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胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离与流式细胞术分析

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DOI：

10.3791/53676

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2015年11月28日

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1Department of Neurosurgery, University of Michigan, 2Department of Cell and Developmental Biology, University of Michigan

本文内容

摘要

本文介绍了一种简单的方法，用于分离和流式细胞术分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞，该方法可获得随时间变化的定量数据，反映进入早期脑肿瘤微环境的免疫细胞数量及其活化状态。

摘要

我们实验室最近证明，如果恶性胶质瘤细胞的β-半乳糖苷结合凝集素galectin-1（gal-1）表达缺失，则自然杀伤（NK）细胞能够在颅内移植后迅速清除原位植入的小鼠GL26和大鼠CNS-1恶性胶质瘤。最近的研究进一步表明，Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞亚群在这一效应中起关键作用。为了更深入地理解NK细胞与髓系细胞协同介导gal-1缺失型肿瘤排斥反应的机制，我们建立了一套完整的方案，用于分离和分析胶质瘤浸润的外周血单个核细胞（PBMC）。本方法通过比较PBMC在表达gal-1的GL26胶质瘤与通过shRNA敲低实现gal-1缺失的GL26胶质瘤肿瘤微环境中的浸润情况加以演示。该方案首先描述了 如何培养并制备GL26细胞，以便接种至同系C57BL/6J小鼠脑内。随后详细说明了从早期脑肿瘤微环境中分离胶质瘤浸润PBMC并进行流式细胞术分析的具体步骤。该方法可适用于多种需要获取脑内免疫细胞浸润时间动态数据的体内实验设计。本方法具有高灵敏度和高度可重复性，可在肿瘤移植后24小时即从颅内肿瘤中分离出胶质瘤浸润的PBMC，并且在独立实验中不同时间点匹配的肿瘤样本间可观察到相似的细胞数量。单个实验人员从脑组织采集到完成胶质瘤浸润PBMC的流式细胞术分析，大约需要4–6小时，具体时间取决于待分析样本的数量。实验人员也可根据需要选用其他胶质瘤模型和/或细胞特异性检测抗体，以评估其他多种感兴趣免疫细胞类型的浸润情况，而无需对整体操作流程进行修改。

引言

胶质瘤是一类起源于中枢神经系统（CNS）内转化胶质细胞的神经上皮性脑癌。在所有胶质瘤中，世界卫生组织（WHO）4级胶质瘤，即胶质母细胞瘤（GBM），是最常见且致死性最高的类型1。GBM对目前的标准治疗方案高度耐受，该方案包括尽可能地进行肿瘤切除，随后辅以放疗以及同步和辅助的替莫唑胺化疗2。这类致命性肿瘤的预后极差，从初次诊断起中位生存期仅为15至18个月，仅有5%的患者在5年后仍能存活3。

血脑屏障（BBB）的存在、缺乏专业的抗原呈递细胞（APCs），以及此前未被确认的大脑内真正淋巴结构的存在4，曾导致人们认为胶质母细胞瘤（GBM）具有免疫豁免特性。然而，大量研究表明，这类脑肿瘤实际上会招募主要来源于髓系的外周免疫细胞，包括单核细胞、巨噬细胞和髓源性抑制细胞（MDSCs）5。GBM还会促使脑内常驻的小胶质细胞转变为促进肿瘤发生的表型6,7。淋巴细胞如CD8+ T细胞8和CD56+ natural killer 细胞9也存在于肿瘤微环境中，但数量较少，这被认为是由胶质瘤来源因子诱导肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）产生免疫抑制功能所致10。CD4+ T细胞在GBM中同样存在，但其中大部分还表达CD25和FoxP3，这是具有免疫抑制功能的调节性T（Treg）细胞的标志物11。GBM整体所呈现的免疫抑制状态最终导致免疫逃逸和肿瘤进展12。

深入了解胶质母细胞瘤（GBM）免疫抑制的机制，对于开发旨在激活免疫系统以对抗肿瘤的有效免疫治疗策略至关重要。在过去的15年中，我们的实验室一直致力于克服脑肿瘤免疫抑制的机制，以开发出有效的新型抗GBM免疫治疗药物13-19。这项工作的最终成果现已推动了一项临床试验的开展，旨在评估一种联合使用细胞毒性与免疫刺激疗法对新诊断GBM患者的效果（ClinicalTrials.gov标识符：NCT01811992）。

