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方法文章

流型引导的高密度条形码抗体微阵列制备

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DOI：

10.3791/53644

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2016年1月6日

 , 
1Department of Chemistry, University at Albany, State University of New York, 2Multiplex Biotechnology Laboratory, Cancer Research Center

本文内容

摘要

本方案概述了大规模、多重二维DNA或抗体阵列的制备方法，该阵列在细胞信号传导研究和生物标志物检测中具有潜在应用价值。

摘要

抗体微阵列作为一种成熟的技术，目前正面临其他一些已建立或新兴的高通量技术的挑战。在本报告中，我们通过采用一种新颖的制造方法并引入新的功能，对抗体微阵列技术进行了革新。我们所构建的高密度抗体微阵列，是通过单链DNA的垂直定向流动图案化，并借助DNA-抗体偶联物介导的后续转化而实现的。本方案概述了流动图案化DNA、制备与纯化DNA-抗体偶联物，以及评估所制备微阵列质量的关键步骤。该方法在均匀性和灵敏度方面可与传统微阵列相媲美，且无需依赖微阵列打印机，可在大多数研究实验室中完成。另一主要优势在于，我们的微阵列单元尺寸比打印阵列小10倍，当与通用微芯片设计结合时，能够实现对单个细胞来源功能蛋白的分析。这种条形码技术可广泛应用于生物标志物检测、细胞信号转导研究、组织工程以及多种临床应用领域。

引言

抗体微阵列已广泛应用于蛋白质组学研究数十年，用于检测靶向蛋白质的存在，包括蛋白质生物标志物1-3。尽管该领域目前正面临质谱（MS）等其他高通量技术的巨大挑战，抗体微阵列仍具有广阔的应用空间，主要原因是这类设备具有简单的数据解读方式，并易于与其他检测方法联用。近年来，将微阵列集成到微芯片支架中，为抗体微阵列的发展带来了新的机遇4-7。例如，集成于单细胞微芯片中的条形码微阵列已被用于细胞间通讯研究8,9。该技术相较于其他现有微阵列技术具有显著优势：其阵列单元尺寸为10–100 μm，远小于传统微阵列常用的150 μm。更小的阵列单元通过系统化的流体图案化方法构建而成，从而形成紧凑型微阵列，能够检测单个细胞分泌的蛋白质及细胞内蛋白质。另一优势在于其简单且无需专用仪器的实验装置。这一点尤为重要，因为大多数实验室和小型公司可能无法获得微阵列核心设施。此类条形码抗体微阵列具有更高的检测通量，可用于单细胞水平的高度多重化检测，同时实现与传统夹心酶联免疫吸附测定（ELISA8）相当的高灵敏度和特异性。该技术已在检测胶质母细胞瘤9-11、T细胞12以及循环肿瘤细胞13的蛋白质方面得到广泛应用。此外，条形码DNA微阵列单独也被用于神经元和星形胶质细胞的精确定位，以模拟脑组织的in vivo组装结构14。

本方案仅聚焦于二维（2-D）条形码抗体微阵列的实验步骤与构建模块，该技术在流体样本及单细胞中生物标志物的检测方面具有潜在应用价值。该技术基于一种可寻址的单链一维（1-D）DNA微阵列，通过在玻璃基底上空间排布正交寡核苷酸构建而成。在流动图案化步骤中使用平行流道时，形成一维图案，该图案在视觉上呈现为离散的条带，类似于一维通用产品代码（UPC）条形码。构建二维（n × m）抗体阵列——类似于二维快速响应（QR）矩阵码——需要更复杂的图案化策略，但可实现更高密度的抗体固定8,15。制备过程需进行两次DNA图案化，第一次图案与第二次图案相互垂直，两组图案的交点即构成阵列的 n × m 个元素。通过策略性地选择用于流动图案化的单链DNA（ssDNA）序列，可为每个阵列中的各个元素分配特定的地址。这种空间定位对于区分微阵列玻片上的荧光信号至关重要。通过引入互补的DNA-抗体偶联物，将ssDNA阵列转化为抗体阵列，从而构建出一种称为DNA编码抗体文库（DEAL16）的平台。

