小鼠植入前胚胎谱系特化过程中蛋白质表达的定量分析

摘要

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位 分析蛋白质表达以研究小鼠植入前胚胎的谱系特化。本文描述了囊胚收集、蛋白质全胚免疫荧光检测、共聚焦显微镜样品成像以及核分割与图像分析所需的各项操作步骤。

摘要

本方案介绍了一种进行定量、单细胞分析的方法 原位 蛋白质表达分析用于研究谱系特化 在小鼠植入前胚胎中的应用。本文描述了胚胎收集、免疫荧光染色、共聚焦显微镜成像以及图像分割与分析所需的各项步骤。该方法可对胚胎中所有细胞的多种核标志物表达水平及空间（XYZ）坐标进行定量分析。本方法利用MINS——一种专为分析植入前胚胎和胚胎干细胞（ESC）集落的共聚焦图像而开发的图像分割软件工具。MINS可在X、Y和Z维度上实现无需人工监督的核分割，仅需极少的用户输入，即可提供细胞在三维空间中的位置信息以及各通道的核荧光强度数据。尽管本实验方案已针对小鼠植入前胚胎图像的分析进行了优化，但也可便捷地适用于其他具有较高信噪比、且高核密度对图像分割构成挑战的样本分析例如.，胚胎干细胞（ESC）集落的表达分析，培养中分化细胞，其他物种或发育阶段的胚胎 等等。).

引言

小鼠植入前胚胎是研究多能性出现与维持的经典模型 体内以及细胞命运决定研究的模型 从头合成 上皮化在哺乳动物中的发生。哺乳动物发育的着床前阶段致力于建立构成囊胚的三个细胞谱系，即多能性的上胚层（其将发育为大多数体细胞组织和生殖细胞），以及两个胚外谱系——滋养层（TE）和原始内胚层（PrE）。图1A) ^1,2本方案描述了以下操作步骤：（1）获取并固定小鼠着床前阶段胚胎；（2）进行免疫荧光染色以标记目标蛋白；（3）利用具备z轴层扫功能的共聚焦显微镜对完整胚胎进行全封片成像；（4）对共聚焦图像进行细胞核分割及后续定量图像分析。该流程可实现对蛋白水平的无偏定量，用于确定细胞身份，进而表征细胞亚群 原位该方案从胚胎收集到数据分析，单窝（通常最多10个鼠胚）可在3至4天内完成。图1B同时分析多窝幼崽会增加成像和数据分析的时间负担，从而延长整个实验方案的总时长。

小鼠植入前阶段胚胎是一种实验上易于操作的体系，因其体积小且具有典型的形态特征 ³，非常适合于 整体上 以单细胞分辨率对细胞过程进行成像。为了对具有统计学意义数量的胚胎进行无偏倚的系统水平分析，需要建立一种自动化的定量分析流程。然而，由于囊胚内细胞团（ICM）具有较高的细胞核密度，图1A、2D），传统的图像分割平台无法提供足够的准确性，以建立自动化或半自动化的分析流程。另一方面，尽管手动分割具有较高的准确性，但其无法处理大量细胞和胚胎样本，也不适用于可重复、无偏倚的细胞身份鉴定——这在研究标志物表达模式尚未完全明确的发育阶段时尤为关键。例如，不会在群体中呈现二元分布）。我们近期开发并验证了一种专用于小鼠植入前胚胎及小鼠胚胎干细胞（ESCs）的图像分割方法，该方法具有高准确性，且所需用户输入极少 ^4-8.

本文介绍的分析流程基于 MATLAB 的图像分割工具——模块化交互式核分割工具（Modular Interactive Nuclear Segmentation, MINS）⁴。在用户通过图形用户界面（GUI）设定少量图像属性后，MINS 可对大量共聚焦 Z 层图像进行无监督的核分割（表1）⁴。该流程已被证实可高效生成关于野生型、实验处理及基因修饰胚胎和胚胎干细胞（ESCs）中蛋白质表达与细胞定位的高通量数据^5-7。在本实验方案中，我们描述了 MINS 在植入前阶段胚胎图像分割中的应用。关于 MINS 在 ESCs 上性能的示例，请参见文献^4,7。自动化的核分割步骤显著降低了细胞识别过程的时间成本，而空间位置与荧光强度的测量则可实现对细胞身份的无偏判定，并生成胚胎中基因表达区域与细胞位置的三维图谱（图1C）。此外，该工作流程具有良好的可扩展性，适用于分析单个产仔批次乃至大量实验处理的胚胎，或具有不同遗传背景的胚胎^5,6。MINS 可在 http://katlab-tools.org 免费获取（软件运行需具备 MATLAB 许可证）。

