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使用病毒模拟物聚胞苷酸在妊娠中期诱导小鼠母体免疫激活

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DOI：

10.3791/53643

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2016年3月25日

 ,  , 
1Division of Biology and Biological Engineering, California Institute of Technology, 2Harvard Medical School

通讯作者： Wei-Li Wu <wlwu@caltech.edu>

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

母体免疫激活（MIA）是自闭症和精神分裂症环境风险因素的一种模型。本文旨在提供在妊娠小鼠中诱导MIA的逐步操作流程，以提高该模型的可重复性。

摘要

母体免疫激活（MIA）模型作为一种模拟多种精神疾病环境风险因素的啮齿类动物模型，日益受到重视。大量研究表明，MIA模型在自闭症和精神分裂症相关研究中具有良好的表型效度、构念效度和预测效度。为了建立MIA模型，研究人员通常使用病毒模拟物——聚胞苷酸：聚肌苷酸（poly(I:C)）来激活妊娠期啮齿类动物的免疫系统。一般而言，经免疫激活母体所产的子代会表现出与自闭症和精神分裂症相关的行为异常和生理改变。然而，不同剂量和不同时间点注射poly(I:C)可能在脑发育的不同阶段产生干扰，从而导致不同的结果。本文提供了一种在妊娠中期胚胎12.5天（E12.5）通过腹腔（i.p.）注射20 mg/kg poly(I:C)诱导MIA的详细方法。该方法已被证实可在母体-胎盘-胎儿轴线上引发急性炎症反应，最终导致与自闭症和精神分裂症相关的大脑功能紊乱及行为表型。

引言

母体免疫激活（MIA）的概念源于关于母体感染与自闭症及精神分裂症关联的流行病学研究1。由于在母体病毒感染后，胎盘或胎儿大脑中均未检测到可复制的病毒病原体2,3，因此推测感染对子代的影响是由母体免疫系统的激活所致，而非病原体本身直接引起。

为了阐明母体免疫激活（MIA）与精神疾病之间的因果关系，向妊娠期啮齿类动物体内注射化学合成的、模拟病毒的双链RNA——聚肌苷酸:聚胞苷酸（poly(I:C)）——已被广泛用作MIA的动物模型4,5。Poly(I:C)可被Toll样受体3（TLR3）识别，其全身给药可诱导类似病毒感染的急性炎症反应。Poly(I:C)导致子代出现行为异常和神经病理改变的机制之一，是引起母体-胎盘-胎儿轴中促炎与抗炎细胞因子的失衡6。多个研究团队已采用MIA模型来探究精神疾病的病因7，由于不同研究团队的关注点各异，已使用多种不同的免疫激活时间点，以实现对大脑发育和行为产生不同的干扰效应7。

加州理工学院 Paul H. Patterson 实验室采用在胚胎发育第12.5天（E12.5）向怀孕小鼠注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）的策略，已成功证明母体免疫激活（MIA）可诱导子代出现与自闭症和精神分裂症相关的行为、神经及免疫学改变8-11。我们先前的研究表明，MIA子代表现出行为异常（例如， 社交障碍、沟通缺陷、重复行为、类焦虑行为以及潜伏抑制缺陷8,10,12）、免疫失调和细胞因子失衡8,13,14、胎儿脑基因表达改变15、小脑第VII叶小脑浦肯野细胞丢失11、海马突触特性改变9、基因与环境相互作用13、肠道通透性改变以及肠道微生物组成变化16。此外，该模型系统还被用于开发治疗性和预防性策略13,16,17。在E12.5诱导MIA后，其他研究也发现MIA可导致胎儿小胶质细胞活化以及基底前脑胆碱能系统的发育改变18、品系特异性相互作用19、大脑突触体超微结构异常、脑线粒体呼吸链功能亢进异常、脑突触体分子下调17、类抑郁行为、认知功能受损和海马长时程增强（LTP）障碍，以及成年海马神经发生缺陷20。