本视频方案描述了构建 n x m 抗体芯片的关键步骤，包括制备聚二甲基硅氧烷（PDMS）条形码模具、在两个方向上进行ssDNA流式图案化、制备抗体-寡核苷酸DEAL偶联物，以及将 3 x 3 DNA芯片转化为 3 x 3 抗体芯片。

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方案

警告：本方案中使用的多种化学品具有刺激性，接触皮肤后可能造成危害。在进行本方案前，请查阅材料安全数据表（MSDS），并穿戴适当的个人防护装备。步骤 (1.1.1) 中使用的piranha溶液具有强腐蚀性，配制时应将过氧化物缓慢加入酸中，同时搅拌。操作该溶液时必须极其谨慎，应在通风橱中进行，并佩戴适当的眼部防护装备和耐酸手套。三甲基氯硅烷（Trimethylchlorosilane, TMCS）是一种具有腐蚀性且易燃的化学品，用于步骤 (1.1.6) 之后的可选步骤中。操作该化学品时应在通风橱中进行。

注意：条形码玻片的制备和关键的流体图案化操作应在洁净室中进行，以最大限度减少颗粒物污染。灰尘颗粒可能堵塞PDMS模具的端口和微通道，从而干扰流体图案化过程。

1. 一维DNA条形码芯片的构建

  1. 条形码流动图案SU-8母版的制备
    注意：垂直流动图案的图纸（图1A-B）使用计算机辅助设计（CAD）软件创建，并在铬版掩模上呈现。掩模的透明区域对应于SU-8母版的结构特征。
    1. 将一片硅片（直径100 mm）在3 H2SO4: 1 30% H2O2（piranha溶液）混合液中彻底清洗，并加热至96 °C。随后用去离子水和异丙醇冲洗硅片，并用氮气吹干。
    2. 在硅片上倒入约4 ml SU-8 2025光刻胶。使用可编程匀胶机，先以500 rpm转速匀胶10秒，再以3,000 rpm转速匀胶30秒，形成厚度约为25 µm的光刻胶层。停止旋转前应逐渐减速，以保持硅片表面涂层均匀。
    3. 将涂覆好的硅片置于热板上，65 °C烘烤1分钟，再于95 °C烘烤5分钟，使涂层固化。随后在室温下冷却5分钟。
    4. 将铬版掩模（图1C）放置在光刻胶涂层上，用近紫外光（350–400 nm，曝光能量150–160 mJ/cm2）照射20秒。
      注意：铬版掩模上的设计包含20条通道，每条宽20 µm，间距50 µm。通道从图案一端蜿蜒至另一端，整体覆盖一个长约40 mm、宽约20 mm的矩形区域。每条通道两侧各有一个圆形结构，分别对应一个进样口和出样口，进样口与出样口可互换使用。
    5. 将曝光后的硅片在热板上95 °C烘烤5分钟，然后逐渐冷却至室温。
    6. 将硅片浸入SU-8显影液中，震荡显影5分钟。用少量新鲜SU-8显影液冲洗硅片，再用异丙醇冲洗，随后用氮气吹干。在200 °C热板上进行硬烘30分钟，并让硅片逐渐冷却至室温。
      注意：若此步骤冲洗后观察到白色薄膜，可延长显影时间。
      可选：将SU-8母版置于密闭培养皿中，暴露于三甲基氯硅烷蒸气中10分钟，进行硅烷化处理。
  2. PDMS条形码模具的制备
    1. 将40.0 g硅弹性体基质与4.0 g固化剂混合，剧烈搅拌预聚物混合物10分钟，随后在真空下脱气20分钟。
      注意：通常采用10:1（基质:固化剂）的质量比。
    2. 将预聚物倒入含有带SU-8条形码母版的硅片的培养皿中，PDMS混合物的高度应约为7.5 mm或更高。将混合物在培养皿中再次脱气以去除残留气泡，随后在75 °C下烘烤1小时，使PDMS完全固化。