我们最近的研究表明，小鼠GL26和大鼠CNS-1胶质母细胞瘤（GBM）细胞通过大量产生β-半乳糖苷结合凝集素galectin-1（gal-1）来阻断抗肿瘤的自然杀伤（NK）细胞免疫监视作用20。该结论通过使用shRNA介导的基因敲低技术抑制胶质瘤细胞中gal-1的表达得以证实。体外实验显示，gal-1缺陷型胶质瘤细胞在培养中增殖正常，但在移植到同系C57BL/6J或RAG1-/-小鼠颅内后迅速被排斥，从而证明此类肿瘤排斥作用不依赖于T细胞或B细胞。使用抗去唾液酸GM1抗血清或单克隆NK1.1抗体对NK细胞进行免疫耗竭后，颅内gal-1缺陷型胶质瘤的生长完全恢复，进一步确立了NK细胞在gal-1缺陷型胶质瘤排斥中的关键作用。我们现在发现，即使存在NK细胞，对Gr-1+/CD11b+髓系细胞进行免疫耗竭也足以阻止gal-1缺陷型胶质瘤的排斥反应，揭示了髓系细胞在辅助NK细胞介导的gal-1缺陷型肿瘤溶解中具有不可或缺的辅助作用（未发表数据）。这一意外发现促使我们开发了一套全面的实验方案，用于分离和分析在颅内移植后早期浸润至脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞（PBMCs），以便更深入地表征决定gal-1缺陷型胶质瘤排斥的免疫细胞浸润事件。

本方法以稳定表达mCitrine荧光蛋白的小鼠GL26胶质瘤细胞（称为GL26-Cit）为例进行演示，该细胞系可通过荧光显微镜直接观察肿瘤细胞21将这些细胞通过立体定位法移植到同系C57BL/6J小鼠脑内，允许其生长24、48或72小时后对小鼠实施安乐死。随后分离胶质瘤浸润的外周血单个核细胞（PBMCs），并使用抗-CD45、-Gr-1、-CD11b和-NK1.1细胞表面抗体进行免疫标记，同时结合颗粒酶B（GzmB）的细胞内免疫标记。该特异性抗体组合可用于鉴定肿瘤浸润的Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞和NK1.1+，NK细胞，我们研究的细胞类型 已发现与半乳糖凝集素-1（gal-1）缺陷型肿瘤排斥反应相关。随后，将gal-1缺陷型GL26-Cit胶质瘤（本文称为GL26-Cit-gal1i）的免疫浸润特征与表达正常水平gal-1的胶质瘤（称为GL26-Cit-NT，含有非靶向对照shRNA发夹结构）进行比较。本实验方案首先描述了GL26-Cit胶质瘤细胞的培养方法 体外，随后详细说明如何将这些细胞正位移植到同基因型C57BL/6J小鼠的纹状体中。接着列举了分离及免疫标记胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMCs）以进行流式细胞术分析的各个步骤。该实验方案最后阐述了标准的数据分析方法及图形化表示方式。

该实验表明，在肿瘤植入后48小时内，Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞和NK1.1+ 自然杀伤细胞优先在半乳糖凝集素-1（gal-1）缺陷型脑肿瘤微环境中聚集，这一结果有助于解释为何这些肿瘤在移植约1周后会迅速发生完全溶解20。该方法可轻松适用于多种需要获取免疫细胞随时间动态浸润脑组织数据的体内实验设计。单名实验人员从脑组织采集到对胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMCs）进行流式细胞术分析，大约需要4–6小时，具体时间取决于待分析样本的数量。该方法还可与旨在表征荷瘤小鼠循环PBMCs特征的实验相结合，以便与浸润至脑组织的细胞进行比较，从而识别出肿瘤微环境特异性诱导的免疫抑制表型。此类方法及其类似技术的应用将有助于更深入地理解外周免疫细胞向脑肿瘤微环境迁移过程中所涉及的关键因素。