本文详细介绍了如何在E12.5时期通过聚肌胞苷酸（poly(I:C)）诱导母体免疫激活（MIA），以及如何应用该模型研究自闭症和精神分裂症病因的实验范式。需要注意的是，MIA是多种疾病的风险因素4，其结果对诱导的时间、方法以及妊娠母鼠的饲养管理极为敏感。因此，不同实验室之间即使存在微小的差异，也常常导致子代结果的可重复性低和/或表型不同。本方法专为致力于研究MIA作为自闭症和精神分裂症环境风险因素的科研人员设计，所提供的详细操作描述将有助于提高研究数据的可重复性。

方案

所有实验方案均经加州理工学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准后实施。

1. 准备定时交配对

  1. 行为学实验至少使用6只母鼠，基因表达分析使用3只。
    注意：应使用估计数量两倍的雌性小鼠，因为定时交配后仅有约50%的小鼠会形成阴栓。
  2. 使用无既往妊娠史、年龄在8至16周之间的雌性小鼠。
    注意：曾与雄性小鼠发生过性接触但未妊娠的雌性小鼠也可接受。
  3. 将雌性小鼠共同饲养，并将笼子并排放置，以同步其动情周期。使用高度超过5.5英寸、内部底面积为75平方英寸的标准小鼠笼，可容纳5只成年小鼠。使用耳标法对每只雌性小鼠进行标记。

2. 设置定时交配对

  1. 在黑暗周期开始前0-2小时设置定时交配。每笼放入两只雌性小鼠。取出小鼠并分别称重。记录每只雌性小鼠的体重。
  2. 将一只雄性小鼠放入每笼与两只雌性小鼠共同饲养。采用三只交配法以尽量减少父系混杂效应。

3. 阴道栓检查（E0.5）

  1. 在暗周期结束后的0-4小时内检查雌性小鼠。轻轻抓住雌性小鼠尾部基部，使其能够抓住金属网格、笼盖或笼子边缘。
  2. 寻找阴道栓存在的迹象：阴道栓表现为阴道开口处可见的白色团块。若栓塞不明显，可将200 µl移液器吸头轻轻插入阴道开口。若感到凝结物阻力，则确认阴道栓已形成。每天检查一次阴道栓。
    注意：阴道栓仅表明已发生交配行为，因此不能保证一定怀孕。在某些品系的小鼠中，阴道栓可能较难识别。建议向有经验的小鼠饲养人员寻求帮助，以提高识别准确性。
  3. 将发现阴道栓的小鼠转移至新笼，并可进行合笼饲养。将发现阴道栓的当天定为胚胎发育0.5天（E0.5）。

4. 在 E10.5-11.5 天检查妊娠情况

  1. 轻轻提起小鼠尾部基部，让小鼠抓住金属网格、笼盖或笼边。观察腹部区域，检查是否有妊娠迹象，例如，腹部隆起（图1）。
    注意：在E11.5时，妊娠迹象通常比E10.5时更明显。
  2. 称量小鼠体重以确认妊娠。与未妊娠小鼠相比，妊娠小鼠在E10.5时通常体重增加约20%，在E12.5时体重增加约30%（图2）。将妊娠小鼠单独饲养于清洁的笼具中。

5. 20 mg/kg 聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）的配制

  1. 行为学实验每组至少使用6只母鼠，基因表达分析每组使用3只。准备相应剂量的聚肌胞苷酸（poly(I:C)）溶液。
  2. 称取聚肌胞苷酸（poly(I:C)）粉末至50 ml锥形管中，配制成终浓度为40 mg/ml的溶液。为尽量减少并标准化注射体积带来的应激，按每克小鼠体重注射5 µl poly(I:C)溶液（5 µl/g，即5 ml/kg）进行注射。为诱导母体免疫激活（MIA），我们给予每公斤体重20 mg的poly(I:C)。
    注意：所需poly(I:C)溶液的浓度为(20 mg/kg)/(5 ml/kg) = 4 mg/ml。由于poly(I:C)粉末中含有10%的poly(I:C)，因此需配制终浓度为(4 mg/ml)/0.1 = 40 mg/ml的poly(I:C)溶液。
    注意：poly(I:C)粉末非常轻，从药匙转移至锥形管时需小心，避免损失。
  3. 向锥形管中加入相应体积的0.9%氯化钠溶液（生理盐水），盖紧管盖。通过轻轻滚动盐水液滴使poly(I:C)粉末充分溶解，直至溶液澄清。在800 × g条件下离心1分钟（图3C）。使用0.22 µm滤器过滤poly(I:C)溶液。 将poly(I:C)溶液转移至1.5或2 ml微量离心管中。可选步骤：使用分光光度计测定poly(I:C)溶液的260/280比值，确保其在1.54–1.82之间（图3），具体参考生产商说明。 注意：用于溶解poly(I:C)粉末及作为对照注射用的生理盐水应为无菌、药用级产品。

