蛋白表达的定量分析来研究宗族规范小鼠植入前胚胎

Summary

该协议提出对蛋白质表达的原位分析进行定量，单细胞研究在小鼠植入前胚胎沿袭规范的方法。必要的囊胚的汇编程序，整个安装蛋白的免疫检测，在一个共焦显微镜，和核分割和图像分析的样品的成像进行描述。

Abstract

这个协议提供了一个方法来进行定量，原位单细胞蛋白表达的分析，以研究谱系规范 在小鼠植入前胚胎。描述所需胚胎收集，免疫荧光，在共聚焦显微镜成像，和图像分割和分析的过程。此方法允许在胚胎的所有单元中的多个核标志物的表达和空间（XYZ）的定量的坐标。这需要MINS，专门为着床前胚胎和胚胎干细胞（ESC）的菌落的共焦图像的分析开发出一种图像分割的软件工具的优点。 MINS执行通过X，Y和Z维度的无监督核分割，并以最小的用户输入的所有信道产生在三维空间上单元位置信息，以及核荧光水平。虽然该协议已经为图像的分析而优化植入前阶段的小鼠胚胎的，它可以容易地适应于呈现良好信噪比并且其中高核密度带来了障碍的图像分割（例如，胚胎干细胞中的表达分析的任何其他样品的分析（ESC ）菌落，分化培养中的细胞，其它物种或阶段等 ）的胚胎。

Introduction

鼠标植入前胚胎是一个范例来研究细胞命运说明书和哺乳动物从头上皮的研究出现和体内的多能性的维持，以及一个模型。哺乳动物发育的胚胎植入前阶段致力于建立三种细胞谱系构成囊胚，即多能性外胚层 ​​- 这引起了大多数体细胞组织和生殖细胞 - 和两个胚谱系，滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PRE）（图^1A）1,2。这个协议描述的步骤（1）收获并修复植入前阶段的小鼠胚胎，（2）执行免疫荧光标记的感兴趣的蛋白质，（3）进行整个安装使用共聚焦显微镜用z-切片功能和成像（4）执行共聚焦图像和随后的定量图像分析的核分割。这条管道可以牛逼他无偏蛋白水平的测量小区标识的分配来表征原位细胞亚群。这种协议可以在少至3来进行-第4天为一个单一垫料（通常最多10个小鼠胚胎），从胚胎收集到数据分析（图1B）。几个窝的同时分析会增加成像和数据分析时间负担，从而延长了协议的总长度。

植入前阶段的小鼠胚胎是一个听话的实验系统，其中，由于其体积小，定型形态^3， 在单细胞分辨率的细胞过程TOTO成像非常适合。开展胚胎的统计相关数字的公正，制度层面的分析，自动的，定量分析的管道是可取的。然而，由于内细胞团的囊胚（ICM）的高核密度（ 图1A，2D），传统的图像分割平台不能提供足够的精度，以建立一个自动化或半自动化的....

Protocol

伦理学声明:所有动物的工作，包括饲养，繁殖和牺牲被批准为纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC），协议＃03-12-017。

1.胚胎收集

注 :所有动物的工作必须已通过机构和地方当局以及符合当地和制度规则。

1. 交配处女雌性小鼠与所需基因型的肥沃螺栓男性。
   注意 :如果设置自然交配，在estral周期的发情期女性选择交配增加对所需日期的机会。如果诱导超数排卵，请参阅²⁰中描述的协议。
2. 检查阴道塞在早晨用钝探针的存在。理想情况下，这样做中午（下午12:00）之前，作为交配塞全天丢失。考虑野应检测阴道塞胚胎天（E）0.5的n个。
3. 所需天和胚胎发育的时间，预热M2或冲洗保持介质（FHM）至RT，或优选37ºC。注意:无论M2或FHM可用于冲洗和处理的胚胎。在不使用时，这些存储介质在4ºC。估计每个子宫利用〜2毫升培养基。
4. 解冻冷冻4％低聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS），或准备一些新鲜的溶液。估计500微升每孔4％PFA溶液4孔板。固定在4孔平板的每个孔一窝。注意:可替换地，一个96孔板可用于固定和存储胚胎。如果使用96孔板，使用PFA溶液每孔100μl。
5. 使用明火绘制在尖端的毛细管端拉玻璃巴斯德吸....

Results

为了便于数据解释和介绍，应注意不要收集和操作过程中损坏的胚胎，使所有的细胞和它们的相对位置可分析图2A - D示出了在具有扩展腔的不同阶段的完整胚泡的例子。如果出现损坏，格外小心，应注意分析和解释结果时。

使用该协议生成的数据的质量和可靠性依赖于固定的质量和用于检测所关注的蛋白质的抗体的信噪比。总是用新鲜固定液和测试新的抗体，以适当的阳性和阴性对照，在开始一组实验之前， 图2A示出良好的抗体的例子为一些核蛋白质。 图2B示出为例为细胞质蛋白（DAB2）良好的抗体即图2C示出一个坏染色，具有低信噪比，其中所述样品固定为仅10分钟的一个例子。在这种情况下，用于GATA4的抗体（Santa Cruz，SC-1237）需要O / N固定提供了有力的信号（见²⁴固定O / N和沾有这种抗体胚胎的情况下）。后.......

Discussion

本协议描述在植入前阶段的小鼠胚胎进行全挂载免疫荧光定量分析的方法。一个强大的免疫协议²²后跟高分辨率，整个安装使用定制的软件⁴聚焦成像和图像分割。而免疫协议的选择不是关键，我们发现这里呈现²²是快速，可靠，并为许多我们已经测试了抗体的提供可靠的信号之一。其它协议可遵循，条件是它们的应用是在整个等效实验一致。虽然许多因素会影响每个单独的实验的实验之间的结果，并直接比较不一定可能的，我们已经发现，在重复追求一致性和执行足够技术重复大大降低可变性。因此，一旦进行了优化，固定和immunolabelin克试剂和方案，以及摄像条件应保持等效实验之间恒定。

1）质量差染色，以暗信号，以及2）不理想的分割，具有很多错误（即，过冲和下分割）:这协议秋季的应用过程中可能出现成两组的主要问题。低质量免疫通常是由于样品的定影不当或不适合于整个安装免疫的抗体。确保PFA是新鲜的（无论是新鲜制备或者从-20ºC解冻RT不超过前一个星期）。由于植入前胚胎的体积小，10分钟内固定PFA应该足够了。然而，我们已经发现某些抗体具有.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>胚胎收集
插头检查的钝探针	Roboz	RS-9580
镊子	Roboz	RS-4978
手术剪刀	Roboz	RS-5910
玻璃巴斯德移液器	Fisher	13-678-20C
预装吸气管和口器	Sigma	A5177
更长的橡胶管	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
酸性酪蛋白溶液	Millipore	MR-004-D
青霉素/链霉素	Gibco	15140
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
4 孔板	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
<强>免疫荧光
96 孔 U 型底板	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
甘氨酸		Sigma G7403
马血清	Sigma	H0146
<强>一抗			<强>浓度
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1：200
GATA6	R&D	AF1700	1：100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1：100,10 分钟固定
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1：100，O/N 固定
SOX17	R&D	AF1924	1：100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1：500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1：100,10 分钟至 O/N 固定
DAB2	BD	BD BD-610464	1：200
二抗	Life Technologies	各种	1：500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
成像
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
运行 64 位 Windows作系统		的计算机 n/a	验证 http://katlab-tools.org 的最低系统要求，Lou et al.， （2014） Stem Cell Reports
MATLAB （软件）	Mathworks	n/a
MINS （软件）	免费	n/a	http://katlab-tools.org