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方案

注意：请在进行实验前通读整个实验方案。在开展实验前，必须获得相关机构动物使用与福利委员会对脊椎动物实验使用的批准。

1. 颅内移植肿瘤细胞的制备

  1. 在II级生物安全柜中操作，首先通过向500 ml培养基中添加补充成分来配制GL26-Cit-NT/gal1i细胞培养液 含10% 经无菌过滤、热灭活的胎牛血清（FBS）、2 mM L-谷氨酰胺、100 U/ml 青霉素的杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）一瓶 青霉素，100 µg/ml 链霉素，600 µg/ml G418硫酸盐（用于筛选mCitrine表达载体）和3 µg/ml 嘌呤霉素二盐酸盐（用于筛选非靶向或特异性靶向gal-1的shRNA）
  2. 培养 GL26-Cit-NT 和/或 GL26-Cit-gal1i 细胞（图1A 以及 1B) 在设定为 37 ℃ 的组织培养柜中 °C 和 5% CO2 在肿瘤移植手术前1-2天，或直至培养瓶中的细胞达到50-80%汇合度。
  3. 手术当天，使用10 ml移液管从胶质瘤细胞中移除细胞培养基 移液管和移液枪，并将培养基弃入废液杯中。
    1. 将培养瓶倒置，并加入10 ml 使用10 ml DPBS加入培养瓶的上部 血清移液管。缓慢翻转培养瓶，使DPBS覆盖细胞，然后将培养瓶竖直，将DPBS倒入废液缸中弃去。
  4. 加入 3-4 ml 向每个T75组织培养瓶中加入含EDTA的DPBS中的非哺乳动物胰蛋白酶替代物（详见材料列表），然后放回组织培养柜中孵育2-5分钟。使用明场显微镜观察，确认所有细胞均已从底部表面脱落后再进行后续操作。
  5. 通过将替代胰蛋白酶与6 ml液体混合以稀释，从而抑制进一步的酶活性 的DPBS中。使用10 ml移液器上下吹打 用移液管冲洗培养瓶底部表面，并机械解离任何细胞团块。吸取细胞悬液并转移至相应标记的15 ml离心管中 离心管。在 4℃ 下以 550 × g（最大相对离心力）离心 5 分钟，使细胞沉淀。 °C图1C).
  6. 移去上清液，并用 1 ml 轻轻重悬细胞 无添加物的DMEM。使用P-1000移液器将细胞上下吹打充分混匀，以获得单细胞悬液。
  7. 将1.6步骤中获得的细胞悬液进行1:10稀释，取18 µl 未添加补充物的DMEM 0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管，随后加入2 µl 肿瘤细胞悬液。使用P-10微量移液器反复吹打，充分混匀细胞。
  8. 加入10 µl 1:10 肿瘤细胞稀释液（步骤 1.7 中制备）转移至另一 0.6 ml 离心管中 锥形聚丙烯微量离心管，然后加入10 µl 加入台盼蓝染液至试管中，用P-10微量移液器充分混匀，然后加入10 µl 将最终的肿瘤细胞/台盼蓝溶液置于血细胞计数板上的盖玻片下，在加盖时需小心避免产生气泡（图1D).
    1. 使用血细胞计数板配套的特定操作规程，用10倍物镜在明场显微镜下对细胞进行计数。在对细胞进行计数以准确估算原始肿瘤细胞悬液浓度时，务必计入制备过程中造成的20倍稀释因素。 最初的1 ml 分装。使用以下公式计算细胞总数：细胞总数/ml = [((∑（每方格计数的细胞数）/ 计数的方格数）× 20即， 稀释倍数）× 10,000 个细胞/毫升]
  9. 在确定实验中所用各细胞系的总细胞数后，于 4 ℃ 以 550 × g（最大相对离心力）离心 5 分钟，沉淀细胞 °C. 移除上清液，并用适量的未添加补充物的 DMEM 重悬细胞，以达到 3 x 10⁶ 个细胞/mL 的目标浓度。4 每1个细胞 µl 每种细胞系均根据以下公式计算：（细胞总数 / 30,000）。
  10. 将每种细胞系等体积分别加入已标记的0.6 ml离心管中 锥形聚丙烯管并置于冰上（图1E确保保留部分细胞以继续传代培养每个细胞系，若此前未单独接种T75培养瓶的话。

