蛋白表达的定量分析来研究宗族规范小鼠植入前胚胎

Summary

该协议提出对蛋白质表达的原位分析进行定量，单细胞研究在小鼠植入前胚胎沿袭规范的方法。必要的囊胚的汇编程序，整个安装蛋白的免疫检测，在一个共焦显微镜，和核分割和图像分析的样品的成像进行描述。

Abstract

这个协议提供了一个方法来进行定量，原位单细胞蛋白表达的分析，以研究谱系规范 在小鼠植入前胚胎。描述所需胚胎收集，免疫荧光，在共聚焦显微镜成像，和图像分割和分析的过程。此方法允许在胚胎的所有单元中的多个核标志物的表达和空间（XYZ）的定量的坐标。这需要MINS，专门为着床前胚胎和胚胎干细胞（ESC）的菌落的共焦图像的分析开发出一种图像分割的软件工具的优点。 MINS执行通过X，Y和Z维度的无监督核分割，并以最小的用户输入的所有信道产生在三维空间上单元位置信息，以及核荧光水平。虽然该协议已经为图像的分析而优化植入前阶段的小鼠胚胎的，它可以容易地适应于呈现良好信噪比并且其中高核密度带来了障碍的图像分割（例如，胚胎干细胞中的表达分析的任何其他样品的分析（ESC ）菌落，分化培养中的细胞，其它物种或阶段等 ）的胚胎。

Introduction

鼠标植入前胚胎是一个范例来研究细胞命运说明书和哺乳动物从头上皮的研究出现和体内的多能性的维持，以及一个模型。哺乳动物发育的胚胎植入前阶段致力于建立三种细胞谱系构成囊胚，即多能性外胚层 ​​- 这引起了大多数体细胞组织和生殖细胞 - 和两个胚谱系，滋养外胚层（TE）和原始内胚层（PRE）（图^1A）1,2。这个协议描述的步骤（1）收获并修复植入前阶段的小鼠胚胎，（2）执行免疫荧光标记的感兴趣的蛋白质，（3）进行整个安装使用共聚焦显微镜用z-切片功能和成像（4）执行共聚焦图像和随后的定量图像分析的核分割。这条管道可以牛逼他无偏蛋白水平的测量小区标识的分配来表征原位细胞亚群。这种协议可以在少至3来进行-第4天为一个单一垫料（通常最多10个小鼠胚胎），从胚胎收集到数据分析（图1B）。几个窝的同时分析会增加成像和数据分析时间负担，从而延长了协议的总长度。

植入前阶段的小鼠胚胎是一个听话的实验系统，其中，由于其体积小，定型形态^3， 在单细胞分辨率的细胞过程TOTO成像非常适合。开展胚胎的统计相关数字的公正，制度层面的分析，自动的，定量分析的管道是可取的。然而，由于内细胞团的囊胚（ICM）的高核密度（ 图1A，2D），传统的图像分割平台不能提供足够的精度，以建立一个自动化或半自动化的工作流程。在另一方面，手动分割准确，还不允许细胞和胚胎的大型队列的处理，也不是适合重复性的，公正的决心小区身份的 - 学习发育阶段时，这是特别重要的地方标记模式表达还没有完全解决的（例如，不表现出跨越人口二进制分布）。我们最近开发并验证了小鼠植入前阶段的胚胎，并为实现高精度的小鼠胚胎干细胞（ES细胞）的量身定制的图像分割方法，同时需要很少的用户输入^4-8。

这里提出的分析管道围绕基于MATLAB的图像分割工具，模块化交互式核分割（分^）4。敏思performs无监督核分割上共焦的Z堆叠的大批量的用户已经建立图片属性的最少数量后，利用图形用户界面（GUI）（表^1）4。这条管道已被证明有效的高通量数据对野生型蛋白表达和细胞定位的产生，处理实验和转基因胚胎和胚胎干细胞^5-7。在本协议中，我们描述的MIN到植入前阶段的胚胎图像分割中的应用。有关胚胎干细胞的敏思性能的例子请参考^4,7。自动核分割步骤显著降低了小区识别处理时的负担，而空间和荧光强度测量允许小区身份的无偏测定和基因表达结构域和细胞位置的三维地图的产生在胚胎（图1C ）。此外，该工作流程的可扩展性使其适用于个别窝的分析，通过实验处理的胚胎，或不同的遗传背景^5,6胚胎的大同伙。敏思是免费提供的http://katlab-tools.org（软件需要MATLAB许可证）。

