建立化疗耐药型白血病模型 体外

摘要

本报告总结了一种可用于模拟骨髓微环境生态位对白血病细胞影响的实验方案，重点在于富集化疗抗性最强的亚群细胞。

摘要

众所周知，骨髓微环境为血液系统疾病提供了一个独特的庇护所，这些疾病在此部位发生并进展。本报告中介绍的模型利用人原代骨髓基质细胞和成骨细胞作为骨髓微环境中的两种代表性细胞类型，以研究其对肿瘤细胞表型的影响。 体外 上述人源白血病细胞与主要微环境组分共培养的条件，可支持产生一群具有化疗耐药性的肿瘤细胞亚群，该亚群可高效地从培养体系中回收，并用于多种技术手段的分析。通过严格的换液程序以避免营养波动，并利用凝胶型10号交联葡聚糖（G10）颗粒回收已迁移至贴壁的骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）下方的肿瘤细胞，从而获得“相位暗化”（PD）肿瘤细胞群体，此方法可稳定地提供纯化的治疗耐药性白血病细胞。这一具有临床相关性的肿瘤细胞群体可通过标准方法进行评估，用于研究凋亡、代谢及细胞周期调控通路，同时也为在临床前研究针对微小残留病灶开发新型治疗策略时，提供更为严格的靶标。

引言

该方法的总体目标是提供一种高效、经济 体外 一种支持研究化疗期间骨髓支持白血病细胞存活机制的方法。已有充分证据表明，治疗后仍存活的残留肿瘤细胞会导致疾病复发，且复发常比初诊时更具侵袭性，治疗效果也往往更差。^1-8仅包含白血病细胞的模型（例如仅将细胞在培养基中进行培养的模型）在测试治疗策略时未考虑这些关键信号，也未考虑疾病异质性，而这种异质性是由微环境信号的可获得性所引发的，其中与微环境细胞具有特定相互作用的肿瘤细胞亚群会获得更强的保护作用。标准的二维共培养模型将骨髓来源的基质细胞与白血病细胞共同培养，在一定程度上弥补了骨髓微环境的影响，研究表明，与骨髓微环境细胞相互作用可增强白血病细胞对化疗的耐药性，并改变其生长特性。^9-14然而，这些模型通常无法再现肿瘤细胞的长期存活情况，也不能准确反映与导致微小残留病（MRD）的最耐药白血病细胞群体相关的结局。 在体 模型在临床试验前对创新疗法的研究中仍然至关重要，并被视为“金标准”，但其常受限于验证耐药性肿瘤及疾病复发相关假设所需的时间和成本。因此，开发信息量更丰富的二维模型将有助于开展初步研究，从而为后续基于小鼠的临床前研究设计提供更可靠的指导。

二维 体外 本报告中呈现的模型缺乏真实情况的复杂性 体内 微环境，但提供了一种经济高效且可重复的方法，用于研究肿瘤细胞与微环境之间的相互作用，尤其适用于富集具有化疗耐药性的肿瘤细胞亚群。这一特性具有重要价值，因为对全部肿瘤细胞群体的评估可能会掩盖那些虽占少数却构成最重要靶标的治疗耐药细胞的表型。该模型的另一优势在于其可扩展性，可根据具体分析需求进行调整。对于需要大量回收肿瘤细胞的分析，可建立大规模培养体系；而对于基于PCR或显微镜观察的评估，则可采用多孔板中的小规模共培养体系。

基于这一需求，我们开发了一种 体外 用于研究B系急性淋巴细胞白血病（ALL）特征性异质性疾病的模型。我们证明，ALL细胞与其正常对应细胞具有许多共同特征，可在骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）共培养体系的不同区室中定植。共培养可产生三种具有不同表型的肿瘤细胞亚群，适用于治疗反应的研究。具体而言，我们发现从共培养的“相位暗区”（PD）群体中回收的ALL细胞对治疗 consistently 呈耐药状态，其存活率接近未接触细胞毒性药物的肿瘤细胞。这些ALL细胞无论来源于已建立的细胞系或原代患者样本，均可迁移至贴壁的基质细胞或成骨细胞层下方，但可通过消化培养物后利用凝胶型10号交联葡聚糖（G10）颗粒柱分离不同细胞类型而被捕获。¹⁵.