迄今为止，尚无任何方法能够获得关于小鼠植入前胚胎中蛋白质表达和细胞定位的如此深入的数据。此前所有对这类数据进行定量的尝试均局限于手动确定胚胎中不同细胞群体的细胞数量（完全手动或借助软件）^9-19。该方法（结合MINS软件）已针对小鼠植入前胚胎和胚胎干细胞（ESCs）进行了优化和验证；尽管尚未在其他高细胞核密度体系中进行测试，但预计其表现将与之相当。

方案

伦理声明：所有动物实验，包括饲养、繁殖和处死，均已获得纪念斯隆-凯特琳癌症中心机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准，方案编号 #03-12-017。

1. 胚胎收集

注意：所有动物实验必须经过机构和当地主管部门批准，并符合当地和机构的规定。

1. 将一只处女雌性小鼠与具有目标基因型的可育雄鼠进行交配。
   注意：若采用自然交配方式，选择处于动情周期动情期的雌鼠可提高在目标日期成功交配的几率。若需诱导超数排卵，请参考文献²⁰中描述的方案。
2. 次日早晨使用钝头探针检查阴道栓的存在。理想情况下应在中午（12:00）前完成检查，因为交配后形成的阴道栓会随时间逐渐脱落。将发现阴道栓的当天中午定为胚胎发育第（E）0.5天。
3. 在目标胚胎发育日的指定时间，将M2或冲卵保存液（FHM）升温至室温 或更优的37 ºC。注意：冲卵和胚胎操作过程中可使用M2或FHM。未使用时，将这些培养基保存在4 ºC。每只子宫预计使用约2 ml培养基。
4. 解冻预先冷冻的4%多聚甲醛（PFA）磷酸盐缓冲液（PBS）溶液，或配制新鲜溶液。每孔4孔板预计使用500 µl的4% PFA溶液。每孔4孔板固定一窝胚胎。注意：也可使用96孔板固定和保存胚胎。若使用96孔板，每孔加入100 µl PFA溶液。
5. 使用明火拉制玻璃巴斯德吸管，在其尖端形成毛细管末端。
6. 通过颈椎脱臼或CO₂吸入法处死雌鼠，或按照当地及机构规定的方法执行。通常建议通过颈椎脱臼确认动物已安乐死。
7. 用70%乙醇喷洒动物腹部，以减少毛发脱落，并进行腹部切口，先切开皮肤，再切开体壁（腹膜），以暴露内脏。
   注意：以下步骤描述了从妊娠雌鼠子宫中收集囊胚的操作流程，适用于胚胎发育第3.25天至第4.5天（E3.25–E4.5）的任意阶段（图1A）。如需收集早于E3.25的着床前胚胎，请参阅文献²⁰中的相关方案。
8. 找到子宫并将其取出。用镊子夹住子宫颈端，剪断宫颈，轻轻上提以拉伸两侧子宫角。
9. 去除子宫周围的脂肪组织，注意避免刺破子宫壁。此步骤可在取出时进行（此时子宫仍连接于动物体内），因可拉伸子宫而更易操作；也可在之后于解剖显微镜下、在室温PBS中完成。有关子宫解剖的更详细方案，请参见方案5 & 8 ²⁰。
10. 在输卵管上方、卵巢下方剪断，完整取出子宫，置于培养皿中并用PBS覆盖。