没有开发迄今方法允许对小鼠植入前胚胎蛋白质表达和细胞定位这样深入的数据的生成。所有的尝试到目前为止在量化这些类型的数据已被限制为手动判定和对于不同人群的细胞数的定量在胚胎（或者完全手动，或软件辅助^）9-19。 （结合敏思软件）这种方法已经被量身定做和鼠标胚胎植入前胚胎干细胞和测试;不过其上具有高的核密度的其它系统的性能，虽然尚未检验，预计是等价的。

Protocol

伦理学声明:所有动物的工作，包括饲养，繁殖和牺牲被批准为纪念斯隆 - 凯特琳癌症中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC），协议＃03-12-017。

1.胚胎收集

注 :所有动物的工作必须已通过机构和地方当局以及符合当地和制度规则。

1. 交配处女雌性小鼠与所需基因型的肥沃螺栓男性。
   注意 :如果设置自然交配，在estral周期的发情期女性选择交配增加对所需日期的机会。如果诱导超数排卵，请参阅²⁰中描述的协议。
2. 检查阴道塞在早晨用钝探针的存在。理想情况下，这样做中午（下午12:00）之前，作为交配塞全天丢失。考虑野应检测阴道塞胚胎天（E）0.5的n个。
3. 所需天和胚胎发育的时间，预热M2或冲洗保持介质（FHM）至RT，或优选37ºC。注意:无论M2或FHM可用于冲洗和处理的胚胎。在不使用时，这些存储介质在4ºC。估计每个子宫利用〜2毫升培养基。
4. 解冻冷冻4％低聚甲醛（PFA）在磷酸盐缓冲盐水（PBS），或准备一些新鲜的溶液。估计500微升每孔4％PFA溶液4孔板。固定在4孔平板的每个孔一窝。注意:可替换地，一个96孔板可用于固定和存储胚胎。如果使用96孔板，使用PFA溶液每孔100μl。
5. 使用明火绘制在尖端的毛细管端拉玻璃巴斯德吸管。
6. ，或者按照当地和制度法规颈椎脱位或CO ₂吸入牺牲女性。它往往desirable。通过颈椎脱位确认动物实施安乐死。
7. 喷动物的腹部用70％乙醇，以尽量减少毛发脱落，并执行一个腹部切口，先通过皮肤，并随后通过体壁（腹膜）以暴露内脏。
   注意 :以下步骤描述该过程在E3.25和E4.5（图1A）之间的任何阶段收集从怀孕母鼠的子宫内囊胚。对于早于E3.25在植入前胚胎采集协议，参考^20。
8. 找到子宫，并从动物中删除。拿着一双镊子的子宫宫颈结束时，切断通过子宫颈拉起轻轻舒展两个子宫角。
9. 从子宫修剪脂肪，注意不要刺破子宫壁。这可以很容易地在去除时间来完成，而仍然附着在动物的身体，由于子宫可以伸出。可替代地，它可在以后完成，解剖显微镜下，在室温PBS中。关于子宫解剖更详细的协议，见协议5 ⁸ 20
10. 输卵管上方切开，卵巢下面，以释放在培养皿整个子宫，地点，并用PBS覆盖。
    注意 :这一步还允许多余的血液或其他碎片的子宫，这有利于后续的囊胚收获洗涤。
11. 分开两个子宫角通过近端切割，在子宫颈的两侧并丢弃子宫颈。通过切割连接它们（图1A）的峡部下面分开子宫每个输卵管。既转移牛角操纵媒体（无论是M2或FHM）的胚胎收集和操作的下降。
12. 在解剖镜下，冲洗出来的囊胚子宫和成迫使0.5介质 - 从子宫颈口1毫升M2或FHM通过每个子宫角。使用1ml注射器带针皮下。注意:针可使用申请石以避免撕裂子宫被减弱，虽然这不是关键的。子宫冲洗的详细图可以^在 21个被发现。
13. 使用解剖显微镜，找到胚泡，这将在散布介质的压降。允许高达1 - 2分钟，囊胚，以冲洗后，沉到培养皿的底部。使用口控制，巴斯德玻璃吸管毛细管结束后，收集所有的囊胚，并转移到媒体的一个新的下降。
14. 3滴新鲜M2或FHM的 - 通过2移动它们冲洗囊胚。同时10囊胚 - 移动在5组胚胎。
    注 :在任何一个时间将加快这一进程，移动较大的群体，但它也将增加意外丢失大量胚胎的机会。如果在使用口控制移液器未经训练，练习操纵胚胎和转让前应B为考虑eginning实验。
15. 在酸性台氏液冲洗简要他们卸下未孵化的囊胚透明带（ZP）（一般
16. 剥蚀搬运囊胚时要小心，因为他们坚持很容易在玻璃和塑料表面。操纵平台包含4毫克/ ml牛血清白蛋白（BSA），以防止附着的，但酸的台罗德氏或PBS不这样做，因此，为了减少损坏或胚胎的损失的风险不拿起超过2 - 5剥蚀胚泡同时在BSA的或无血清PBS或酸性台氏操纵他们的时候。
    注意:可替换地，涂层，在使用前1％BSA的玻璃吸管，以减少玻璃表面的胚胎的粘附。