2. 将胶质瘤细胞立体定向移植至C57BL/6J小鼠纹状体的操作步骤

  1. 手术前配制外科麻醉、镇痛及麻醉逆转的工作溶液，步骤如下：
    1. 用于氯胺酮/右美托咪定外科麻醉：从10 ml 无菌0.9% NaCl注射液瓶中移除1.4 ml ，并加入600 µl 100 mg/ml 盐酸氯胺酮储备液和800 µl 0.5 mg/ml 盐酸右美托咪定储备液，配制成含盐酸氯胺酮（6 mg/ml）和盐酸右美托咪定（0.04 mg/ml）的混合工作溶液。
    2. 用于布托啡诺镇痛：从10 ml 无菌0.9% NaCl注射液瓶中移除1 ml ，并加入整支1 ml 0.3 mg/ml 盐酸布托啡诺安瓿中的全部溶液，配制成0.03 mg/ml 的工作溶液。
    3. 用于阿替美唑外科麻醉逆转：从10 ml 无菌0.9% NaCl注射液瓶中移除1 ml ，并加入1 ml 5 mg/ml 盐酸阿替美唑储备液，配制成0.5 mg/ml 的工作溶液。
  2. 在符合规定的实验小鼠存活手术操作区域，准备好已高压灭菌或通过干热灭菌珠灭菌的外科器械及其他试剂（如图2A所示），并获取本研究所需数量的8–10周龄雌性C57BL/6J小鼠（与GL26胶质瘤同系），确保其可自由获取食物和饮水。
  3. 通过腹腔（i.p.）单次注射工作麻醉溶液对第一只小鼠进行麻醉，剂量为75 mg/kg氯胺酮和0.5 mg/kg右美托咪定（约20 g小鼠注射250 µl ）。随后，皮下（s.c.）注射5 mg/kg卡洛芬（约20 g小鼠注射100 µl ）。在继续操作前，确认小鼠对脚趾和尾部夹捏无反应。
  4. 使用手术剪刀剃除颅骨区域的毛发。在剃毛区域涂抹聚维酮碘消毒液，用70%异丙醇消毒棉片擦拭，再重新涂抹聚维酮碘消毒液。随后，在每只眼睛上涂抹少量无菌石蜡眼膏，以防角膜干燥。
  5. 按照以下步骤将颅骨固定于立体定位仪：
    1. 用弯头解剖镊小心张开小鼠口腔，轻拉舌头并移至口腔一侧以防窒息。保持镊子在口腔内并轻轻回撤，使下颌张开，并引导上颌两颗门齿嵌入立体定位仪齿条的钥匙孔中。通过调节相应螺钉，固定齿条，防止其水平或垂直摆动。确保小鼠颅骨与实验台面保持水平。
    2. 将耳杆牢固地贴合于颅骨眶后骨，注意避免对颅骨施加过大的向内压力，以防压碎骨骼。
    3. 将鼻杆置于吻部上方并旋紧至贴合。用拇指和食指轻压头部，检查是否存在垂直或侧向移动。正确固定于立体定位仪中的小鼠如图2B所示。
    4. 使用手术刀片在颅骨正中线上从前额骨至枕骨做1 cm长的切口。使用Colibri牵开器牵开切口处皮肤。
    5. 将装有33 G针头的微量注射器固定于立体定位仪垂直臂上，并移至前囟（bregma）正上方位置（图2C）。随后，将针头位置调整至前囟后+0.5 mm、中线旁+2.5 mm，以到达肿瘤植入靶点。使用装有26 G针头的1 ml 结核菌素注射器轻轻刮擦骨膜，标记该位置。
    6. 使用配备1/32”（0.8 mm）钻头的无线精密电钻在靶点处钻孔，直至暴露下方硬脑膜。钻孔过程中，应间歇性施加压力，并周期性将钻头从颅骨表面移开，以避免产生过多热量和压力，防止钻头刺穿下方脑组织。
  6. 用0.9% NaCl在1.7 ml 锥形聚丙烯微量离心管中冲洗微量注射器，确保针头未堵塞。轻轻振荡装有肿瘤细胞的0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管数次，使细胞充分重悬。
  7. 将2 µl 细胞悬液吸入微量注射器中，确保无气泡进入。将1 µl 细胞悬液滴加至70%异丙醇消毒棉片上，使注射器内恰好剩余1 µl 肿瘤细胞悬液。
  8. 将针头下移至接触硬脑膜，然后将针头向腹侧插入脑内-3.5 mm，再回撤+0.5 mm。在1–2分钟内缓慢而平稳地推动注射器活塞，完成细胞注射。
  9. 注射后让细胞在注射部位静置5分钟，再缓慢撤出针头。用干净的70%异丙醇消毒棉片擦拭针尖上凝固的血液或脑组织。用第2.6步中的0.9% NaCl彻底冲洗针头和注射器，确保下一次注射前针头无堵塞。
  10. 移除Colibri牵开器，使用三针3-0尼龙单丝缝线缝合头皮。将小鼠从立体定位仪中取出，皮下（s.c.）注射0.1 mg/kg盐酸布托啡诺（约20 g小鼠注射67 µl 0.03 mg/ml 工作溶液），随后肌内（i.m.）注射2.5 mg/kg盐酸阿替美唑（约20 g小鼠注射100 µl 0.5 mg/ml 工作溶液），以缓解术后疼痛并逆转麻醉。将术后小鼠放回笼中，并置于加热灯下恢复。