    注意：此步骤同时可清洗子宫表面多余的血液或其他碎屑，有助于后续囊胚的收集。
11. 在宫颈两侧近端处剪断，分离两侧子宫角，并弃去宫颈部分。在连接处（峡部）下方剪断，将每侧输卵管与子宫分离（图1A）。将两个子宫角转移至一滴操作培养基（M2或FHM）中，用于胚胎收集与操作。
12. 在解剖显微镜下，通过向每个子宫角的宫颈开口处注入0.5–1 ml的M2或FHM，将囊胚从子宫中冲出至培养基中。使用1 ml注射器配皮下注射针头。注意：可用磨石将针头磨钝以避免撕裂子宫，但此步骤并非必需。详细的子宫冲卵示意图见文献²¹。
13. 在解剖显微镜下寻找分散在液滴中的囊胚。冲卵后静置1–2分钟，使囊胚沉降至培养皿底部。使用带毛细管末端的口控玻璃巴斯德吸管，收集所有囊胚并转移至新鲜液滴中。
14. 将囊胚依次通过2–3滴新鲜M2或FHM进行清洗。每次转移5–10个囊胚为一组。
    注意：单次转移较多囊胚可加快操作速度，但也会增加意外丢失多个胚胎的风险。若不熟悉口控吸管的操作，建议在正式实验前先练习胚胎操作与转移技术。
15. 通过短暂清洗于酸性泰罗德液中，去除未孵化囊胚（通常为<E4.0）的透明带（ZP）。一旦透明带不可见，立即转移囊胚回操作培养基中。仅在绝对必要的时间内将胚胎保留在酸性泰罗德液中，以防止细胞损伤。
    1. 操作去透明带囊胚时需格外小心，因其极易黏附于玻璃和塑料表面。操作培养基中含有4 mg/ml牛血清白蛋白（BSA）以防止黏附，但酸性泰罗德液或PBS中不含BSA。因此，在无BSA或无血清的PBS或酸性泰罗德液中操作时，每次转移不应超过2–5个去透明带囊胚，以降低胚胎损伤或丢失的风险。
       注意：也可在使用前用1% BSA包被玻璃吸管，以减少胚胎对玻璃表面的黏附。
16. 用一层薄薄的1%琼脂、0.9% NaCl包被4孔组织培养板每孔底部，以防止胚胎黏附于塑料表面。或者，在PBS中添加4 mg/ml BSA（即PBS-BSA）。
17. 在已包被的4孔组织培养板中，向一孔加入500 µl室温PBS（或PBS-BSA），另一孔加入500 µl PBS配制的4% PFA。
18. 将囊胚在室温PBS中清洗，随后在PBS中的4% PFA中于室温固定10分钟。固定后转移至PBS（或PBS-BSA）中。
19. 若胚胎不立即进行后续处理，可在含胚胎的PBS上覆盖一层矿物油，防止蒸发（避免样本干燥），并将培养板置于4 ºC保存。
    注意：根据实验目的、目标表位及所用抗体的不同，可采用不同的固定方法和时间。无论选择何种方法，应在相同类型的实验中保持一致，以便后续染色结果的比较。
    注意：暂停点：胚胎可在PBS中于4 ºC保存数周后再进行下一步操作。若预期长期保存，应确保PBS无菌，和/或添加100 U/ml青霉素+100 µg/ml链霉素（Pen-Strep），以防止细菌污染（尤其是在使用PBS-BSA时）。

