胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

摘要

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。

摘要

我们实验室最近证明，如果恶性胶质瘤细胞的β-半乳糖苷结合凝集素galectin-1（gal-1）表达缺失，则自然杀伤（NK）细胞能够在颅内移植后迅速清除原位植入的小鼠GL26和大鼠CNS-1恶性胶质瘤。最近的研究进一步表明，Gr-1⁺/CD11b⁺ 髓系细胞亚群在这一效应中起关键作用。为了更深入地理解NK细胞与髓系细胞协同介导gal-1缺失型肿瘤排斥反应的机制，我们建立了一套完整的方案，用于分离和分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞（PBMC）。本方法通过比较PBMC在表达gal-1的GL26胶质瘤与通过shRNA敲低实现gal-1缺失的GL26胶质瘤肿瘤微环境中的浸润情况加以演示。该方案首先描述了 如何培养并制备GL26细胞，以便接种至同系C57BL/6J小鼠脑内。随后详细说明了从早期脑肿瘤微环境中分离胶质瘤浸润PBMC并进行流式细胞术分析的具体步骤。该方法可适用于多种需要获取脑内免疫细胞浸润时间动态数据的体内实验设计。本方法具有高灵敏度和高度可重复性，可在肿瘤移植后24小时即从颅内肿瘤中分离出胶质瘤浸润的PBMC，并且在独立实验中不同时间点匹配的肿瘤样本间可观察到相似的细胞数量。单个实验人员从脑组织采集到完成胶质瘤浸润PBMC的流式细胞术分析，大约需要4–6小时，具体时间取决于待分析样本的数量。实验人员也可根据需要选用其他胶质瘤模型和/或细胞特异性检测抗体，以评估其他多种感兴趣免疫细胞类型的浸润情况，而无需对整体操作流程进行修改。

引言

胶质瘤是一类起源于中枢神经系统（CNS）内转化胶质细胞的神经上皮性脑癌。在所有胶质瘤中，世界卫生组织（WHO）4级胶质瘤，即胶质母细胞瘤（GBM），是最常见且致死性最高的类型¹。GBM对目前的标准治疗方案高度耐受，该方案包括尽可能地进行肿瘤切除，随后辅以放疗以及同步和辅助的替莫唑胺化疗²。这类致命性肿瘤的预后极差，从初次诊断起中位生存期仅为15至18个月，仅有5%的患者在5年后仍能存活³。

血脑屏障（BBB）的存在、缺乏专业的抗原呈递细胞（APCs），以及此前未被确认的大脑内真正淋巴结构的存在⁴，曾导致人们认为胶质母细胞瘤（GBM）具有免疫豁免特性。然而，大量研究表明，这类脑肿瘤实际上会招募主要来源于髓系的外周免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）⁵。GBM还会促使脑内常驻的小胶质细胞转变为促进肿瘤发生的表型^6,7。淋巴细胞如CD8⁺ T细胞⁸和CD56⁺ natural killer 细胞⁹也存在于肿瘤微环境中，但数量较少，这被认为是由胶质瘤来源因子诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）产生免疫抑制功能所致¹⁰。CD4⁺ T细胞在GBM中同样存在，但其中大部分还表达CD25和F....

方案

注意：请在进行实验前通读整个实验方案。在开展实验前，必须获得相关机构动物使用与福利委员会对脊椎动物实验使用的批准。

1. 颅内移植肿瘤细胞的制备

1. 在II级生物安全柜中操作，首先通过向500 ml培养基中添加补充成分来配制GL26-Cit-NT/gal1i细胞培养液 含10% 经无菌过滤、热灭活的胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）一瓶 青霉素，100 µg/ml 链霉素，600 µg/ml G418硫酸盐（用于筛选mCitrine表达载体）和3 µg/ml 嘌呤霉素二盐酸盐（用于筛选非靶向或特异性靶向gal-1的shRNA）
2. 培养 GL26-Cit-NT 和/或 GL26-Cit-gal1i 细胞（图1A 以及 1B) 在设定为 37 ℃ 的组织培养柜中 °C 和 5% CO₂ 在肿瘤移植手术前1-2天，或直至培养瓶中的细胞达到50-80%汇合度。
3. 手术当天，使用10 ml移液管从胶质瘤细胞中移除细胞培养基 移液管和移液枪，并将培养基弃入废液杯中。
   1. 将培养瓶倒置，并加入10 ml 使用10 ml DPBS加入培养瓶的上部....