涂层的每个孔的底部用1％琼脂的薄层的4孔组织培养皿的，0.9％的NaCl，以防止胚附着在塑料。备选地，加入4毫克/毫升BSA的PBS（PBS-BSA）的。

填用500μl室温的PBS（或PBS-BSA）的包衣4孔组织培养皿中的一个孔，另一个在PBS井用500微升4％PFA的。

漂洗在室温的PBS胚泡并在4％PFA固定在PBS中在RT下10分钟。固定后转移到PBS（或PBS-BSA）。

如果胚不会被立即处理，覆盖含有矿物油的一层的胚胎以防止蒸发（导致样品的干燥）和板储存于4ºC的PBS中。
注意:不同的固定方法和时间可以根据不同的实验中使用，所使用的感兴趣的表位和抗体。选择两者的方法中，是一致的整个等效实验以促进染色结果的后续比较。
注:暂停点:胚胎可以继续下一步骤之前保存在4ºC在PBS长达数周。确保PBS是无菌的和/或添加100U /毫升青霉素+ 100微克/毫升链霉素（青霉素 - 链霉素）以防止细菌污染（使用PBS-BSA特别是当）如预期长时间贮存。

2.免疫

1. 使用以前已测试并证明是整个安装免疫稳健任何协议进行免疫。注意:我们建议那些²²和^11所示 。在本文章前者进行说明。选择哪种方法，一致相当于整个实验便于染色结果的比较。
2. 使用灵活，聚乙烯，清晰，U型底96孔板，进行免疫荧光协议的顺序步骤。 50每孔内 - 100微升的解决方案，并通过一个解决方案移动胚到另一个使用一个L形的嘴吸管。注意此方法最大限度地减少了使用的试剂的并且便于追踪步骤以及几个实验组的平行染色。
   1. 可选:涂料孔的底部用1％琼脂的薄层，0.9％的NaCl，以防止胚胎塑料的粘合性。不添加BSA免疫荧光解决方案。
3. 制备的PBX（0.1％的Triton X-100的PBS）。如果预测的几个实验免疫性能，在实验之间4ºC准备50毫升PBX和商店。
4. 制备透溶液（0.5％的Triton X-100，100mM的甘氨酸的PBS）。制成1毫升（或取必要量）的每个实验新鲜通透溶液。
5. 制备封闭液（2％马血清（HS）或20％胎牛血清（FBS）与青霉素 - 链霉素的PBS）。在实验之间4ºC准备10毫升并存储。
   1. 没有差异已经观察之间既血清型，但是，在阻断用于等效实验溶液的选择一致。
6. 冲洗胚胎固定在RT在PBX 5分钟（约100微升）。
7. 通透胚胎在RT中透化溶液5分钟（约100微升）。
8. 冲洗胚胎在RT在PBX 5分钟（约100微升）。
9. 块的胚胎进行30分钟至1小时在RT在〜100μl的阻断溶液。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
   注:胚胎可以被封锁长达O / 4ºC没有明显的改善或损害N个周期相比，30分钟封锁措施的时候。
10. 孵育胚胎O / N在第一抗体4ºC/稀释在封闭溶液（〜100微升）的抗体。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
    1. 确定每个事先初级抗体最佳稀释。见教对于一些抗体的测试稀释物藏密坛城艺术和材料部分。
11. O / N孵育后，冲洗3倍的胚胎中每个PBX 5分钟在室温（约100微升）。
