用于多种组织工程应用，其中之一是在细胞来源的基质上接种次级细胞培养物^25,26。由于这些基质是细胞来源的天然产物，若在非理想条件下长期保存，可能发生降解。在MMC条件下获得的细胞来源基质的一个显著优势在于其具有细胞来源性和细胞特异性。这可能成为商业涂层的一种潜在替代方案，后者通常价格昂贵且来源于动物。皮肤等效物必须小心处理，尤其是在固定之前。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
抗坏血酸	和光	013-12061	细胞培养基添加剂
细胞培养小室  （6孔板规格）	Greiner Bio-One	657610	器官型培养
柠檬酸盐溶液	Dako	S2369	DakoCytomation 抗原修复液 柠檬酸盐，pH 6 (10倍浓缩液)
胶原蛋白（大鼠尾部）	康宁	354236	器官型培养
CnT-57	CELLnTEC	CnT-57	细胞培养基
DAB底物+显色剂试剂盒	Dako	K3468	组织学
深孔板（6孔格式）	康宁	355467	器官型培养
ECL 检测试剂	GE Healthcare Life Sciences	RPN2106	Amersham ECL 蛋白质印迹检测试剂
透射电子显微镜（TEM）	JEOL	JEM-1010（100 kV）	透射电子显微镜技术
成纤维细胞培养基（FM）			高糖DMEM + 10% 胎牛血清 + 1% 青霉素-链霉素
Ficoll PM70	GE Healthcare Life Sciences	17-0310-05	大分子拥挤剂
Ficoll PM400	GE Healthcare Life Sciences	17-0300-05	大分子拥挤剂
无血清角质形成细胞培养基（KSFM）	Life Technologies	17005-042	细胞培养基
裂解缓冲液	赛默飞世尔科技	89900	用于蛋白质提取的裂解缓冲液。向该裂解缓冲液中添加了蛋白酶抑制剂（Roche，#11836170001）。
显微镜	Zeiss	LSM510	红色、绿色和蓝色通道分别用于显示 AF594、AF488 和 DAPI 荧光免疫染色（40倍放大）。
封片剂（Hydromount）	国家诊断公司	HS-106	荧光染色
封片剂（Cytoseal）	赛默飞世尔科技	8310-16	组织学（HRP）
OCT 包埋剂（Tissue Tek）	樱花	4583	冷冻切片包埋
青霉素-链霉素抗生素	Sigma Aldrich	A5955	细胞培养基添加剂
<强>一抗
抗胶原蛋白I抗体	Abcam	#ab6308
抗IV型胶原蛋白	Novocastra	#NCL-COLL-IV
抗胶原蛋白VII			LH7.2（实验室自制品）
抗纤连蛋白抗体	Abcam	#ab2413
还原剂	赛默飞世尔科技	NP0009	蛋白质印迹
上样缓冲液	赛默飞世尔科技	NP0008	蛋白质印迹法
<强>二抗（免疫染色）
4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐（DAPI）	Sigma Aldrich	#D9542
AlexaFluor 594 山羊抗兔	赛默飞世尔科技	#A-11037
AlexaFluor 594 山羊抗小鼠	赛默飞世尔科技	#A-11005
AlexaFluor 488 鸡抗兔	赛默飞世尔科技	#A-21441
AlexaFluor 488 山羊抗小鼠	赛默飞世尔科技	#A-11001
二抗（HRP）	Dako	Envision + 系统 - HRP 标记的聚合物抗兔和抗鼠	未稀释的
脱氧胆酸钠	化工与食品		脱细胞化
<强>分层介质
杜尔贝科改良伊格尔培养基			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
火腿’s F12			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
10% 胎牛血清			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
100 U/ml 青霉素和 100 U/ml 链霉素			用于类器官培养的气-液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
0.4 mg/ml 氢化可的松			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
5 mg/ml 胰岛素			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
1.8·10-4 M 腺嘌呤			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
5 mg/ml 转铁蛋白			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
2·10⁻¹¹ M 三碘甲状腺原氨酸			用于类器官培养的气液界面阶段。该培养基添加至细胞培养小室的外侧。
胰蛋白酶	生物园共享设施	0.125% 胰蛋白酶/Versene   pH 7.0 + 0.3	用于消化细胞