结果

典型的实验采用以下设门策略：FSC-A 对 SSC-A → SSC-H 对 SSC-W → FSC-H 对 FSC-W → CD45 对 count → Gr-1 对 CD11b → NK1.1 对 count。在 Gr-1⁺/CD11b⁺ 髓系细胞和 NK1.1⁺ NK 细胞上设门后，进一步根据 GzmB 的表达情况进行分层分析 （图 5A）。将实验中鉴定为 NK1.1⁺ NK 细胞和 Gr-1⁺/CD11b⁺ 髓系细胞的群体回设至 FSC-A 对 SSC-A 图中，可证实 NK 细胞具有较小的淋巴细胞形态，而髓系细胞则相对较大 （图 5B）。原始数据文件（即，fcs 文件）可使用商业化的流式细胞术数据分析软件（如 Flowjo）进行分析。

共使用18只C57BL/6J小鼠来演示该方法。其中9只小鼠接种了GL26-Cit-NT细胞，另外9只小鼠在同一天接种了等量细胞.......

讨论

本方案描述了一种稳定且可重复的方法，用于分离和通过流式细胞术分析浸润早期小鼠脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞（PBMCs）。实验人员将胶质瘤细胞悬液配制至特定浓度后，通过立体定位法将其移植至小鼠脑纹状体。随后，根据实验设计预设的时间点对小鼠实施安乐死，取出其脑组织并进行处理，以分离出浸润胶质瘤的PBMCs，并使用多种荧光染料标记的一抗对其进行免疫标记；之后通过流式细胞术对免疫标记的细胞进行定量分析。尽管本文演示的重点是早期时间点，但可在肿瘤移植后任意时间点（直至小鼠濒死前）对浸润胶质瘤的PBMCs进行评估。该方法具有高度模块化特点，可使用任意数量的不同抗体组合来检测感兴趣的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。需注意，本方案已针对8至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行了优化。超出此年龄范围的小鼠其循环PBMCs的比例可能发生变化，从而导致在相同时间点的细胞计数与本文所展示的数据不具代表性。若使用其他肿瘤模型或非B6遗传背景的小鼠，可能需要额外进行表征实验，因为不同品系的PBMC谱可能存在差异（Jaxpheno6；小鼠表型数据库；杰克逊实验室）。性别和环境条件也可能导致PBMC频率和比例的差异。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’s 修改的伊格尔培养基	Gibco	12430-054	含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES 和酚红
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液	Gibco	14190-144	不含氯化钙或氯化镁
胎牛血清	Omega Scientific Inc.	FB-11
青霉素-链霉素	Gibco	15140-122	10,000 U/ml 青霉素；10,000 μg/ml 链霉素
L-谷氨酰胺	Gibco	25030-081	200 mM
G418硫酸盐	Omega Scientific Inc.	GN-04
嘌呤霉素二盐酸盐	Sigma-Aldrich	P8833	来自 Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase 非哺乳动物胰蛋白酶替代液	赛默飞世尔科技	SV30030.01	在含EDTA的DPBS中
相差显微镜血细胞计数板	Sigma-Aldrich	Z359629	0.1 mm 深
台盼蓝染色	Gibco	15250-061
无菌0.9%氯化钠注射液，USP	Hospira	NDC：0409-4888	10 ml 小瓶
0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管	Genesee Scientific	22-272
盐酸阿替美唑注射液	Orion Pharma	NDC：52483-6298	5 mg/ml 溶液
盐酸氯胺酮注射液	福特·多德	NDC：0409-2051	100 mg/ml 溶液
盐酸右美托咪定注射液	硕腾	NDC：54771-2805	0.5 mg/ml 溶液
盐酸赛拉嗪注射液	劳埃德	NDC：61311-481	100 mg/ml 溶液
卡洛芬注射液	辉瑞	NDC：61106-8501	50 mg/ml 溶液
盐酸丁丙诺啡注射液	Reckitt Benckiser	NDC：12496-0757	0.3 mg/ml 安瓿瓶
1 ml 结核菌素注射器	Covidien	8881501400
26G x ½ (0.45 mm × 13 mm) 注射器针头	BD	305111
手术剪	3M	9661
聚维酮碘溶液	Aplicare	82-217	NDC：52380-1905
无菌凡士林眼膏	Dechra	NDC：17033-211