12. 块的胚胎进行30分钟至1小时在RT在〜100μl的阻断溶液。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
13. 孵化的胚胎进行1至2小时在二级抗体/抗体4ºC在〜100μl的阻断溶液4微克/毫升稀释。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
14. 冲洗胚胎PBX 2倍，每次5分钟在室温。
15. 将胚胎首选DNA染色。如果使用赫斯特33342，稀释到PBS 5微克/毫升。覆盖矿物油的一个层，以防止蒸发或保持在湿润的腔室中的溶液。
    注:暂停点:如果胚胎没有被立即成像，它们可以保持在Vp来在核染色液几个星期。在这种情况下，确保PBS是无菌的和/或添加青霉素 - 链霉素或叠氮化钠，以防止细菌的生长和污染。

3.共焦成像

注意:单个共焦显微镜的配置将需要特定的采集参数进行调整以代替系统和软件。但是，下面的部分提供了一组一般的规律可循，应该是适用于任何给定的安装。

1. 用细口移液管，使PBS或一个35mm的玻璃底皿的玻璃表面上核染色液的微滴并用矿物油覆盖。作为替代，使用常规的盖玻片用硅分离，以避免损坏胚胎和用显微镜载玻片覆盖。注意:当使用常规盖玻片，胚胎不能被随后重新定位或回收用于基因分型，因此我们强烈建议使用玻璃底的菜肴。
2. 地方的胚胎在微滴和安排以一致的方式，最好是用平行于该玻璃表面的ICM腔轴。建立在显微镜持有人的菜。注意:激光扫描共聚焦显微镜获得的图像从荧光强度的Z轴相关的损耗受到影响。因此，在该排列的一致性是在不同的胚胎比较等效区域之间的强度非常重要。
3. 设置使用野生型胚胎没有受到任何形式的治疗，可能会改变基因表达的参考参数。
   1. 为了获得将促进使用MINS ^工具 4精确分割数据获取使用高放大倍数的物镜（即40X或更高）的图像。
      注意:20倍的目标使用数码变焦将不会产生使用敏思进行分割足够的分辨率的图像。人们还应该注意客观的工作距离（WD），因为它应该是足以让收购Z堆栈跨越整个囊胚，从而长WD的（〜130 - 150微米）的目标通常是必要的。 在图2中所示的图像 - 4用一个40X / NA 1.30油浸物镜为210微米的工作距离获得。
   2. 使用最低激光输出，提供了一个强有力的信噪比无白化荧光团。
   3. 调节增益和偏移，以获得最宽的动态范围，而不过度曝光的样品。揭露图像覆盖大部分，或者跨越整个，灰阶范围将有利于在图像之间亮度的微小差异的检测。
   4. 使用小的（1微米）的Z-步骤中，由于Z轴分辨率是用于与MINS精确分割关键的。
      注意:XY尺寸不影响核分割过程中，只有图像文件的大小。一般情况下，512 x 512像素是足够的XY分辨率出版质量的图像，而无需compromi唱的硬盘空间。
   5. 关键的步骤:保持成像内和在相同实验的成像会议一致参数，以便可以比较样品。
4. 胚胎成像批次:
   1. 在一个会话图像连贯组（窝，实验）只要有可能。
   2. 为保持相同的实验重复的内部和整个成像会议一致参数。
   3. 图像的胚胎在整个（全Z轴）捕捉到每一个细胞。
      注意:如果需要，胚胎基因分型可以在成像之后如在^23中所述进行。需要对巢式PCR，必须凭经验确定，并且将取决于待分析的基因座，并使用的引物。
5. 确保能够追溯匹配胚胎图像。