2. 免疫荧光

1. 采用任何先前已测试并证明对整体免疫荧光染色稳定可靠的方法进行免疫荧光实验。注：我们推荐参考文献²²和¹¹中所述方法。本文将描述前者。无论选择何种方法，均应在相同实验中保持一致，以便于染色结果的比较。
2. 使用柔性聚氯乙烯透明U型底96孔板进行免疫荧光实验的连续步骤。每个孔中加入50–100 µl溶液，使用L型口吸管将胚胎从一种溶液转移至另一种溶液。注：该方法可最大限度减少试剂使用量，并便于步骤追踪以及多个实验组的并行染色。
   1. 可选：在孔底涂布一层薄薄的1%琼脂、0.9% NaCl，以防止胚胎粘附于塑料表面。切勿在免疫荧光溶液中添加BSA。
3. 配制PBX（含0.1% Triton X-100的PBS）。若计划进行多次免疫荧光实验，可配制50 ml PBX，并在实验间4 ºC保存。
4. 配制通透化溶液（含0.5% Triton X-100和100 mM甘氨酸的PBS）。每次实验前新鲜配制1 ml（或所需其他体积）通透化溶液。
5. 配制封闭液（含2%马血清（HS）或20%胎牛血清（FBS）及青霉素-链霉素的PBS）。配制10 ml，并在实验间4 ºC保存。
   1. 两种血清之间未观察到明显差异，但在相同实验中应始终使用同一种封闭液。
6. 在室温下用PBX（约100 µl）冲洗固定后的胚胎5分钟。
7. 在室温下用通透化溶液（约100 µl）处理胚胎5分钟以实现通透化。
8. 在室温下用PBX（约100 µl）冲洗胚胎5分钟。
9. 在室温下用约100 µl封闭液封闭胚胎30分钟至1小时。用一层矿物油覆盖液体表面以防止蒸发，或置于湿化孵育盒中。
   注：胚胎可在4 ºC封闭液中封闭长达过夜（O/N） ，但与30分钟封闭相比并无明显改善或不利影响。
10. 将胚胎在4 ºC下用一抗/多种一抗稀释于封闭液（约100 µl）中孵育过夜（O/N）。用一层矿物油覆盖液体表面以防止蒸发，或置于湿化孵育盒中。
    1. 应预先确定每种一抗的最佳稀释比例。有关多种抗体的测试稀释比例，请参见讨论部分和材料部分。
11. 过夜孵育后，在室温下用PBX（约100 µl）冲洗胚胎3次，每次5分钟。
12. 在室温下用约100 µl封闭液再次封闭胚胎30分钟至1小时。用一层矿物油覆盖液体表面以防止蒸发，或置于湿化孵育盒中。
13. 在4 ºC下用二抗/多种二抗稀释于约100 µl封闭液中（终浓度为4 µg/ml）孵育胚胎1至2小时。用一层矿物油覆盖液体表面以防止蒸发，或置于湿化孵育盒中。
14. 在室温下用PBX冲洗胚胎2次，每次5分钟。
15. 将胚胎转移至所选的DNA染色液中。若使用Hoechst 33342，将其稀释至5 µg/ml PBS中。用一层矿物油覆盖液体表面以防止蒸发，或置于湿化孵育盒中。
    注：暂停点：若胚胎不立即成像，可在核染色液中保存数周。此时应确保PBS无菌，和/或添加青霉素-链霉素或叠氮化钠以防止细菌生长和污染。

3. 共聚焦成像

注意：不同的共聚焦显微镜配置需要针对具体的系统和软件调整相应的采集参数。然而，以下部分提供了一套通用的操作原则，适用于任何配置的系统。

1. 使用细口移液器，在35 mm玻璃底培养皿的玻璃表面滴加PBS或细胞核染色液的微滴，并覆盖矿物油。 alternatively，可使用普通盖玻片配合硅胶间隔物，以避免损伤胚胎，再用玻璃显微镜盖片封片。注意：使用普通盖玻片时，胚胎后续无法重新定位或回收用于基因分型，因此我们强烈推荐使用玻璃底培养皿。
2. 将胚胎置于微滴中，并以一致的方式排列，最好使内细胞团-囊胚腔轴与玻璃表面平行。将培养皿放置在显微镜载物台上。注意：激光扫描共聚焦显微镜所获得的图像在Z轴方向上存在荧光强度衰减现象。因此，保持排列方式的一致性对于比较不同胚胎间相同区域的荧光强度至关重要。
3. 使用未经任何可能改变基因表达的处理的野生型胚胎来设定参考参数。
   1. 使用高倍物镜获取图像（即，40倍 或更高版本，以获取能够利用 MINS 工具进行准确分割的数据 ⁴.
      注意：使用20倍物镜进行数字变焦无法获得适合通过MINS进行分割的足够分辨率图像。还应注意物镜的工作距离（WD），其应足以允许采集贯穿整个胚泡的Z轴层叠图像，因此通常需要长工作距离（约130 - 150 µm）的物镜。图中所示的图像来自 图2 - 4 使用40X/NA 1.30油浸物镜（工作距离为210 µm）获取。
   2. 使用最低的激光输出功率，在不淬灭荧光染料的情况下获得较强的信噪比。
   3. 调整增益和偏移，以在不使样品过曝的前提下获得最宽的动态范围。使图像的灰度覆盖大部分或全部灰阶范围，有助于检测图像间微小的强度差异。
   4. 使用较小的Z轴步长（1 µm），因为Z轴分辨率对于MINS的准确分割至关重要。
      注意：XY 维度不影响核分割过程，仅影响图像文件大小。通常，512 × 512 像素的 XY 分辨率足以获得适合发表的图像质量，同时不占用过多硬盘空间。  
   5. 关键步骤： 在同一次实验的单次及多次成像过程中，应保持成像参数一致，以便对样品进行比较。
4. 成像处理多批次胚胎：
   1. 尽可能在单次实验中对图像相干组（同窝幼崽、实验组）进行成像。
   2. 在同一实验的重复样本中，成像过程中各项参数应在单次成像内及多次成像间保持一致。
   3. 对胚胎进行全范围（完整的Z轴）成像，以捕获每一个细胞。
      注意：如有需要，可在成像后按照所述方法进行胚胎基因分型 ²³是否需要进行巢式PCR需根据具体分析的位点和所用引物通过实验确定。
5. 确保能够事后将胚胎与图像一一对应。