6. E12.5 时期的生理盐水或聚(I:C)注射

  1. 将小鼠放在天平上称重，然后放回笼中。根据以下公式计算生理盐水组和聚肌胞苷酸（poly(I:C)）组小鼠的注射体积：体重（g）乘以 5 = 所需注射体积（µl）。使用 0.3 ml 胰岛素注射器抽取计算好的生理盐水或 20 mg/kg poly(I:C) 溶液，例如， 一只 30 g 小鼠需注射 150 µl。
  2. 轻轻抓住小鼠尾根部，将其放置在笼盖上。操作时动作轻柔，以避免应激引起干扰效应。将针头斜面向上，与小鼠体表呈约 20° 角，插入其两前乳头中央位置（图 4），并注射生理盐水或 poly(I:C) 溶液。 注意：每次注射后应为每只小鼠更换新的针头。 
  3. 将小鼠放回其原居住笼中，并将笼子置于安静、人员走动较少的房间，以避免其他干扰因素的影响。

7. 聚肌胞苷酸注射后的第二天（E13.5）

  1. 于次日早晨检查注射后的小鼠，使用天平测量其体重。
    注意：与注射生理盐水的小鼠相比，注射聚肌胞苷酸（Poly(I:C)）的妊娠小鼠通常在注射后第一天体重增加较少。
  2. 在子代出生前不要打扰小鼠。

8. MIA 后代的评估

  1. 为尽量减少MIA诱导带来的混杂效应，请遵循以下指南评估MIA后代的使用。
    1. 排除早产或延迟分娩的窝仔，或窝仔数量少于5只的窝仔。
    2. 若窝仔数量超过10只，应使用CO2对多余仔鼠实施安乐死。