3. 小鼠经心脏灌注及脑组织采集

  1. 根据以下步骤配制肝素化Tyrode溶液：
    1. 将一个磁力搅拌子放入1 L玻璃螺口储存瓶中，加入超纯去离子水至刻度，将瓶子置于搅拌板上。
    2. 在搅拌的同时，称取以下化学试剂加入玻璃瓶中：8 g氯化钠（NaCl）、0.264 g氯化钙（CaCl2•2H2O）、0.05 g磷酸二氢钠（NaH2PO4•2H2O）、1.0 g D-葡萄糖（C6H12O6）、1.0 g碳酸氢钠（NaHCO3）、0.2 g氯化钾（KCl）。待盐类完全溶解后，加入100 µl 浓度为1,000 U/ml 的肝素钠储备液至Tyrode溶液中。
    3. 将容器从搅拌板上取下，用磁力棒取出搅拌子。将肝素化Tyrode溶液于4 °C保存。
  2. 配制终末麻醉工作液，步骤如下：
    1. 对于氯胺酮/赛拉嗪终末麻醉：从10 ml 无菌0.9% NaCl注射液瓶中移除1,360 µl ，然后加入1,200 µl 浓度为100 mg/ml 的盐酸氯胺酮储备液和160 µl 浓度为100 mg/ml 的盐酸赛拉嗪储备液，得到混合工作液，其中盐酸氯胺酮浓度为12 mg/ml，盐酸赛拉嗪浓度为1.6 mg/ml。
  3. 在无菌塑料容器中，将90 ml 10x PBS加入264 ml 超纯去离子水中（终浓度为3.93x），用HCl调节pH至7.0–7.2，并通过0.22 µm滤器过滤除菌。4 °C保存。
  4. 在50 ml 聚丙烯离心管中，将18 ml 密度梯度离心介质混合液与30 ml密度梯度离心介质（详见材料清单）混合，配制成70%密度梯度离心介质。4 °C保存，使用前恢复至室温。
  5. 在50 ml 离心管中，将9.6 ml DPBS与10.4 ml 70%密度梯度离心介质混合，配制成37%密度梯度离心介质。4 °C保存，使用前恢复至室温。
  6. 在50 ml 离心管中，将500 µl FBS加入50 ml DPBS中（约1% FBS），配制流式缓冲液。4 °C保存。
  7. 用冰屑将一个4.5 L聚氨酯冰桶装满。
  8. 用无菌DPBS将10 mg/ml DNase-I储备液稀释10倍，将50 mg/ml 胶原酶储备液稀释50倍，在一个15 ml 聚丙烯离心管中配制成含有1 mg/ml 胶原酶和1 mg/ml DNase-I的混合溶液，所需总体积按每份脑组织样本1 ml 计算。用P-1000移液器轻轻吹打混匀。将溶液置于第3.7步准备的聚氨酯冰桶中冰上保存。
  9. 准备两个7 ml 玻璃Dounce组织研磨器。分别标记为“NT”和“gal1i”。将研磨器放入冰桶中，并向每个研磨器中加入1 ml DPBS。
  10. 准备足够数量的15 ml 离心管，用于收集实验中每只小鼠的脑组织，并放入冰桶中。
  11. 将约150 ml DPBS分装至三个50 ml 离心管中，放入冰桶。
  12. 为实验中的每只小鼠准备足够数量的聚苯乙烯六角称量皿（上口内径115 mm，底口内径85 mm，容积203 ml ）。小鼠脑组织解剖与吹打的完整装置如（图3A）所示。
  13. 在预定时间点，通过腹腔注射150 mg/kg盐酸氯胺酮和20 mg/kg盐酸赛拉嗪（对于20 g小鼠，约250 µl 上述12 mg/ml 氯胺酮/1.6 mg/ml 赛拉嗪混合工作液）对实验中的第一只荷瘤小鼠进行麻醉，以诱导深度麻醉。在继续操作前，确认小鼠对脚趾和尾部夹捏无反应。
  14. 取出预先配制的Tyrode溶液，置于专用于终末动物手术操作的层流罩内。将连接至碳氧混合气（carbogen）钢瓶的气体不透性聚合物管插入Tyrode溶液中。打开钢瓶阀门，使95% O2/5% CO2碳氧混合气持续通入溶液中。
  15. 将一根20 G铝制接头钝头针连接至另一段连接蠕动泵的气体不透性聚合物管末端。将管子另一端插入Tyrode溶液中，开启蠕动泵，使管道充满经氧合和肝素化的Tyrode溶液。小鼠经心灌注装置如（图3B）所示。
  16. 使用四根26 G针头，将麻醉后的小鼠仰卧位固定在层流罩内的挤出型聚苯乙烯泡沫板上，泡沫板表面覆盖一次性吸水毛巾，固定前肢和后肢。
  17. 用钝头解剖镊夹住腹腔上方皮肤，用大号解剖剪刀穿透腹壁，向上剪至膈肌穿孔，然后在胸骨处分叉，分别剪至左右腋窝，形成“Y”形切口。
  18. 用止血钳夹住胸骨，将肋骨向小鼠左肩方向翻折。用钝头解剖镊去除心包膜。
  19. 开启蠕动泵，使氧合并肝素化的Tyrode溶液以稳定速度滴入（约2.3–2.5 ml/min）。
  20. 将钝头针插入小鼠左心室。用小号解剖剪刀剪开右心房，以利血液流出（图3C）。
  21. 持续灌注Tyrode溶液，直至肝脏和肺部因血液完全清除而变得苍白。在从左心室拔出20 G铝制接头钝头针前，确保右心房不再有大量血液流出。
  22. 将小鼠从挤出型聚苯乙烯泡沫板上取下，翻转为俯卧位。用大号解剖剪刀在颈部水平将头部与身体分离。
  23. 用小号解剖剪刀从枕骨开始沿中线向前剪开头皮至吻部，以暴露颅骨。
  24. 用拇指和食指将颅骨两侧的皮肤向后拉开并固定头骨。用骨剪从枕骨开始逐步击穿颅骨，向前推进，完全暴露脑组织的背侧和外侧表面。操作时注意尽量减少对脑组织的损伤。
  25. 颅骨去除后，将小鼠头部翻转为仰卧位，用小号解剖剪刀在脑基底部剪断颅神经，使脑组织与颅骨分离。