      注意：保持PDMS块厚度在约7.5 mm或以上非常重要，以避免在后续步骤（1.3.3.1）中插入针头/管路穿过PDMS模具时对PDMS-玻璃键合造成过大张力。
    3. 使用手术刀小心地沿PDMS块上含有条形码模具结构的区域切割，并将PDMS块从硅片上剥离。
    4. 修剪PDMS块边缘，使其达到所需的PDMS条形码模具形状。使用带推杆的活检打孔器在模具上打出20个孔（直径1.0 mm），确保孔与条形码图案的圆形结构对齐。这些孔作为进样口和出样口。
  3. 聚-L-赖氨酸（PLL）的一维图案化
    1. 使用氮气吹枪清除聚-L-赖氨酸包被的载玻片表面的任何灰尘。将PDMS模具贴附到洁净的载玻片上，确保模具边缘与载玻片边缘对齐。
    2. 在75 °C下烘烤1.5小时，以增强PDMS模具与PLL包被载玻片之间的键合强度。同时，准备20段柔性聚乙烯管（每段3至4英寸长，内径0.5 mm，外径1.5 mm）。
      注意：管段数量应与PDMS条形码模具的进样口数量一致。这些管路用于将PDMS条形码模具上的通道连接至配备压力调节器的氮气罐。
    3. 在每段管路的一端连接一根直径为1 mm的不锈钢空心针。通过针头吸入经无菌过滤的聚-L-赖氨酸溶液，使至少1 cm长的管路内充满溶液。
      1. 将连接有溶液填充管路的针头固定在PDMS条形码模具的进样口上（图1E）。将管路另一端连接至压力可调的氮气罐装置。使用0.5–1 psi的压力范围，使溶液在模具中流动至少6小时。
        注意：所有流动图案化操作请参考步骤（1.3.3）。
  4. 单链DNA（ssDNA）的一维图案化14
    注意：后续步骤中使用的磷酸盐缓冲盐水（PBS）由137 mM NaCl、10 mM Na2HPO4和2 mM KH2PO4配制而成，缓冲液pH为7.4。
    1. 在PBS中配制2 mM双（磺基琥珀酰亚胺基）辛二酸酯（BS3）溶液。在PBS或超纯水中分别配制300 µM的A、B和C单链DNA（5'-氨基修饰，80个核苷酸）溶液。
      注意：BS3溶液应在配制后约30分钟内使用，因为其N-羟基琥珀酰亚胺酯基团易发生水解。
    2. 为每个通道分别混合2.5 µl 300 µM的A、B或C ssDNA与2.5 µl 2 mM BS3 PBS溶液。A、B和C DNA分别指定用于通道1、2和3。此顺序同样适用于后续每组3个通道（图2A）。
    3. 执行步骤（1.3.3）。此次通过不锈钢针头将5 µl BS3/DNA溶液吸入聚乙烯管路中，然后将PDMS模具连接至氮气源。使BS3/DNA溶液在条形码模具中流动约40分钟 ，或直至所有通道完全充满。
    4. 所有通道充满后停止流动，在室温下将BS3/DNA溶液在条形码中孵育2小时，避免溶液干燥。将附有条形码载玻片的PDMS模具在75 °C下烘烤1小时。
      注意：为便于后续流动图案化步骤中的对齐，可在条形码载玻片上标记通道图案的边缘。可通过金刚石刻划笔小心刮划玻璃表面，在载玻片底部生成对齐标记。后续步骤中的对齐情况可在显微镜下检查。
    5. 将PDMS模具从条形码载玻片上取下，用0.01% SDS轻轻冲洗一次，再用超纯水冲洗三次。
      1. 使用载玻片离心干燥机干燥条形码载玻片。将条形码载玻片存放于洁净的50 ml离心管中，以备后续使用。