本文介绍了一种可用于模拟骨髓微环境基质细胞（BMSC/OB）与白血病细胞之间相互作用的二维共培养体系。尤为重要的是，我们观察到白血病细胞相对于基质细胞单层会形成三种空间亚群，其中贴近基质层（PD）的细胞群体由于与BMSC或成骨细胞（OB）相互作用而表现出化疗耐药性。此外，我们展示了如何利用G10柱有效分离这些白血病细胞亚群。值得注意的是，分离这些亚群后，可对最具耐药性的PD细胞群体进行下游分析，以确定其因与骨髓微环境基质细胞或成骨细胞相互作用而获得的潜在耐药机制。在此共培养与分离模型基础上，我们已采用的下游技术包括流式细胞术分析、蛋白质组学分析、靶向蛋白表达检测，以及近期发展的激光烧蚀电喷雾电离（LAESI）和Seahorse代谢分析，用于评估细胞的代谢特征。结合本模型与上述技术，我们发现：与单独在培养基中培养的白血病细胞或共培养体系中其他亚群分离的细胞相比，PD亚群具有独特的化疗耐药表型。因此，该模型适用于更深入的研究，以评估靶向治疗那些通过与骨髓微环境相互作用而获得耐药表型的最耐药白血病细胞的策略。

方案

1. 高级准备

1. 制备葡聚糖G10颗粒。
   1. 通过向10 g G10颗粒中加入50 ml 1× PBS来制备G10悬液。轻轻颠倒混匀，并于4 °C过夜静置，使G10颗粒从磷酸盐缓冲液（PBS）中充分沉降。
   2. 进行G10柱分离当天，吸除沉降后的G10颗粒上层PBS，加入50 ml新鲜PBS，颠倒混匀。重复此洗涤步骤两次，每次均向沉降的G10颗粒中加入50 ml新鲜PBS，最后将G10颗粒储存于4 °C，待用。
2. 培养骨髓间充质干细胞（BMSC）和成骨细胞（OB）。
   1. 将BMSC或OB细胞在37 °C、6% CO₂条件下培养，接种于10 cm组织培养皿中，直至细胞融合度达到90%。
   2. 用胰酶消化BMSC或OB细胞，按1:2比例传代至新的10 cm培养皿中。按此标准持续培养细胞，直至用于白血病细胞共培养实验。

2. 建立并维持共培养体系

1. 加入 5-20 x 10⁶ 将白血病细胞以10 ml肿瘤特异性培养基接种至80%-90%融合度的BMSC或OB培养板中。
   注意： 我们的实验室在37 °C、5% O₂条件下维持共培养体系₂ 更好地模拟已被证实范围为1%至7%的骨髓微环境^16-18 然而，在该氧张力下维持共培养体系对于三种白血病亚群的建立并非关键，可由实验室自行决定。
2. 每4^th 第几天时，除去培养基（包括悬浮的白血病细胞）至仅剩1 ml，然后加入9 ml新鲜的白血病细胞培养基。从培养板中移除9 ml培养基时，注意不要扰动骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）的贴壁层。
   1. 倾斜培养板一侧以去除培养基，并从培养板角落处吸除培养基。此外，添加新鲜培养基时，务必沿培养板侧壁的角落逐滴加入，以尽量减少对贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层的干扰。
3. 12 小时后^th 共培养当天，用移液管将培养基在培养皿表面轻轻反复吹打5至10次，冲洗白血病细胞使其脱离骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）层，收集于15 ml锥形管中。按照步骤2.1所述方法，重新接种至新的、融合度达80%–90%的BMSC或OB培养板中。
   注意： 按照步骤2.3所述轻柔冲洗共培养体系，可去除S和PB来源的白血病细胞，同时不破坏骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）单层结构。此操作仅使肿瘤细胞转移至下一共培养板。该12天周期可根据用户需求重复多次。