4. 图像分析与数据预处理

1. 下载并安装 MINS ⁴ 来自 http://katlab-tools.org（需要 MATLAB 许可证）。
2. 执行图像分割：
   1. 按照 MINS 的图形用户界面（GUI）从硬盘加载共聚焦图像或图像栈，检测细胞核并分割图像。加载显微镜生成的完整原始 Z 栈数据（.lsm、.lif、.oif） 等等。）。参见 表 2 有关每个步骤的详细信息和说明见于  http://katlab-tools.org 和⁴完成后，点击相应的“查看”按钮以查看每一步的结果。按钮上方的黄色标签表示操作正在进行，绿色标签表示操作已完成。
      注意：MINS 目前不支持 .czi 文件、.tiff 序列或多视野文件——每个 Z 层序列必须为一个独立的文件。
   2. 分割满意后，保存所创建的流程，以便可直接用于其他胚胎或同窝幼崽。
3. 批量模式分割：
   注意：单个文件可单独进行分割。然而，由于同窝或同批次实验中的胚胎通常处于相似的发育阶段，MINS 可在无监督情况下，将基于单张图像建立的分割流程应用于一组图像。
   1. 从批量运行菜单中，点击“添加文件”并一次性加载所有待处理的文件。注意：可将来自不同来源的文件添加至分割队列中。
   2. 点击“开始批量运行”，并留出足够时间让软件处理文件。注意：分割结果将保存在原始文件所在的同一目录中。
4. 分割评估与手动校正
   注意：MINS 对图像的分割具有极高的准确性（>85%），然而，染色与成像的质量以及胚胎的发育阶段可能会影响MINS的性能。通常情况下，胚胎内的细胞核密度越高，越容易发生分割错误（图2D，图3因此，应对每个样本的分割准确性进行评估，并在需要时进行人工校正。通常会出现两种类型的错误：过度分割和欠分割。
   1. 解决过度分割问题：
      1. 识别假阳性——凋亡小泡图3A a、b、d、星号）或其他非完整细胞核的结构，但可能被MINS误识别为细胞核。
         注意：通常此类假阳性信号的尺寸小于真实细胞核，在大多数情况下，可轻松在电子表格中识别并筛选。然而，强烈建议进行视觉检查，因为细胞核有时可能仅被部分分割，从而产生较小但有效的分割体积图3A b，箭头). 
      2. 从 *statistics.csv 文件中删除对应于假阳性的记录。保留原始的 *statistics.csv 文件以供将来参考，仅编辑其副本。
      3. 如果一个细胞核被过度分割并呈现为两个或更多个细胞核（图3A c，箭头和箭头指示），可通过取其强度水平的平均值来合并记录，或在记录相似的情况下，保留其中一个记录并舍弃其余记录。
   2. 解决欠分割问题：
      1. 识别 MINS 未能检测到两个或多个细胞核之间边界，从而将它们分割为单个细胞核的事件图3A d，箭头和3B）。注意：这不仅会影响细胞计数的准确性，更重要的是会影响蛋白质水平的定量，因为所测得的蛋白水平将是被错误合并的细胞（可能属于不同谱系）的平均值。
      2. 识别MINS完全未能检测到细胞核的事件。
      3. 在这些情况下（4.4.2.1 和 4.4.2.2），使用其他工具（如 ImageJ（http://imagej.nih.gov/ij/））测量未分割或分割不足的细胞中各通道的平均灰度值，并用正确的数值替换错误的记录。保留原始的 *statistics.csv 文件以供日后参考，仅编辑其副本。使用 ImageJ 操作时，请遵循以下步骤：
         1. 在 ImageJ 中打开相应的多通道图像栈，并将 MINS 生成的相应 *overlaid.tiff 文件作为虚拟栈导入（“文件” > 导入 > TIFF 虚拟堆栈…）
         2. 找到未分节或分节不明显的核的中部切面。
         3. 使用自由选择工具勾勒出DNA染色通道中未分割或未完全分割的细胞核的轮廓。