9. 可选：检测 MIA 后的急性炎症反应

  1. 在给予生理盐水或聚肌胞苷酸（poly(I:C)）注射3小时后，按照本机构动物护理委员会批准的方案中所述方法处死妊娠小鼠。
    注意：颈椎脱位法通常更受青睐，因其可最大程度减少 CO 对实验结果的影响2安乐死药物对母体和胚胎的影响
  2. 从成年妊娠小鼠中取出脾脏，并在体视显微镜下分离胎盘和胎鼠脑组织。
    1. 对于脾脏采集，将小鼠置于解剖板上，并在孕鼠腹部区域喷洒70%乙醇。使用无菌剪刀在肋骨下方腹部区域的中央沿垂直方向穿过皮肤剪开。
    2. 脾脏位于左上腹象限。使用镊子分离脾脏。用精细擦拭纸轻轻滚动脾脏，以去除器官周围的脂肪组织。取约50 mg脾组织，分别放入含有500 µl RNA稳定液或TRIzol的Eppendorf管中，防止核酸降解。将样品储存于-80 °C冰箱中，直至使用。
    3. 收集胎盘时，轻轻将子宫角从体内拉出，放入盛有经高压灭菌的磷酸盐缓冲液（PBS）的培养皿中，并将培养皿置于冰上。用两把镊子撕开子宫壁，暴露羊膜囊。
      1. 使用镊子小心打开羊膜囊，避免损伤胎盘和胎儿。将胎盘与胎儿分离，并尽可能靠近胎盘处剪断脐带。清除胎盘上的羊膜囊残留物。将胎盘分别放入含有500 µl RNA稳定液或TRIzol的Eppendorf管中。样本置于-80 °C冰箱中保存，直至使用。
    4. 用于胎儿脑组织采集时，将胎儿保存在9.2.2步骤中的RNA稳定缓冲液中直至进行解剖。在体视显微镜下，使用精细#5镊子从脑室处轻轻剥离软脑膜。仔细清除胎儿脑组织上的所有膜结构。将胎儿脑组织分别放入含有500 µl RNA稳定缓冲液或TRIzol的Eppendorf管中。样本置于-80 °C冰箱中保存，直至使用。
  3. 从组织中提取RNA，并将RNA反转录为cDNA。分析 Il6 通过实时PCR检测cDNA中的基因表达。
  4. 按照TRIzol试剂盒说明书操作，从组织中提取RNA。若组织保存于RNA稳定化缓冲液中，先将样本解冻并离心去除缓冲液。用移液枪头将组织转移至另一含有500 µl TRIzol的离心管中，继续进行RNA提取。
  5. 使用分光光度计测定RNA的浓度、260/280和260/230比值，确保比值均高于2.0。
  6. 用DNase I处理RNA以消除DNA污染。将1 µg RNA、1 µl 10X反应缓冲液、1 µl无RNase的DNase以及无核酸酶水混合，总体积为10 µl。将混合液在37 °C孵育30分钟。加入1 µl DNase终止液以终止反应。将混合物在65 °C孵育10分钟。
  7. 将RNA逆转录为cDNA。使用20 µl反应体系，每反应最多加入1 µg总RNA。在每个反应中混合4 µl 5x逆转录（RT）反应缓冲液、1 µl逆转录酶、DNase I处理后的11 µl RNA模板以及4 µl无核酸酶的H₂O。2O，使终体积为20 µl。设置逆转录热循环仪程序，通用条件如下：第一步：25 °C 反应5 min；第二步：42 °C 反应30 min；第三步：85 °C 反应5 min；第四步：4 °C 保存。将cDNA稀释5倍。短期保存可置于4 °C，长期保存需于-20 °C 冻存。
  8. 分析 Il6 通过实时PCR检测cDNA中的基因表达，并进行归一化处理 Il6 基因表达到 β-actin 基因表达
    1. 配制主混合液 Il6 和 β-actin 检测。使用25 µl反应体系，每个基因的混合液包括12.5 µl SYBR Green Mix、0.5 µl 10 µM正向引物、0.5 µl 10 µM反向引物和6.5 µl无核酸酶水2O.
    2. 将5 µl 5倍稀释的cDNA加入光学96孔反应板的孔底。每孔加入20 µl预混液，使最终PCR反应体系为25 µl。每个样本的每个基因设三个复孔。使用光学粘性封膜密封反应板，在4 °C、800 × g条件下离心3分钟。采用实时荧光定量PCR标准程序：第一步：50 °C孵育2分钟；第二步：95 °C预变性10分钟；第三步：95 °C变性15秒、60 °C退火延伸1分钟，共40个循环。增加熔解曲线分析步骤。

10. 检测MIA成年子代的行为异常（可选）：

  1. 在8至12周龄时进行行为学测试。测试前至少3天更换笼具垫料。测试前至少将小鼠在行为测试室中适应30分钟。
  2. 进行前脉冲抑制（PPI）测试时，将小鼠置于亚克力圆柱形装置中，装置底部装有压电传感器。让小鼠在PPI测试舱内适应5分钟。给予小鼠6次120 dB白噪声刺激（惊跳反应）。
  3. 随后，随机给予小鼠以下刺激组合：14次背景噪声、14次惊跳刺激（Startle）、14次前脉冲5 dB（比背景噪声高5 dB）加惊跳刺激（PPI5），以及14次前脉冲15 dB（比背景噪声高15 dB）加惊跳刺激（PPI15）。
  4. 计算前6次120 dB刺激的惊跳反应平均值。分别计算其他各组刺激的惊跳反应平均值。通过公式（Startle - PPI5 或 PPI15）/ Startle 将数值转换为前脉冲抑制率。
  5. 进行旷场实验时，将小鼠放置于方形开阔场地（50 x 50 x 50 cm3）的角落。通过顶部安装的摄像机记录小鼠10分钟内的运动轨迹。将场地中心区域定义为中央区（17 x 17 cm2）。通过手动或基于图像的自动分析软件，量化小鼠的总移动距离、进入中央区的次数以及在中央区停留的时间。
  6. 进行弹珠埋藏实验时，先将小鼠放入测试笼中，笼内铺有5 cm厚的压缩干净白杨木屑，适应10分钟。随后将小鼠放回其饲养笼。轻轻将20颗深蓝色直径1.5 cm的玻璃弹珠以4×5阵列方式放置于垫料表面。再将小鼠放回含有弹珠的测试笼中，持续10分钟。记录在10分钟测试期间被埋藏的弹珠数量。