3. 准备 G10 葡聚糖凝胶柱

注意：如果在 G10 柱分离后需要进行无菌的下游分析或培养，则应使用无菌技术操作，且 G10 柱应在无菌生物安全柜中设置。

1. 将细胞培养基在水浴中预热至 37°C（每列约 30 ml）。使用 10 ml 一次性注射器，取出并丢弃活塞。向注射器中加入玻璃棉。
2. 使用镊子将玻璃棉撕成细而松散的丝状。将多层疏松填充的玻璃棉加入注射器中，直至注射器体积的 2/3 被玻璃棉填满。
   注意：玻璃棉对于防止松散的 G10 颗粒污染白血病细胞收集物至关重要。确保玻璃棉填充程度足以支撑 G10 颗粒，但又不能过于紧密而阻碍培养基流经柱体。
3. 将单向旋塞连接到注射器尖端，并处于关闭位置。
4. 将注射器柱体夹在铁架台上，高度应足以使 50 ml 锥形管（收集管）可置于旋塞下方。将收集管放置在注射器柱体下方。
5. 使用 10 ml 移液器，将悬浮于 PBS 中的 G10 颗粒逐滴加入柱体，位于玻璃棉上方。持续加入 G10 颗粒，直至在玻璃棉上方形成约 2 ml 的颗粒沉淀（根据注射器上的刻度测量）。
6. 用预热的培养基平衡 G10 柱体。
   1. 向柱体中加入 2 ml 预热的培养基。缓慢打开旋塞阀门，使培养基以逐滴方式流出柱体。
   2. 重复步骤 3.6.1，直至总共 10 ml 预热的培养基流经柱体。
      注意：若在收集管的流出液中观察到 G10 颗粒，则应：1）添加更多 G10 颗粒以维持约 2 ml 的沉淀，确保无额外 G10 颗粒从柱体逸出；或 2）更换为未使用的柱体，并重复步骤 3.4–3.6.1。
   3. 当预热的培养基从柱体排尽后，关闭旋塞，并丢弃含有流出液的收集管。在柱体下方更换新的收集管。柱体现已准备好加载培养基与细胞混合物。
      注意：柱体应立即使用，不得使其干燥。

4. 共培养中三个亚群的分离

1. 悬浮（S）肿瘤亚群的收集。
   1. 用移液器吸出共培养板中的培养基，并轻轻将同一培养基重新加入板中以冲洗，收集含有白血病细胞的培养基至15 ml锥形管中。所收集的白血病细胞即为S亚群。
2. 亮相（PB）肿瘤亚群的收集。
   1. 将10 ml新鲜培养基重新加入共培养板中。通过移液器反复吹打约5次，充分冲洗以去除贴壁的白血病细胞，但力度不宜过大，以免脱离贴壁的骨髓基质细胞/成骨细胞（BMSC/OB）组分。
   2. 用移液器吸出液体，并将培养基收集至15 ml锥形管中。所收集的细胞即为PB亚群。
3. 暗相（PD）肿瘤亚群的收集。
   1. 用1 ml PBS冲洗培养板以去除残留培养基。加入3 ml胰蛋白酶进行消化，并置于37 °C培养箱中孵育5 min。
   2. 将培养板从培养箱中取出，轻轻敲击板壁两侧，使贴壁的BMSC/OB细胞脱落。
   3. 加入1 ml胎牛血清（FBS），并吹打3–5次以分散大的细胞团块。
   4. 将含有细胞的液体收集至15 ml锥形管中。这些细胞为未纯化的PD亚群，其中也包含BMSC/OB细胞。
4. 将分离得到的3个亚群在400 × g下离心7 min。吸除并弃去上清液，分别将沉淀重悬于1 ml预热的培养基中。细胞即可用于加载至G10柱中。

5. 将共培养细胞上样至 G10 柱

注意：在向G10层析柱中加入含细胞的培养基之前，务必确保旋塞完全关闭。此外，每个亚群必须分别通过独立的G10层析柱进行分离，以避免在后续分析中引入群体间的偏差。

1. 使用 1,000 µl 移液器，将每种细胞亚群在预热培养基中的 1 ml 逐滴加入到单独的 G10 柱中。确保含有细胞的培养基保持在 G10 沉淀物的上方或内部。在室温下孵育 20 分钟。
   注意： 孵育期间，活塞始终保持关闭状态。