         4. 按 Ctrl+M（Macintosh 上为 Cmd+M）或进入“分析”菜单并选择“测量”。此操作将记录所划定区域的平均灰度值，并在新窗口中显示。转到“分析” > 设置测量……，并确保选中“平均灰度值”。选择其他需要测量的参数。
         5. 使用步骤 4.4.2.3.3 中划定的相同区域，对每个感兴趣的荧光通道重复测量。结果将追加至“结果”窗口中先前的测量数据。
         6. 使用获得的测量数据替换 *statistics.csv 文件中的错误记录。如果细胞核未被分割，则插入新行，为其分配新的 Cell ID，并在对应通道的列下填入 ImageJ 中获得的数值。该细胞将没有空间坐标（X、Y 和 Z 值）。如果细胞核被欠分割，则复制其所在行，为每个新细胞分配不同的 Cell ID，并在对应通道的列下填入 ImageJ 中获得的数值。在此情况下，两个细胞将共享相同的空间坐标。
            注意：如果需要分析空间分布，建议排除这些细胞的 XYZ 坐标，因为它们会发生重叠。为此，在创建新记录时，应为这些细胞分配易于与原始编号区分的细胞编号（例如，使用非整数编号）。
   3. 对分裂细胞进行计数。注意：MINS 可检测有丝分裂期和间期的细胞核，但无法区分两者。
      1. 若需在分析中单独考虑有丝分裂期细胞核，应手动计数并记录该信息至数据文件。为记录有丝分裂细胞，需在 *statistics.csv 数据文件中新增一个变量（列），并为有丝分裂期和间期细胞核分配不同的数值。
5. 数据预处理。
   注意：一旦电子表格已完成对过度分割和分割不足的校正，即可进行分析。分析过程和数据呈现方式将取决于具体实验。但以下是一些我们建议在分析前进行的常规数据转换步骤：
   1. 将荧光强度值转换为其对数或平方根，以减少数据的离散程度。这也有助于数据可视化，因为原始数据往往集中在图谱的坐标轴附近（参见 图4B、C).
   2. 校正Z轴相关的荧光衰减：
      注意：在激光扫描共聚焦显微镜图像中，沿Z轴越深的切片，其荧光强度越低图4E、F).
      1. 如果样本中检测到的某个表位是普遍表达且均一分布的看家核标记物，则通过将每个细胞中其他表位的荧光强度值除以该细胞中相应看家标记物的值，对这些表位的荧光强度进行归一化。
      2. 若无此类参照标记物，则按以下方式补偿与Z轴相关的荧光信号损失：
         1. 将每个标记物的值（图中 Y 轴）随 Z 位置（图中 X 轴）绘图，以可视化 Z 方向上强度的下降情况——将所有对照组、野生型胚胎的数值绘制在同一图中图4F).
         2. 为每个标记物，将线性模型（回归曲线）拟合到上一步得到的图中（强度值随 Z 轴的变化）图4F).
         3. 使用以下公式校正每个标记物的所有数值：
            log(原始值) + Z * 模型的斜率图 4D、G).
            注意：执行此校正的具体步骤将取决于所使用的分析软件（R、MATLAB， 等等。）。如果使用 R，运行以下公式将线性模型拟合到数据：
            >lm(log(通道) ~ Z, data = data.frame) 
            其中， 通道 是需要校正的荧光通道， Z 是 Z 坐标和 数据框 包含所需胚胎所有数值的表格（由 MINS 生成的 *statistics.csv 文件或其修改版本）。
            注意：上述公式输出的格式如下：
            (截距)    Z
            4.76373       -0.01947
            其中，Z 值为该数据集回归直线的斜率，其绝对值应按照 4.5.2.2.3 中给出的公式用于修正原始值（见 图4G （例如）。 