4. 胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的分离

  1. 使用洁净的单刃剃刀，沿大脑正中矢状面切割，将含有肿瘤的脑组织从大脑中分离出来，以分离两个半球。将同侧半球内侧面朝下放置，分别在小脑和嗅球水平进行两次冠状切面切割，以分离出含有肿瘤植入物的目标组织 （图4A）。对侧半球的等效部分也可被分离并用作阴性对照。
  2. 将目标组织放入相应标记的玻璃Dounce组织研磨器中，其中含有1 ml DPBS，将研磨杵完全推到底部并旋转7次，初步破碎组织。提起研磨杵，使液体重新沉降到研磨器底部。重复此步骤三次；但在接下来的两次重复中仅旋转4次，最后一次旋转3次，以避免过度吹打组织。
  3. 使用P-1000微量移液器，沿研磨杵侧壁依次加入三份1 ml 冰冻DPBS（按3.11步骤制备），冲洗至研磨器中。
  4. 通过反复吹打重悬已吹打的脑组织，并将其转移至标记好的15 ml 离心管中，置于冰上。用额外1 ml 冰冻DPBS冲洗Dounce组织研磨器内壁，并将冲洗液加入同一15 ml 离心管中。所有含有吹打后脑组织的离心管均需保持在冰上，直至所有样本处理完毕。
  5. 对研究中的每只小鼠重复步骤3.13–3.25和4.1–4.4。
  6. 所有样本处理完成后，将15 ml 离心管中的吹打脑组织在4 °C条件下以740 × g（最大RCF）离心20 min 。
  7. 使用10 ml 移液管和移液器吸除上清液，并用P-1000移液器将沉淀的脑组织重悬于1 ml 预先配制的胶原酶/DNase-I消化酶溶液中。将15 ml 离心管放入试管架中，置于37 °C水浴中孵育15分钟。
  8. 在孵育期间，轻轻弹击管壁两次，以促进组织解离。
  9. 使用10 ml 移液管向每管中加入6 ml 冰冻DPBS，以稀释消化酶。反复吹打重悬后，将全部液体通过无菌70 µm尼龙滤网过滤，收集至新标记的15 ml 离心管中，置于冰上。
  10. 将脑细胞悬液在4 °C条件下以740 × g（最大RCF）离心20分钟，获得单细胞沉淀 （图4B）。从离心机中取出15 ml 离心管后立即置于冰上，并将离心机温度设定提高至约21 °C，为下一步操作做准备。
  11. 彻底吸除每管中的上清液，先用P-1000微量移液器将沉淀初步重悬于1 ml 70%密度梯度离心介质中。然后使用10 ml 移液管向每管中再加入4 ml 70%密度梯度离心介质。拧紧管盖，通过轻柔翻转数次使细胞悬液均匀混合。
  12. 将含有重悬于70%密度梯度离心介质中脑细胞的15 ml 离心管从冰上取出，置于室温下的试管架中。逐个使用P-1000微量移液器，小心地将2 ml 37%密度梯度离心介质溶液叠加到5 ml 70%密度梯度离心介质上，形成两层密度梯度介质之间的清晰界面 （图4C）。
    1. 使用细头记号笔标记界面位置，以便在离心后界面变得不明显时仍能轻松识别。
  13. 将15 ml 离心管在室温下以740 × g（最大RCF）离心20 min ，离心过程中不设刹车，以避免破坏界面。
  14. 离心后，使用P-200微量移液器从管壁侧方插入，小心绕过脂质层，收集聚集在两层密度梯度介质界面处的外周血单个核细胞（PBMC）（图4D）。
    1. 到达PBMC条带位置后，缓慢从70%密度梯度离心介质层表面吸取200 µl 液体，转移至相应标记的聚丙烯FACS管中，置于冰上。重复一次，使每份样本总体积达到400 µl 。
  15. 向每管含有400 µl PBMC的FACS管中加入3 ml 流式缓冲液，充分稀释密度梯度离心介质，然后在4 °C条件下以660 × g（最大RCF）离心20 min 。