11. 检查MIA成年子代的小脑神经病理学（可选）：

  1. 通过麻醉处死生理盐水组和MIA成年子代小鼠。经心血管系统用50 ml PBS灌注小鼠，随后用50 ml 4%多聚甲醛灌注。
  2. 小心取出脑组织，并在4%多聚甲醛中4 °C条件下后固定过夜。用PBS冲洗脑组织三次，然后将脑组织置于含0.02%叠氮化钠的PBS中，4 °C冰箱保存备用。
    注意：后固定的脑组织可在含0.02%叠氮化钠的PBS中4 °C冰箱内保存长达一个月。
  3. 使用振动切片机将脑组织切成50 µm厚的矢状切片。用软毛刷笔收集脑切片。在室温下用0.6%过氧化氢孵育30分钟，以终止内源性过氧化物酶活性。
  4. 将切片在封闭缓冲液（含10%山羊血清、0.1% Triton X-100和0.02%叠氮化钠的PBS）中稀释的一抗抗钙结合蛋白（calbindin）抗体中室温孵育过夜。随后将切片在封闭缓冲液中稀释的相应生物素化二抗中室温孵育2小时。
  5. 将切片在亲和素DH-生物素化辣根过氧化物酶复合物缓冲液中孵育1小时（室温），以检测生物素信号。使用过氧化物酶底物显色以显示抗原。各步骤之间用PBS洗涤切片三次。将切片贴附于显微镜载玻片上，在显微镜下成像。

结果

在E12.5时注射20 mg/kg聚肌胞苷酸（poly(I:C)）可诱发母体-胎盘-胎儿轴的急性炎症反应，并引发对脑发育和行为表型的慢性影响12,13. 促炎性细胞因子白细胞介素（IL）-6水平升高是MIA后急性炎症反应的可靠指标。其峰值时间 Il6 胎盘和胎儿大脑中的基因表达在注射聚肌胞苷酸（poly(I:C)）后3小时进行检测12,13我们已证明，poly(I:C) 可诱导出更高的 Il6 母体脾脏-胎盘-胎儿大脑间的基因表达图5）（数据改编自 Wu 等, 2015)13研究人员可将此范式与其他治疗方法相结合，以研究可能改变MIA后急性炎症反应的因素， 例如， 母体饮食、遗传突变小鼠、抗炎药物 等等.

另一方面，行为学改变也是母体免疫激活（MIA）模型的重要特征。可通过多种行为学测试对MIA成年子代进行检测，以展现其自闭症样和精神分裂症样行为。通常情况下，与生理盐水对照组子代相比，MIA子代表现出在旷场实验中进入中心区域的次数更少、在中心区域停留的时间更短；在弹珠埋藏实验中埋藏行为更频繁，且前脉冲抑制（PPI）水平更低（图6）（数据改编自Wu et al., 2015）13。小脑第VII叶浦肯野细胞的丢失是MIA子代的另一显著特征（Shi et al., 2009）。使用钙结合蛋白（calbindin）抗体染色后可见，与生理盐水对照组子代相比，MIA子代小脑第VII叶中calbindin阳性浦肯野细胞数量减少（图7）。

小鼠妊娠形态学比较、实验装置、生殖生物学研究。
图1. 孕鼠的体征。 妊娠中期的小鼠可通过腹部区域的隆起（箭头所示）进行识别。本示例中使用的是近交系C57BL/6小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

体重变化图；妊娠组与非妊娠组，胚胎期 E0.5–E12.5 分析
图2. C57BL/6N孕鼠从胚胎期（E）0.5天至12.5天的体重变化。 在比较妊娠与非妊娠小鼠（在E0.5时存在阴道栓）时， (A) 体重和 (B)体重百分比在妊娠小鼠的E10.5时期显著增加。妊娠组 n = 10，非妊娠组 n = 5。数据以均值 ± 标准误表示。 *** p <0.001, **** p <0.0001. 请点击此处以查看此图的放大版本。