2. 条形码芯片上一维图案的验证

注意：本验证方案也可适用于评估后续流体图案化步骤的质量。

  1. 载玻片的封闭
    1. 在 PBS 中配制 1% 牛血清白蛋白（BSA）。使用前通过 0.45 µm 注射器滤器过滤该溶液。使用加样枪头，将 50 µl 的 1% BSA 溶液加至条形码载玻片的一端边缘。
    2. 在室温下孵育 1% BSA 溶液 1 小时。
  2. 与 Cy3 标记的互补 DNA 孵育
    1. 配制在末端标记有 Cy3 的 A'、B' 和 C' 寡核苷酸混合液。A'、B' 和 C' 的序列分别与 A、B 和 C 互补。Cy3-DNA 的工作浓度为 0.1% BSA 中 0.05 µM。
    2. 用移液器吸除载玻片上的 BSA 溶液，然后在同一边缘加入 30 µl DNA 混合溶液。将 Cy3-DNA 混合液在室温下孵育 1 小时。此孵育步骤需在避光条件下进行，以防止 Cy3 基团发生光漂白。
  3. 荧光强度分析
    1. 用移液器吸除 Cy3-DNA 混合液，随后用 1% BSA、PBS 以及稀释的 PBS（1 份 PBS 与 50 份超纯水混合）依次洗涤载玻片。使用旋转干燥仪将载玻片干燥。
    2. 使用荧光显微镜或微阵列扫描仪观察荧光信号（图 2B）。若使用微阵列扫描仪，激光发射波长设为 532 nm，像素大小设为 5 微米，光电倍增管（PMT）增益设为 450，功率设为 15%。

3. 二维（3×3）DNA 阵列的制备14

  1. PDMS 条形码模具的制备
    1. 执行步骤 (1.1) 构建另一块 SU-8 母模，但此次使用一块铬掩膜，其流道图案方向与第一次设计垂直。执行步骤 (1.2) 制备具有垂直图案的新 PDMS 模具。
  2. ssDNA 的二维流道图案化
    1. 对于 3 × 3 阵列，用 3% BSA/PBS 配制浓度为 150 µM 的 A'-i, B'-ii, C'-iii, A'-iv, B'-v, C'-vi, A'-vii, B'-viii 和 C'-ix DNA 储存液。这些寡核苷酸作为"桥接序列"（图 2A）。将寡核苷酸溶液（溶液 1 至 3）混合，使每种寡核苷酸的工作浓度为 50 µM。参照 表 1 提供的指南进行操作。
    2. 将 3% BSA/PBS 封闭液以 0.5–1 psi 的压力通入全部 20 个通道，持续 1 小时。
    3. 分别将溶液 1、2 和 3 通入通道 1、2 和 3，并按此顺序依次处理后续每组 3 个通道。通常整个流程约需 40 分钟完成。在室温下孵育 DNA 溶液 2 小时，使 DNA 发生杂交。
    4. 将 3% BSA/PBS 封闭液以 0.5–1 psi 的压力通入全部 20 个通道，持续 1 小时，以去除未杂交的 DNA。剥离 PDMS 片材，将所得 DNA 微阵列玻片浸入 3% BSA/PBS 一次，再浸入 PBS 两次，最后浸入稀释的 PBS（1 份 PBS 与 50 份超纯水混合）。使用玻片离心干燥机将玻片干燥。
    5. 进行第二次验证步骤（图 2C），方法与第 2 节类似。使用 Cy3 标记的寡核苷酸 i' 至 ix'。将 3 × 3 阵列玻片储存于 50 ml 离心管中，以备后续使用。
      注意：DNA 微阵列可在干燥器中室温保存数月。