4.图像分析和数据预处理

1. 下载并从http安装敏思^4://卡特拉b-tools.org（需要MATLAB许可证）。
2. 执行图像分割:
   1. 遵循MINS的图形用户界面（GUI）来加载一个共焦图象或从硬盘驱动器堆栈，检测细胞核和分割图像。装载由显微镜（.lsm，.lif，.oif 等 ）生成的原始数据的整个Z堆叠。 见表 2上http://katlab-tools.org和⁴发现每一步的细节和说明。一旦完成，通过点击相应的"查看"按钮，查看每个步骤的结果。按钮上方的黄色标签表示在操作过程中，一个绿色的标签指示操作完成。
      注:敏思目前不支持.czi文件，.TIFF序列或多个位置的文件 - 每个Z堆叠需要有一个独立的文件。
   2. 令人满意的分割后，保存创建的，因此它可以直接用于其它胚或窝管道。
3. 批处理模式分割:
   注:思ngle文件可以单独地被分段。然而，由于垫料或实验中的胚胎一般人可比的阶段是，敏思可以申请一个图像创建分割管道一组人没有监督。
   1. 从批处理模式下运行菜单上，单击"添加文件"，并载入所有文件，以在一次处理。注意:从不同的源文件可以被添加到分割的队列。
   2. 点击"开始批处理模式下运行"，并留出时间让软件处理的文件。注:分割输出将被保存在原始文件中，位于相同的目录。
4. 分割评估和手动校正
   注意:MINS段以非常高的精确度（> 85％）的图像，然而，染色和成像的质量，以及胚胎的阶段，可能会影响MINS性能。一般地，胚胎内越高核密度，就越有可能分割误差将采取PLACE（ 图2D，3）。因此，分割精度应该对每个样品进行评估，并根据需要手动校正。两种类型的错误通常会发生:过分割和欠分割。
   1. 解决过分割:
      1. 识别误报-凋亡小泡（图3A 一个，B，D，星号 ），或其它元素是不完整的细胞核，但是它可能已经由MINS认定。
         注:通常，这样的误报比真正的细胞核大小小，并且能在大多数情况下，很容易识别和分类在电子表格上。然而，强烈建议目视检查，因为时常晶核可以仅部分地分段的，导致更小的，但有效的分段体积（图3A B，箭头）。
      2. 删除从* statistics.csv文件误报相应的记录。保留原*统计.csv文件后，以供将来参考和编辑仅是它的复制品。
      3. 如果一个原子核被过度分割和表现为2个或更多核（ 图3A C，箭头，箭头），要么通过平均它们的强度级别或合并的记录，如果类似，保持的记录一个用于细胞和丢弃休息。
   2. 在分割解析:
      1. 查明敏思无法检测到两个或更多核之间的边界，因此它们分割为单核事件（ 图3A D，箭头和3B）。注意:此产生了一个问题进行准确细胞计数，但更重要的是，用于定量蛋白质水平，作为测量的水平将是已经错误地合并了细胞的平均值，并且其可以属于不同的谱系。
      2. 查明敏思未能完全检测核事件。
      3. 在这些情况下（4.4.2.1和4.4.2.2），测量平均灰度级˚F或在不足或未分段单元（S），每个信道使用一个替代的工具，如ImageJ的（http://imagej.nih.gov/ij/），并用正确的电平替换错误记录。保留以备将来参考原来的* statistics.csv文件，仅编辑它的一个副本。要做到这一点使用ImageJ，请按照下列步骤操作:
         1. 打开ImageJ的相关的多通道堆栈并导入由敏思生成一个虚拟栈（"文件">"导入">"TIFF虚拟堆叠...'）对应的* overlaid.tiff文件。
         2. 查找不足或未分段核的中间部分。