RNA吸收光谱、图表、紫外-可见光谱、波长与吸光度、核酸分析。
图3. 聚(I:C)溶液的吸光度测定。确保260/280比值在1.54–1.82之间。请点击此处查看该图的放大版本。

实验室技术，显示小鼠皮下注射；动物实验；戴手套的手操作。
图 4. 胚胎期（E）12.5 天注射 Poly(I:C)。 轻轻抓起怀孕小鼠的颈背部皮肤。注射部位位于上部乳头的中点处。将针头斜面向上，以相对于小鼠体表约 20° 的角度刺入。本示例中使用近交系 C57BL/6 小鼠。请点击此处查看该图的放大版本。

Il6 表达量柱状图；母体脾脏-胎盘-胎儿大脑轴；生理盐水组 vs Poly(I:C)组。
图 5. Poly(I:C) 注射可增加母体脾脏-胎盘-胎儿大脑轴中 Il6 基因的表达水平。数据以均值 ± 标准误表示。* p <0.05，** p <0.01（数据原始来源为 Wu et al., 2015，并为本文进行了修改13）。请点击此处查看该图的放大版本。

行为学分析图表；生理盐水组与MIA小鼠；旷场实验、弹珠埋藏实验、PPI；统计结果。
图6. MIA成年子代表现出与自闭症和精神分裂症内表型相关的行为异常。 在旷场实验中，MIA子代（A）进入中心区域的频率较低，且（B）在中心区域停留的时间较短。（C）在弹珠埋藏实验中，MIA子代埋藏的弹珠数量多于生理盐水对照组子代。MIA子代在（D）预脉冲5 dB和（E）预脉冲15 dB条件下均表现出 Prepulse Inhibition（PPI）缺陷。数据以均值±标准误表示。 * p <0.05，** p <0.01 （数据原始来源为Wu et al., 2015，并为本文进行了修改13）。请点击此处查看该图的放大版本。

脑组织切片示意图，比较生理盐水组与MIA组对颗粒细胞层和浦肯野细胞层的影响。
图7. MIA成年子代表现出与自闭症内表型相关的神经病理学异常。 在MIA成年子代中已观察到小脑第VII叶浦肯野细胞的丢失。箭头：Calbindin+浦肯野细胞。ML：分子层，GCL：颗粒细胞层，PCL：浦肯野细胞层。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

在不同时间窗口诱导母体免疫激活（MIA）会干扰啮齿类动物大脑发育的不同事件，从而导致子代出现不同的行为异常和神经病理学改变。本文描述了一种在胚胎发育第12.5天（E12.5）通过注射聚肌苷酸：聚胞苷酸［poly(I:C)］在小鼠中诱导MIA的实验方案。该MIA诱导方法可导致子代出现与自闭症和精神分裂症相关的行为、神经、免疫及胃肠道异常8,10,11,16。需要注意的是，由于MIA是一种环境风险因素，子代表型的变异程度预期会高于神经发育障碍遗传模型小鼠。因此，为了通过MIA稳定且可重复地产生与自闭症和精神分裂症相关的表型，尤其重要的是要尽量减少可能干扰实验结果的额外变量。

应严格遵循本方案中描述的时间线。正确的注射时间窗口可确保母体免疫激活（MIA）在子代大脑发育的特定阶段产生干扰。在小鼠中，E12.5 时期诱导 MIA 相当于人类妊娠第一孕期末期的干扰阶段21，此阶段发生显著的大脑发育过程，包括浦肯野细胞和尾状壳核的发育，以及皮质层的神经发生。未来还需进一步研究，以证实 MIA 小脑中浦肯野细胞丢失与早期脑发育干扰之间的关联。

尽管对母鼠进行一致的处理、检查甚至饲养管理可以最大限度地减少母体应激对子代表型的影响，但本方案仍存在一些研究人员应注意的局限性。例如，我们在给予聚肌胞苷酸（poly(I:C)）注射前一日直至妊娠结束期间，将母鼠单独饲养。我们的策略是让怀孕小鼠处于不受干扰的环境中。然而，这种操作可能在母体环境中诱发应激反应。尽管我们尚不清楚这种隔离引起的应激反应是否会影响子代的发育，但按照本实验流程仍可观察到母体免疫激活（MIA）效应。