4. 将 3 x 3 DNA 阵列转化为抗体阵列

  1. 抗体-寡核苷酸（DEAL）偶联物的制备
    1. 将琥珀酰亚胺-4-甲酰基苯甲酸酯（S-4FB）和琥珀酰亚胺-6-肼基烟酰胺（S-HyNic）分别溶于无水N,N-二甲基甲酰胺（DMF）中，配制成200 mM和40 mM的溶液。
    2. 在PBS中分别配制最多7种捕获抗体（1 mg/ml）的溶液。
      注意：如果抗体储备液中含有叠氮化钠防腐剂，请使用截留分子量为7 kDa的离心脱盐柱进行缓冲液置换，更换为PBS。
    3. 分别配制400 µM的i', ii', iii', iv', v', vi',和vii' DNA溶液。将每种捕获抗体与一种寡核苷酸序列配对。在微量离心管中，将40 µl的400 µM DNA与12.25 µl DMF混合，并短暂离心以充分混匀。
      1. 向每种DNA/DMF溶液中加入2.3 µl的200 mM S-4FB（溶于DMF）。每100 µg捕获抗体，加入2.25 µl的40 mM S-HyNic（溶于DMF）。
    4. 将抗体/S-HyNic和DNA/S-4FB溶液在室温下孵育4小时。
    5. 为进行抗体-DNA偶联反应，预先准备新的离心脱盐柱（每种DNA溶液和每种抗体各一柱），用pH 6的柠檬酸盐缓冲液洗涤。
    6. 孵育4小时后，对每种抗体/S-HyNic和DNA/S-4FB溶液进行缓冲液置换。将S-4FB偶联的i', ii', iii', iv', v', vi'和vii'寡核苷酸与抗体-S-HyNic偶联物混合，室温孵育2小时。
    7. 将反应体系在4 °C下过夜孵育。
  2. 抗体-寡核苷酸（DEAL）偶联物的纯化
    注意：为纯化抗体-寡核苷酸偶联物，使用配备Superose 6 10/300 GL柱的标准快速蛋白液相色谱（FPLC）系统进行分离。
    1. 将FPLC系统的紫外检测器波长设为280 nm，以磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）等度洗脱，流速为0.3 ml/min，以分离抗体-寡核苷酸偶联物与过量的S-4FB-DNA。
    2. 收集含偶联物的组分，并使用截留分子量为10 kDa的离心过滤器浓缩至150 µl。
  3. 抗体的二维图案化
    1. 采用步骤（1.2）中的制备方法，制备另一块带有微腔或微孔的PDMS模具。该PDMS模具可用于免疫分析，其微孔体积可为微升级至纳升级。
      注意：对于流体样本中一般生物标志物的检测，可将多孔PDMS模具与阵列载片结合使用。PDMS模具的结构特征取决于所研究的系统。例如，在单细胞实验中检测蛋白质时，可使用含有体积为0.15 nl 微腔的PDMS模具。
    2. （可选）将PDMS模具在等离子清洗仪中（18 W）处理1.5分钟，使其图案化表面变为亲水性。在等离子处理前，使用胶带遮蔽将直接与3 x 3阵列载片键合的所有其他表面。
      注意：步骤（4.3.2）为可选步骤，通常仅在PDMS模具用于单细胞实验时执行。
    3. 将PDMS模具与3 x 3阵列载片结合，然后用含1% BSA的PBS封闭载片，室温孵育1小时。同时，配制抗体-寡核苷酸偶联物混合液（终体积200 µl），每种偶联物的工作浓度为10 µg/ml（溶于含1% BSA的PBS中）。
    4. 加入抗体-寡核苷酸混合液，37 °C孵育1小时，使偶联物中的寡核苷酸部分与3 x 3阵列上的特定位点杂交，从而将DNA阵列转化为抗体阵列。
    5. 重复步骤（3.2.4）清洗并干燥载片。若立即使用抗体阵列，可获得最高灵敏度；长期储存可能导致灵敏度下降。
  4. 蛋白质检测
    1. 重悬重组蛋白或制备过滤后的细胞样本。
    2. 将微阵列与定制芯片结合，用含3% BSA的PBS封闭表面1小时。随后去除BSA溶液，加入样本并孵育2小时。
    3. 用含3% BSA的PBS洗涤样本三次，然后根据产品说明书推荐浓度加入检测抗体，孵育2小时。
    4. 用含3% BSA的PBS洗涤检测抗体三次，随后加入1 µg/ml的Cy5-链霉亲和素（Cyanine 5, Cy5-streptavidin），孵育1小时。
    5. 重复步骤（3.2.4）清洗并干燥载片，以备扫描。