70% 异丙醇消毒垫	肯德尔	6818
无菌纱布	Covidien	8044	无纺布，4" × 4"，4层
1.7 ml 锥形聚丙烯微量离心管	Genesee Scientific	22-281
小鼠立体定位仪	斯托尔廷	51730
手术灯	Philips Burton	CS316W	Coolspot II 可调光斑照明系统
弯头解剖镊	Ted Pella 公司	5431
科利布里拉钩	FST	17000-03
无线精密电钻	Dremel	1100-01	触控笔型号；7.2伏锂离子电池，带底座充电站
雕刻刀	Dremel	105	1/32" 或0.8 mm钻头直径
微量注射器	Hamilton	75	Hamilton 微量注射器 700 系列；5 μl 体积
微升注射器针头	Hamilton	7762-06	33G，小鲁尔接头RN针头，1.5英寸，3型针尖，6支/包
Ethilon 3-0 黑色单丝尼龙缝线	Ethicon	1663
磁力搅拌子	VWR	74950-296	7.9 毫米直径 × 50 毫米长度（5/16）" 直径 × 2" 长度
1 L 玻璃螺口储存瓶	康宁	1395	1型A级硼硅酸盐玻璃
肝素钠	Sagent	NDC：25021-400	1,000 U/ml 溶液
蠕动泵	Cole Parmer仪器集团	77200-60	Master Flex Easy Load II 控制台驱动器
压缩碳合气（95% O₂，5% CO₂）2 / 5% CO₂2)	可从本地供应商处获取	N/A	A型大圆柱
20 G × 1 ½" 铝制针座钝头针	肯德尔	8881202363	0.9 mm x 38.1 mm
聚氨酯冰桶	Fisherbrand	02-591-45	容量：0.152 盎司（4.5 L）
胶原酶（I-S型）	Sigma Aldrich	C1639	来自艰难梭菌（Clostridium histolyticum）
脱氧核糖核酸酶 I	沃辛顿生化公司	LS002007	>每毫克干重2,000 Kunitz单位
抗静电聚苯乙烯六角称量皿	Ted Pella 公司	20157-3	顶部内径 115 mm，底部内径 85 mm，容积 203 ml
不锈钢单刃剃须刀片	加维	40475
骨剪	FST	16001-15
止血钳	FST	13014-14
大型解剖剪	Ted Pella 公司	1316
小型解剖剪	FST	14094-11
钝端镊子	Ted Pella 公司	13250
7 ml 玻璃Dounce组织研磨器	Kontes	KT885300-0007
Percoll 密度梯度离心介质	GE Healthcare	GE17-0891-01
10 ml 血清移液管	Genesee Scientific	12-104	一次性使用；无菌
70 μm 无菌尼龙筛网细胞过滤器	Fisherbrand	22363548
Alexa Fluor 700 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体（克隆号：30-F11）	Biolegend	103128
APC标记的小鼠抗小鼠NK1.1（克隆：PK136）	eBiosciences	17-5941-82
PE标记的抗小鼠Gr-1大鼠单克隆抗体（克隆号：RB6-8C5）	BD Pharmigen	553128
PerCP/Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 CD11b 抗体（克隆号：M1/70）	Biolegend	101228
Alexa Fluor 700 标记的大鼠 IgG2b κ （克隆：RTK4530）同型对照	Biolegend	400628
APC标记的小鼠IgG2a κ （克隆：eBM2a）同型对照	eBioscience	17-4724
PE标记的鼠IgG2b κ （克隆：eB149/10H5）同型对照	eBioscience	12-4031-82
PerCP/Cy5.5 标记的大鼠 IgG2b κ （克隆：RTK4530）同型对照	Biolegend	400632
太平洋蓝染料标记的小鼠抗小鼠颗粒酶B抗体（克隆：GB11）	Biolegend	515403
太平洋蓝染料标记的小鼠 IgG1 κ （克隆：MOPC-21）同型对照	Biolegend	400151
Cytofix/Cytoperm	BD	554714
15 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-103	锥形底部
50 ml 聚丙烯离心管	Genesee Scientific	21-108	锥形底部
12 mm x 75 mm 圆底聚丙烯FACS管	Fisherbrand	14-956-1B
FACSAria 特殊订单研究产品 流式细胞仪/细胞分选仪	BD	650033
II级生物安全柜	The Baker Company	SG603	型号：SterilGARD III Advance