         3. 使用写意选择工具勾勒出的DNA染色通道不足或未分段核的外围。
         4. 按CRL + M（Cmd的+ M在Macintosh），或去分析菜单，选择"措施"。这一行动将记录列出的区域平均灰度值并显示它在一个新的窗口。转到"分析">9;设置测量......"，并确保"平均灰度值'被选中。选择任何其它的参数进行测量。
         5. 使用在步骤4.4.2.3.3中概述的相同的区域中，重复测量的每个感兴趣的荧光通道。结果将被追加到测量"结果"窗口中的前一个。
         6. 使用获得的测量在* statistics.csv文件替换错误的记录。如果核没有被分割，插入新行，指定一个新的小区ID，并介绍每个通道对应列下的ImageJ获得的值。这个单元将不具有空间坐标（X，Y和Z值）。如果核已经undersegmented，复制它的行，分配不同的小区ID的每一个新的细胞，并推出相应的列下的ImageJ获得的值。在这种情况下，两个单元将共享空间坐标。
            注意:如果空间分布是待分析，我们recommend不含XYZ坐标这些细胞，因为它们将重叠。为此，创建新的记录时，分配小区ID对他们易于从原有的区分（例如，非整数）。
   3. 分数分裂的细胞。注意:MINS检测有丝分裂以及间期核，但他们不能区分。
      1. 如果有丝分裂核是要在分析分开考虑，手动得分这些和这个信息添加到数据文件中。要记录的有丝分裂细胞中，新的变量（列）添加到* statistics.csv数据文件，并分配不同的值有丝分裂和间期核。
5. 数据预加工。
   注意:一旦电子表格已经纠正过冲和下分割他们准备进行分析。分析过程和数据显示将取决于具体的实验。不过，下面是一些一般的数据转换我们建议在分析之前执行:
   1. 变换的荧光强度值到其对数或平方根来减少数据的散布。这也有助于可视化，作为原料的数据倾向于集中情节的轴附近（参见图4B，C）。
   2. 校正荧光的Z相关联的衰减:
      注意:激光扫描共聚焦显微镜图像的荧光强度降低在Z更深轴切片的位置（ 图4E，F）。
      1. 如果在样品中检测到的表位中的一个是普遍存在的，均匀表达管家核标记物，通过用持家标记的相应值除以它们的值在每个单元归一化的其他表位的荧光强度。
      2. 在不存在这样的参考标记，补偿以下列方式荧光的Z-相关损失:
         1. 绘制每个标记的值（Y图中）在Z位置（图的X轴）的轴在可视化中的Z强度的下降-积在一起的所有控制，野生型胚胎（图4F）的值。
         2. 适合的线性模型（回归曲线），以在先前步骤中获得的（强度超过Z值）为每个标记（ 图4F）的曲线图。
         3. 校正使用下列公式每个标记的所有值:
            日志（原值）+ Z *模型（图4D，G）的 ​​斜率。
            注意:特定步骤来执行这种校正将取决于所用（R，MATLAB， 等）的分析软件。如果使用的R，运行下面的公式，以适应一个线性模型的数据:
            > LM（日志（通道）〜Z，数据=数据帧）
            式中， 信道是要校正的荧光通道中 ，Z为Z坐标和数据帧是包含用于所需胚胎（多个）（在*统计所有值表istics.csv由MINS或它的变形生成的文件）。
            注意:上述式的输出将具有以下格式:
            （拦截）z
            4.76373 -0.01947
            式中，值Z是回归线对于该数据集，其绝对值应该用于修改与在4.5.2.2.3给出的公式的原始值（见图4G的例子）的斜率。