此外，需要仔细选择并测试小鼠的品系和遗传背景，以用于MIA诱导。迄今为止，MIA效应主要在野生型C57BL/6N小鼠中得到重复验证8,10,13,16。其他研究也在BTBR小鼠品系中观察到了MIA效应19。已有研究表明，聚(I:C)在基因工程小鼠中可能引发不同的免疫反应13,22-24，这可能会对子代引入额外的混杂效应。

在生物学重复数量方面，行为学或生理学检测每组至少使用6窝，基因表达、蛋白质或免疫组织化学实验每组至少使用3窝。我们对每窝中的所有子代进行检测，而不是仅选用每窝中的一到两个子代，以避免实验偏差。此外，我们将每窝所有子代的数据取平均值，并将该平均值作为一个数据点（即n等于窝数），以避免统计方法不当13。由于在母体免疫激活（MIA）模型中未观察到明显的性别差异13，因此将每种性别的数据也进行合并分析。

通过产仔数对MIA后代进行评估的原理在于尽量减少母鼠哺乳和照料所导致的变异。已有研究表明，产仔数与C57BL/6小鼠的刻板行为相关25。我们推测，这可能是由于母鼠在哺乳和照料过程中对资源的分配所致。为避免这一混杂效应，我们设定C57BL/6小鼠的标准理想产仔数为6-10只。

即使严格遵循实验方案，在给予聚肌胞苷酸（poly(I:C)）注射后，实验人员仍可能在孕鼠中观察到过弱或过强的免疫反应。为避免这一问题，必须验证不同批次 poly(I:C) 的致热性和细胞因子诱导活性。同一公司生产的不同批次 poly(I:C) 可能在小鼠中引发不同程度的炎症反应；值得注意的是，注射来自不同批次但剂量相同的 poly(I:C)，可能导致血浆 IL-6 水平出现高达 10 倍的差异26。通过检测未孕雌鼠注射后 IL-6 的表达水平，来确定后续母体免疫激活（MIA）实验所用 poly(I:C) 的剂量和批次，有助于减少 MIA 诱导效应的变异性。

如果需要针对特定批次的聚肌苷酸:聚胞苷酸（poly(I:C)）调整剂量，则同样重要的是调整用于注射的poly(I:C)溶液浓度，以使每克小鼠体重的注射体积保持在约5 µl。例如，根据制造商的操作说明，poly(I:C)应以约10 mg/ml的水进行重悬，从而在生理磷酸盐缓冲液中形成多核苷酸溶液。与我们的40 mg/ml溶液相比，该较低浓度将使注射体积增加4倍。对于妊娠小鼠而言，较大体积的缓冲液注射可能会增加对胚胎的压力，并对子代引入不期望的混杂效应。因此，我们选择将poly(I:C)粉末溶解于0.09%氯化钠溶液中，并采用更高的终浓度，以减少注射体积。

选择IL-6作为急性炎症反应的标志物，是因为先前的研究已确定IL-6信号通路在介导母体免疫激活（MIA）对大脑发育和行为影响中的关键作用。在给予聚肌胞苷酸（poly(I:C)）处理后，IL-6是母体血液和胎盘中表达上调最显著的细胞因子10,12。尤为重要的是，Smith等人证明，在多个显著上调的细胞因子中，只有IL-6在诱导MIA相关的大脑和行为异常方面兼具必要性和充分性。也就是说，母体注射抗IL-6抗体可有效预防MIA子代的异常行为和转录组异常，而中和其他细胞因子则无此效果10。此外，仅对母体注射重组IL-6（无需poly(I:C)）即可重现MIA胎儿大脑及子代中观察到的转录和行为异常12,15。

