建立化疗耐药型白血病模型 体外

摘要

本报告总结了一种可用于模拟骨髓微环境生态位对白血病细胞影响的实验方案，重点在于富集化疗抗性最强的亚群细胞。

摘要

众所周知，骨髓微环境为血液系统疾病提供了一个独特的庇护所，这些疾病在此部位发生并进展。本报告中介绍的模型利用人原代骨髓基质细胞和成骨细胞作为骨髓微环境中的两种代表性细胞类型，以研究其对肿瘤细胞表型的影响。 体外 上述人源白血病细胞与主要微环境组分共培养的条件，可支持产生一群具有化疗耐药性的肿瘤细胞亚群，该亚群可高效地从培养体系中回收，并用于多种技术手段的分析。通过严格的换液程序以避免营养波动，并利用凝胶型10号交联葡聚糖（G10）颗粒回收已迁移至贴壁的骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）下方的肿瘤细胞，从而获得“相位暗化”（PD）肿瘤细胞群体，此方法可稳定地提供纯化的治疗耐药性白血病细胞。这一具有临床相关性的肿瘤细胞群体可通过标准方法进行评估，用于研究凋亡、代谢及细胞周期调控通路，同时也为在临床前研究针对微小残留病灶开发新型治疗策略时，提供更为严格的靶标。

引言

该方法的总体目标是提供一种高效、经济 体外 一种支持研究化疗期间骨髓支持白血病细胞存活机制的方法。已有充分证据表明，治疗后仍存活的残留肿瘤细胞会导致疾病复发，且复发常比初诊时更具侵袭性，治疗效果也往往更差。^1-8仅包含白血病细胞的模型（例如仅将细胞在培养基中进行培养的模型）在测试治疗策略时未考虑这些关键信号，也未考虑疾病异质性，而这种异质性是由微环境信号的可获得性所引发的，其中与微环境细胞具有特定相互作用的肿瘤细胞亚群会获得更强的保护作用。标准的二维共培养模型将骨髓来源的基质细胞与白血病细胞共同培养，在一定程度上弥补了骨髓微环境的影响，研究表明，与骨髓微环境细胞相互作用可增强白血病细胞对化疗的耐药性，并改变其生长特性。^9-14然而，这些模型通常无法再现肿瘤细胞的长期存活情况，也不能准确反映与导致微小残留病（MRD）的最耐药白血病细胞群体相关的结局。 在体 模型在临床试验前对创新疗法的研究中仍然至关重要，并被视为“金标准”，但其常受限于验证耐药性肿瘤及疾病复发相关假设所需的时间和成本。因此，开发信息量更丰富的二维模型将有助于开展初步研究，从而为后续基于小鼠的临床前研究设计提供更可靠的指导。

二维 体外 本报告中呈现的模型缺乏真实情况的复杂性 体内 微环境，但提供了一种经济高效且可重复的方法，用于研究肿瘤细胞与微环境之间的相互作用，尤其适用于富集具有化疗耐药性的肿....

方案

1. 高级准备

1. 制备葡聚糖G10颗粒。
   1. 通过向10 g G10颗粒中加入50 ml 1× PBS来制备G10悬液。轻轻颠倒混匀，并于4 °C过夜静置，使G10颗粒从磷酸盐缓冲液（PBS）中充分沉降。
   2. 进行G10柱分离当天，吸除沉降后的G10颗粒上层PBS，加入50 ml新鲜PBS，颠倒混匀。重复此洗涤步骤两次，每次均向沉降的G10颗粒中加入50 ml新鲜PBS，最后将G10颗粒储存于4 °C，待用。
2. 培养骨髓间充质干细胞（BMSC）和成骨细胞（OB）。
   1. 将BMSC或OB细胞在37 °C、6% CO₂条件下培养，接种于10 cm组织培养皿中，直至细胞融合度达到90%。
   2. 用胰酶消化BMSC或OB细胞，按1:2比例传代至新的10 cm培养皿中。按此标准持续培养细胞，直至用于白血病细胞共培养实验。

2. 建立并维持共培养体系

1. 加入 5-20 x 10⁶ 将白血病细胞以10 ml肿瘤特异性培养基接种至80%-90%融合度的BMSC或OB培养板中。
   注意： 我们的实验室在37 °C、5% O₂条件下维持共培养体系₂ 更好地模拟已被证实范围为1%至7%....