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结果

PDMS模具的设计（图1A-1B）使用CAD软件（AutoCAD）绘制。所示的两种设计均包含用于流动图案化的通道，一个为水平方向，另一个为垂直方向。每种设计的左右部分呈对称结构；任一侧均可作为入口或出口。20条通道中的每一条均从一端蜿蜒延伸至另一端。每种设计均被打印在铬版光掩模上（图1C）。图中显示了在晶圆上制备的SU-8模具母版（图1D）。为了实现PLL或DNA的流动图案化，将PDMS模具连接至氮气气流装置（图1E）。

本方案中使用了三个流体图案化步骤。第一步是将聚-L-赖氨酸（PLL）固定在玻璃基底上，随后的两个步骤均用于引入寡核苷酸溶液。在表1中列出了溶液1-3的寡核苷酸组成。每种寡核苷酸的工作浓度为50 µM，每种溶液的总体积为39 µl。这些溶液通过混合13 µl的每种寡核苷...

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讨论

流道图案设计是制备二维（2-D）微阵列的第一步关键步骤。为了在玻璃基底上生成两个相互重叠的DNA图案，第一次设计的通道特征应与第二次设计的通道特征相互垂直（图1A-B）。设计还需考虑微阵列的后续应用。在单细胞分析中，微阵列用于检测被封闭在微腔室中的单个细胞所表达的蛋白质，因此通道尺寸需与对齐于二维（2-D）阵列的微腔室相匹配。每个设计均被绘制于光掩模上，并采用标准光刻技术在硅片上的SU-8材料中加工出通道结构（图1C-D）。该结构作为聚二甲基硅氧烷（PDMS）复制的母模。母模制备完成后，将其键合至多聚赖氨酸（PLL）包被的载玻片上，并连接氮气气流装置（图1E）。我们所使用的装置结构简单，且易于整合到任何具备压力可控氮气源的实验室中。我们采用多个低成本的三通阀连接至氮气罐组成气路系统。图案化过程中，气流压力必须保持在较低水平（0.5–1 psi），以避免玻璃载片从模具上发生剥离。PDMS模具中的漏气会破坏图案的完整性。

本方案中的DNA流动图案化步...

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披露

作者无任何竞争利益需要披露。

致谢

作者感谢纽约州立大学奥尔巴尼分校的启动资金以及奥尔巴尼大学癌症研究中心设施的使用许可。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Sylgard 184 硅酮弹性体基础剂Dow Corning3097366-1004
Sylgard 184 硅酮弹性体固化剂Dow Corning3097358-1004
SU-8 2025 光刻胶MicroChemY111069
硅晶圆 University Wafers452
聚-L-赖氨酸包被玻片Thermo ScientificC40-5257-M20
寡核苷酸Integrated DNA Technologies*由 Integrated DNA Technologies 定制订购，详见 表 2。
聚-L-赖氨酸粘附储备液Newcomer Supply1339
双(磺基琥珀酰亚胺基)辛二酸酯  (BS3)Thermo Scientific21585
1× 磷酸盐缓冲液，pH 7.4Quality Biological114-058-101
Äkta Explorer 100 快速蛋白质液相色谱 (FPLC) 系统GE (Amersham Pharmacia) 18-1112-41
Superose 6 10/300 GL 柱GE Healthcare Life Sciences17-5172-01
捕获抗体多种多种*抗体选择取决于具体应用
琥珀酰亚胺基-6-肼基-烟酰胺 (S-HyNic)SolulinkS-1002
琥珀酰亚胺基-4-甲酰基苯甲酰胺 (S-4FB)SolulinkS-1004
N,N-二甲基甲酰胺Sigma-Aldrich227056
柠檬酸，无水Acros42356
氢氧化钠Fisher ScientificS318
Amicon Ultra 超滤离心管，10 kDa 截留分子量EMD MilliporeUFC201024
旋涂仪Laurell TechnologiesWS-650-MZ
带推杆的活检打孔器（1.0 mm 直径）Ted Pella, Inc.15110-10
金刚石刻划笔（Style 60）SPI supplies6004
三甲基氯硅烷Sigma Aldrich92361

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