5. 胶质瘤浸润性外周血单个核细胞的免疫标记

  1. 在分析任何实验性外周血单个核细胞（PBMC）样本之前，应先进行一次独立的细胞表面同型对照实验，以建立基线设门参数，并将其与固定的光电倍增管（PMT）电压关联，纳入专用于分析胶质瘤浸润性PBMC的流式细胞术数据分析模板中，具体操作步骤如下：
    1. 将一只 C57BL/6J 小鼠接种 GL26-Cit-gal1i，另一只接种 GL26-Cit-NT，操作步骤依照第 2 节所述。72 小时后 根据第3和第4节所述步骤，于肿瘤生长相应时间点处死两只小鼠，并分离肿瘤浸润的外周血单个核细胞（PBMC）。
    2. 将两个PBMC样本（NT和gal1i）合并为一个体积（即， 100 µl），然后将样品平均分装到三个FACS管中（即， 33.3 µl 每管）标记 CD45 同型对照, Gr-1/CD11b 同型对照，以及 NK1.1 同型对照. 加入以下抗体（每种抗体均按1:100稀释，总体积稀释至200 μL） µl 加入流式缓冲液）至相应标记的FACS管中： CD45 同型对照：Alexa Fluor 700 标记的 大鼠 IgG2b， κ （克隆：RTK4530） Gr-1/CD11b 同型对照：Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 大鼠抗体（克隆：30-F11），PE 标记的大鼠 IgG2b κ （克隆：eB149/10H5），以及PerCP/Cy5.5标记的大鼠IgG2b， κ （克隆：RTK4530）； NK1.1 同型对照：Alexa Fluor 700 标记的抗小鼠 CD45 大鼠抗体（克隆：30-F11）、PE 标记的抗小鼠 Gr-1 大鼠抗体（克隆：RB6-8C5）、PerCP/Cy5.5 标记的抗小鼠 CD11b 大鼠抗体（克隆：M1/70）以及 APC 标记的小鼠 IgG2a 同型对照抗体， κ （克隆：eBM2a）
    3. 将PBMCs置于冰上避光孵育20分钟以进行免疫标记。 孵育过程中途轻轻振荡试管一次以混匀。用1 ml缓冲液洗涤 加入流式缓冲液，于4℃下以660 × g（最大相对离心力）离心10分钟 °C，并向每管含有PBMCs的FACS管中加入200 μL重悬 µl 流式缓冲液
    4. 使用配备85的流式细胞仪 µ集成喷嘴，分析 “CD45 同型对照“ 先运行对照管，以建立基线 CD45 门控区间。接着，运行待测样本 Gr-1/CD11b 同型对照 通过仅使用真正的 CD45 设置 Gr-1/CD11b 象限门以建立基线+ 细胞作为输入。最后，运行 NK1.1 同型对照 使用仅含真实 CD45 的试管建立 NK1.1 间隔门的基线+Gr-1低/CD11b+/- 细胞作为输入。
  2. 所有后续实验分析均采用以下步骤：
    1. 配制足量的流式缓冲液，将细胞表面抗体按1:100比例稀释，以确保每样本200 μL的用量 µl 每份样本的体积（另加1份用于GzmB同型对照）：Alexa Fluor 700标记的大鼠抗小鼠CD45（克隆号：30-F11）、PE标记的大鼠抗小鼠Gr-1（克隆号：RB6-8C5）、PerCP/Cy5.5标记的大鼠抗小鼠CD11b（克隆号：M1/70）、APC标记的小鼠抗小鼠NK1.1（克隆号：PK136）。
    2. 小心移除4.15步骤中离心后的PBMC上清液，直至弯月面刚好位于每根FACS管底部上方约50 μL处。 µl) 以避免细胞损失。使用残余的流式缓冲液，用P-200移液器重悬每个FACS管中的PBMCs，从每个FACS管中移除相当于（1/样本数）体积的悬液，合并至一个新标记为“混合同型对照”的FACS管中。
    3. 加入200 µl 将5.2.1中配制的细胞表面抗体混合液分别加入各PBMC样本中。将PBMC置于冰上避光孵育20分钟，期间在孵育一半时间时轻轻弹动离心管一次，以轻柔混匀。
    4. 用1 ml洗涤 流式缓冲液；在4℃下以660 × g（最大相对离心力）离心10分钟 °C.
    5. 将所有含有 PBMC 的 FACS 管重悬于 200 µl 一种市售的基于甲醛的固定剂（详见材料列表）固定 15 分钟 置于冰上避光孵育。在孵育过程中途轻轻弹击管壁一次，以轻柔混匀。
    6. 用1 ml洗涤 使用市售的1×破膜/洗涤缓冲液（详见材料列表），在660 × g（最大相对离心力）下离心10分钟。 4 ℃时 °C.
    7. 在 PBMC 离心过程中，用 1× 透化/洗涤缓冲液配制太平洋蓝（Pacific Blue）标记的小鼠抗小鼠 GzmB（克隆：GB11）细胞内抗体，稀释比例为 1:100，制备足量溶液以满足每样 200 μL 的用量需求 µl 每样本体积
    8. 在另一个试管中，配制一份200 µl Pacific Blue 标记的小鼠 IgG1 以 1:100 稀释后的体积 κ （克隆：MOPC-21）同型对照抗体。
    9. 将每个实验样本的外周血单个核细胞（PBMC）重悬于200 µl 1:100 稀释的抗小鼠 GzmB 抗体，并将标记为“混合同型对照”的单个 FACS 管重悬于 200 µl 1:100 稀释度的同型抗体的体积
    10. 将所有PBMC样本置于冰上避光孵育20分钟进行免疫标记。孵育至一半时间时，轻轻弹动管壁一次，以温和混匀。
    11. 用1 ml洗涤 加入流式缓冲液；在4℃下以660 × g（最大相对离心力）离心10分钟 °C，并用200 μL重悬PBMCs µl 用于分析的流式缓冲液。
    12. 使用85对胶质瘤浸润性PBMC进行流式细胞术分析 µm集成喷嘴以及在5.1节中先前确定的门控和PMT电压22务必在流式细胞仪上加载每个样本的全部体积，以确保对各样本中胶质瘤浸润性外周血单个核细胞（PBMC）的总数进行公平比较。