结果

为了便于数据分析和展示，在收集和操作胚胎时应小心避免损伤，以确保所有细胞及其相对位置均可被分析。图2A - D展示了不同发育阶段具有扩张腔隙的完整囊胚示例。若发生损伤，在分析和解释结果时应格外谨慎。

采用本方案所获得数据的质量和可靠性取决于固定液的质量以及用于检测目标蛋白的抗体的信噪比。始终使用新鲜的固定液，并在开始一系列实验之前，使用适当的阳性和阴性对照对新抗体进行测试。图2A展示了多种核蛋白的优质抗体示例。图2B展示了用于细胞质蛋白（DAB2）的一种优质抗体示例。图2C展示了一种染色效果较差的情况，其信噪比较低，该样本仅固定了10分钟。在此情况下，用于GATA4的抗体（Santa Cruz，sc-1237）需要过夜固定才能获得强信号（参见²⁴中使用该抗体对过夜固定的胚胎进行染色的实例）。在后期...

讨论

本方案描述了一种对小鼠着床前胚胎进行整体免疫荧光定量分析的方法。首先采用一种可靠的免疫荧光方案²²，随后进行高分辨率的整体共聚焦成像，并利用定制软件⁴进行图像分割。尽管免疫荧光方案的选择并非关键，但我们发现此处所述方案²²快速、可靠，且对我们测试过的多种抗体均能产生稳定的信号。只要在相同实验中保持一致性，也可采用其他方案。虽然多种因素会影响单个实验的结果，且实验之间未必能直接比较，但我们发现，在重复实验中力求一致并进行足够数量的技术重复可显著降低变异性。因此，在优化完成后，相同实验之间的固定与免疫标记试剂及方案，以及成像条件均应保持恒定。

该方案实施过程中可能出现的主要问题分为两类：1）染色质量差，信号微弱；2）分割效果不理想，错误较多（即，过分割与欠分割）。免疫荧光质量较低通常源于样本固定不当，或所用抗体不适合整体免疫荧光染色。确保多聚甲醛（PFA）新鲜（either freshly prepared or thawed to RT from -20 ºC no longer than a wee...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
<强>胚胎收集
用于检查栓塞的钝头探针	Roboz	RS-9580
镊子	Roboz	RS-4978
手术剪刀	Roboz	RS-5910
巴斯德玻璃吸管	Fisher	13-678-20C
预组装吸液管 &和吹嘴	Sigma	A5177
更长的橡胶管	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
家族性偏瘫型偏头痛	Millipore	MR-024-D
酸性Tyrode溶液	默克密理博	MR-004-D
青霉素/链霉素	Gibco	15140
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
4孔板	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
<强>免疫荧光
96孔U型底板	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
甘氨酸	Sigma	G7403
马血清	Sigma	H0146
<强>一抗			<强>浓度
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1:200
GATA6	R&研发	AF1700	1:100
GATA4	圣克鲁斯	sc-9053	1:100，固定10分钟
GATA4	圣克鲁斯	sc-1237	1:100，过夜固定
SOX17	R&研发	AF1924	1:100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1:500
OCT4	圣克鲁斯	sc-5279	1:100，固定10分钟至过夜
DAB2	BD	BD-610464	1:200
二抗	Life Technologies	各种	1:500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
<强>成像
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C
<强>分割
运行 64 位 Windows 操作系统的计算机		n/a	在 http://katlab-tools.org 和 Lou 等（2014）《Stem Cell Reports》中核实最低系统要求
MATLAB（软件）	Mathworks	n/a
MINS（软件）	免费	n/a	http://katlab-tools.org