Results

为了便于数据解释和介绍，应注意不要收集和操作过程中损坏的胚胎，使所有的细胞和它们的相对位置可分析图2A - D示出了在具有扩展腔的不同阶段的完整胚泡的例子。如果出现损坏，格外小心，应注意分析和解释结果时。

使用该协议生成的数据的质量和可靠性依赖于固定的质量和用于检测所关注的蛋白质的抗体的信噪比。总是用新鲜固定液和测试新的抗体，以适当的阳性和阴性对照，在开始一组实验之前， 图2A示出良好的抗体的例子为一些核蛋白质。 图2B示出为例为细胞质蛋白（DAB2）良好的抗体即图2C示出一个坏染色，具有低信噪比，其中所述样品固定为仅10分钟的一个例子。在这种情况下，用于GATA4的抗体（Santa Cruz，SC-1237）需要O / N固定提供了有力的信号（见²⁴固定O / N和沾有这种抗体胚胎的情况下）。后...

Discussion

本协议描述在植入前阶段的小鼠胚胎进行全挂载免疫荧光定量分析的方法。一个强大的免疫协议²²后跟高分辨率，整个安装使用定制的软件⁴聚焦成像和图像分割。而免疫协议的选择不是关键，我们发现这里呈现²²是快速，可靠，并为许多我们已经测试了抗体的提供可靠的信号之一。其它协议可遵循，条件是它们的应用是在整个等效实验一致。虽然许多因素会影响每个单独的实验的实验之间的结果，并直接比较不一定可能的，我们已经发现，在重复追求一致性和执行足够技术重复大大降低可变性。因此，一旦进行了优化，固定和immunolabelin克试剂和方案，以及摄像条件应保持等效实验之间恒定。

1）质量差染色，以暗信号，以及2）不理想的分割，具有很多错误（即，过冲和下分割）:这协议秋季的应用过程中可能出现成两组的主要问题。低质量免疫通常是由于样品的定影不当或不适合于整个安装免疫的抗体。确保PFA是新鲜的（无论是新鲜制备或者从-20ºC解冻RT不超过前一个星期）。由于植入前胚胎的体积小，10分钟内固定PFA应该足够了。然而，我们已经发现某些抗体具有...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
<强>胚胎收集
插头检查的钝探针	Roboz	RS-9580
镊子	Roboz	RS-4978
手术剪刀	Roboz	RS-5910
玻璃巴斯德移液器	Fisher	13-678-20C
预装吸气管和口器	Sigma	A5177
更长的橡胶管	Fisher	14-178-2AA
M2	Millipore	MR-015-D
FHM	Millipore	MR-024-D
酸性酪蛋白溶液	Millipore	MR-004-D
青霉素/链霉素	Gibco	15140
牛血清白蛋白	Sigma	A9647
4 孔板	Nunc/Thermo-Fisher	12-566-300
<强>免疫荧光
96 孔 U 型底板	Fisher	14-245-73
Triton X-100	Sigma	T8787
甘氨酸		Sigma G7403
马血清	Sigma	H0146
<强>一抗			<强>浓度
CDX2	Biogenex	AM392-5M	1：200
GATA6	R&D	AF1700	1：100
GATA4	Santa Cruz	sc-9053	1：100,10 分钟固定
GATA4	Santa Cruz	sc-1237	1：100，O/N 固定
SOX17	R&D	AF1924	1：100
Nanog	ReproCELL	RCAB0002P-F	1：500
OCT4	Santa Cruz	sc-5279	1：100,10 分钟至 O/N 固定
DAB2	BD	BD BD-610464	1：200
二抗	Life Technologies	各种	1：500
Hoechst 33342	Life Technologies	H3570
成像
35 mm 玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C
Segmentation
运行 64 位 Windows作系统		的计算机 n/a	验证 http://katlab-tools.org 的最低系统要求，Lou et al.， （2014） Stem Cell Reports
MATLAB （软件）	Mathworks	n/a
MINS （软件）	免费	n/a	http://katlab-tools.org