6. 从 G10 柱收集白血病细胞

1. 向每个G10柱中加入1-3 ml预热的培养基。打开活塞阀，使培养基以逐滴方式缓慢流出。
   注意：必须保持柱子流出速度缓慢，否则含有BMSC/OB的G10沉淀物可能被冲出柱子，从而污染分离得到的白血病细胞。
2. 持续以小量（1-2 ml）向G10柱中添加预热的培养基，直至总共15至20 ml培养基流经柱子并被收集完毕。关闭活塞阀，并盖紧收集管管盖。
   注意：若在收集管底部观察到G10颗粒沉淀，应轻柔移除上清液，保留G10颗粒沉淀不受扰动，并将其转移至新管中。
3. 将收集的流出液在室温下以400 × g离心7分钟。弃去上清液，并将细胞沉淀重悬于适用于下游应用的缓冲液中。
4. 此时细胞为纯化的白血病细胞群体，不含BMSC或OB污染，可根据用户需要直接用于后续实验。
   注意：白血病细胞在通过G10柱后，其活力应保持不变。

结果

成功建立并培养该共培养模型后，相对于贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）单层，白血病细胞将形成3个亚群。图1展示了将急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞接种至BMSC单层后，最初仅表现为单一悬浮白血病细胞群。在共培养4天的过程中，白血病细胞与BMSC相互作用，逐渐形成3个空间上可区分的白血病细胞亚群（悬浮型（S）、相位明亮型（PB）和相位暗淡型（PD））。尽管在与BMSC或OB共培养24小时后通常即可观察到这3个肿瘤细胞亚群，但我们选择共培养4天，以确保白血病细胞与BMSC/OB细胞之间的全部动态相互作用在任何操作或实验干预前充分发生（图1）。此外，需注意我们维持共培养体系的氧张力为5%，以模拟骨髓生理环境，文献报道骨髓氧浓度范围为1%–7%^16–18。

绝大多数下游分析都需要将白血病细胞与骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）分离。为此，我们使用...

讨论

微小残留病（MRD）是导致疾病复发的重要因素，在侵袭性难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）以及其他多种血液系统恶性肿瘤的治疗中，仍然是一个主要的临床挑战。骨髓微环境是ALL最常见的复发部位^3,8。因此，能够模拟骨髓微环境的模型对于验证化疗过程中白血病肿瘤细胞存活及MRD维持相关假说至关重要。尽管小鼠模型是评估药物疗效相关问题的金标准，二维共培养仍是测试与骨髓微环境支持白血病细胞存活相关的假说和药物策略的一种经济有效的方法。许多研究已表明，当白血病细胞与骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）共培养时，在接受化疗药物处理后可获得生存优势^{9,10,12-14,19-21}。以往在间充质干细胞（MSC）共培养体系中对正常未成熟CD34+造血细胞的研究发现，造血细胞会与贴壁的MSC单层相互作用，形成三种空间分布不同的造血细胞群体^22,23。CD34+细胞的增殖和分化程度与其在共培养体系中的位置相关²²。我们在该观察基础上进一步拓展，利用二维共培养模型研究骨髓微环境基质细胞对耐药肿瘤细胞亚群的支持作用，并探索将其分离以用于后续分析的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
G10 Sephadex 小珠	Sigma	G10120	文中称为凝胶型10交联葡聚糖颗粒
10 ml 无菌注射器	BD	309604
玻璃棉	Pyrex	3950
单向旋塞阀	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml 锥形离心管	World Wide Medical Products	41021039	用作收集管
15 ml 锥形离心管	World Wide Medical Products	41021037	用于细胞收集
胎牛血清	Sigma	F6178
0.05% 胰蛋白酶	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm 细胞培养皿	Greiner Bio-One	664160
培养基
成骨细胞培养基	PromoCell	C-27001	用于人成骨细胞培养基
RPMI 1640 培养基	Mediatech, Inc.	15-040	用于肿瘤培养基制备
细胞系
贴壁细胞：
人成骨细胞	PromoCell	C-12720	人成骨细胞按照供应商的建议进行培养。’
人骨髓基质细胞	WVU 生物样本核心库		去标识化的原代人白血病细胞和骨髓基质细胞（BMSC）由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心（MBRCC）生物样本处理核心库和西弗吉尼亚大学病理学组织库提供。BMSC 培养物的建立方法如先前所述 (*)
白血病细胞：
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH 细胞按照供应商的建议及其推荐培养基进行培养。’
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 细胞按照供应商的建议及其推荐培养基进行培养。’
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. 依托泊苷对骨髓基质细胞功能的破坏。Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 年 8 月；3(3):122–132。