结果

成功建立并培养该共培养模型后，相对于贴壁的骨髓间充质干细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）单层，白血病细胞将形成3个亚群。图1展示了将急性淋巴细胞白血病（ALL）细胞接种至BMSC单层后，最初仅表现为单一的悬浮白血病细胞群。在4天的培养过程中，白血病细胞与BMSC相互作用，逐渐形成3个空间上可区分的白血病细胞亚群：悬浮型（S）、相位明亮型（PB）和相位暗淡型（PD）。尽管在与BMSC或OB共培养24小时后通常即可观察到这3个肿瘤细胞亚群，但我们选择共培养4天，以确保白血病细胞与BMSC/OB细胞之间的全部动态相互作用在任何操作或实验干预前充分发生（图1）。此外，需注意我们维持共培养体系的氧张力为5%，以模拟骨髓生理环境，文献报道骨髓氧浓度范围为1%–7%^16–18。

绝大多数下游分析都需要将白血病细胞与BMSC或OB分离。为此，我们使用G10柱来收获纯的白血病细胞群.......

讨论

微小残留病（MRD）是导致疾病复发的重要因素，在侵袭性难治性急性淋巴细胞白血病（ALL）以及其他多种血液系统恶性肿瘤的治疗中，仍然是一个主要的临床挑战。骨髓微环境是ALL最常见的复发部位^3,8。因此，能够模拟骨髓微环境的模型对于验证化疗过程中白血病肿瘤细胞存活及MRD维持相关假说至关重要。尽管小鼠模型是评估药物疗效相关问题的金标准，二维共培养仍是测试与骨髓微环境支持白血病细胞存活相关的假说和药物策略的一种经济有效的方法。许多研究已表明，当白血病细胞与骨髓基质细胞（BMSC）或成骨细胞（OB）共培养时，在接受化疗药物处理后可获得生存优势^{9,10,12-14,19-21}。以往在间充质干细胞（MSC）共培养体系中对正常未成熟CD34+造血细胞的研究发现，造血细胞会与贴壁的MSC单层相互作用，形成三种空间分布不同的造血细胞群体^22,23。CD34+细胞的增殖和分化程度与其在共培养体系中的位置相关²²。我们在该观察基础上进一步拓展，利用二维共培养模型研究骨髓微环境基质细胞对耐药肿瘤细胞亚群的支持作用，并探索将其分离以用于后续分析的方法。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
G10 Sephadex 小珠	Sigma	G10120	文中称为凝胶型10交联葡聚糖颗粒
10 ml 无菌注射器	BD	309604
玻璃棉	Pyrex	3950
单向旋塞阀	World Precision Instruments, Inc.	14054-10
50 ml 锥形离心管	World Wide Medical Products	41021039	用作收集管
15 ml 锥形离心管	World Wide Medical Products	41021037	用于细胞收集
胎牛血清	Sigma	F6178
0.05% 胰蛋白酶	Mediatech, Inc.	25-053-CI
100 x 20 mm 细胞培养皿	Greiner Bio-One	664160
培养基
成骨细胞培养基	PromoCell	C-27001	用于人成骨细胞培养基
RPMI 1640 培养基	Mediatech, Inc.	15-040	用于肿瘤培养基制备
细胞系
贴壁细胞：
人成骨细胞	PromoCell	C-12720	人成骨细胞按照供应商的建议进行培养。’
人骨髓基质细胞	WVU 生物样本核心库		去标识化的原代人白血病细胞和骨髓基质细胞（BMSC）由玛丽·巴布·兰道夫癌症中心（MBRCC）生物样本处理核心库和西弗吉尼亚大学病理学组织库提供。BMSC 培养物的建立方法如先前所述 (*)
白血病细胞：
REH	ATCC	ATCC-CRL-8286	REH 细胞按照供应商的建议及其推荐培养基进行培养。’
SD-1	DSMZ	ACC 366	SD-1 细胞按照供应商的建议及其推荐培养基进行培养。’
(*) Gibson LF, Fortney J, Landreth KS, Piktel D, Ericson SG, Lynch JP. 依托泊苷对骨髓基质细胞功能的破坏。Biol Blood Marrow Transplant J Am Soc Blood Marrow Transplant. 1997 年 8 月；3(3):122–132。