与其他诱导母体免疫激活（MIA）的方法（例如，脂多糖（LPS）或流感病毒）相比，聚肌胞苷酸（poly(I:C)）相对安全，并且能够简便地控制免疫反应的强度。尽管母体给予 poly(I:C) 所引发的炎症反应是急性且短暂的，但其对子代行为和大脑发育的影响却十分深远。总体而言，一旦掌握了在胚胎发育第12.5天（E12.5）通过注射 poly(I:C) 诱导 MIA 的技术，即可进一步开展多种行为学和生物学检测，以评估这一环境风险因素对子代的影响。同时，也可将该方法与妊娠前、妊娠期间或妊娠后的基因修饰或其他处理手段相结合，以探究自闭症和精神分裂症的病因及潜在治疗策略。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们谨向已故的 Paul H. Patterson 博士致以敬意，以表彰他在线粒体功能障碍（MIA）模型、自闭症及精神分裂症研究领域所做出的重要贡献。我们感谢 Sarkis K. Mazmanian 对本实验方案的大力支持；感谢 Ruben M. Bayon、Yvette Garcia-Flores、Karen C. Lencioni 和 Leslie A. Neumann 提供的行政协助；感谢 Ali Khoshnan 和 Jan C. Ko 在拍摄过程中提供的帮助；感谢 Elaine Y. Hsiao 和 Natalia Malkova 在 MIA 诱导方面的建议；感谢 Jeffrey S. Cochrane、Joaquin Gutierrez、Kwan F. Lee、Jaime Rodriguez、Lorena C. Sandoval 和 Natalie A. Verduzco 在动物饲养管理方面的专业支持。本研究得到了以下资助：NIH Conte 中心奖（NIH 5P50MH086383-04，授予 Paul H. Patterson）；Autism Speaks 基金（#7670，授予 Paul H. Patterson）；Simons 基金会（#322839，授予 Sarkis K. Mazmanian）；NIH 培训基金（NIH/NRSA T32GM07616，授予 K.-H.C.）；加州理工学院暑期本科生研究奖学金（SURF，授予 Z.Y.）；加州理工学院 Amgen 学者项目（授予 Z.Y.）；以及中国台湾国家科学委员会博士后奖学金（NSC 101-2917-I-564-039，授予 W.-L.W.）。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚肌苷酸–聚胞苷酸钾盐SIGMAP9582
0.9% 氯化钠注射液 USPHOSPIRANDC 0409-4888-10
MONOJECT 胰岛素注射器 3/10 ml 29 G x 1/2"COVIDIEN8881600145
50 ml 锥形螺口管USA SCIENTIFIC1500-1211
Nanodrop 1000 分光光度计赛默飞世尔科技1000可选
体视显微镜Wild HeerbruggM5A可选
Dumont #5 镊子，不锈钢尖端，尺寸 0.10 × 0.06 mmRobozRS-5045可选
RNAlater RNA稳定试剂Qiagen76104可选
TRIzol试剂Life Technologies15596-026 可选
RQ1 无RN酶的DNasePromegaM610A可选
iScript cDNA合成试剂盒Bio-Rad170-8891可选
FastStart universal SYBR green master mix with ROX 罗氏4913922001可选
实时荧光定量PCRABI7300可选
引物：Il6 正向Life TechnologiesTAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC可选
引物：Il6 反向Life TechnologiesTTGGTCCTTAGCCACTCCTTC可选
引物：β-actin 正向Life TechnologiesAGAGGGAAATCGTGCGTGAC可选
引物：beta-actin 反向Life TechnologiesCAATAGTGATGACCTGGCCGT可选
MicroAmp 光学 96 孔反应板Life Technologies4306737可选
MicroAmp 光学粘性封膜 Life Technologies4311971可选
EthoVisionNoldusEthoVision可选
SR-LAB装置（PPI）圣迭戈仪器公司 SR-LAB可选
弹珠PENN-PLAX蓝色宝石弹珠可选
杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）Life Technologies21600-069可选
多聚甲醛MACRON2621-59可选
振动切片机LeicaVT1000 S可选
叠氮化钠SigmaS2002可选
Triton X-100SigmaX100可选
过氧化氢溶液Sigma18312可选
山羊血清Vector LaboratoriesS-1000可选
兔抗钙结合蛋白抗体Abcamab11426可选
生物素标记的山羊抗兔IgG抗体Vector LaboratoriesBA-1000可选
VECTASTAIN ABC 试剂盒Vector LaboratoriesPK-4000可选

参考文献

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使用病毒模拟物聚胞苷酸在妊娠中期诱导小鼠母体免疫激活
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