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结果

典型实验采用以下设门策略：FSC-A 对 SSC-A → SSC-H 对 SSC-W → FSC-H 对 FSC-W → CD45 对 细胞数 → Gr-1 对 CD11b → NK1.1 对 细胞数。在 Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞和 NK1.1+ NK 细胞设门后，进一步根据 GzmB 的表达情况进行分群 (图 5A)。将实验中鉴定为 NK1.1+ NK 细胞和 Gr-1+/CD11b+ 髓系细胞的群体反向设门至 FSC-A 对 SSC-A 图中，可确认 NK 细胞具有较小的淋巴细胞样体积，而髓系细胞体积相对较大 (图 5B)。原始数据文件（即，fcs 文件）采用商业化的流式细胞数据分 析软件（如 Flowjo）进行分析。

共使用18只C57BL/6J小鼠来演示该方法。其中9只小鼠同日接种等量细胞（3×104）的GL26-Cit-NT，...

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讨论

本方案描述了一种稳定且可重复的方法，用于分离和通过流式细胞术分析浸润早期小鼠脑肿瘤微环境的外周血单个核细胞（PBMCs）。实验人员将胶质瘤细胞悬液配制至特定浓度后，通过立体定位法将其移植至小鼠脑纹状体。随后，根据实验设计预设的时间点对小鼠实施安乐死，取出其脑组织并进行处理，以分离出浸润胶质瘤的PBMCs，并使用多种荧光染料标记的一抗对其进行免疫标记；之后通过流式细胞术对免疫标记的细胞进行定量分析。尽管本文演示的重点是早期时间点，但可在肿瘤移植后任意时间点（直至小鼠濒死前）对浸润胶质瘤的PBMCs进行评估。该方法具有高度模块化特点，可使用任意数量的不同抗体组合来检测感兴趣的免疫细胞，包括T细胞、B细胞、NK细胞、单核细胞和巨噬细胞。需注意，本方案已针对8至10周龄的雌性C57BL/6J小鼠进行了优化。超出此年龄范围的小鼠其循环PBMCs的比例可能发生变化，从而导致在相同时间点的细胞计数与本文所展示的数据不具代表性。若使用其他肿瘤模型或非B6遗传背景的小鼠，可能需要额外进行表征实验，因为不同品系的PBMC谱可能存在差异（Jaxpheno6；小鼠表型数据库；杰克逊实验室）。性别和环境条件也可能导致PBMC频率和比例的差异。

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所资助 & 美国国立卫生研究院/国家神经疾病与卒中研究所（NIH/NINDS）资助项目 R01-NS074387、R01-NS057711 和 R21-NS091555 至 M.G.C.；NIH/NINDS 资助项目 R01-NS061107、R01-NS076991、R01-NS082311 和 R21-NS084275 至 P.R.L.；Leah’s Happy Hearts 及密歇根大学综合癌症中心资助项目至 M.G.C. 和 P.R.L.；密歇根大学医学院神经外科系；密歇根临床与健康研究研究所，由 NIH 资助项目 2UL1-TR000433 支持；密歇根大学癌症生物学培训项目，由 NIH/NCI（国家癌症研究所）资助项目 T32-CA009676 支持；密歇根大学临床与基础神经科学培训项目，由 NIH/NINDS 资助项目 T32-NS007222 支持；密歇根大学医学科学家培训项目，由 NIH/NIGMS（国家普通医学科学研究所）资助项目 T32-GM007863 支持。作者感谢 Karin Muraszko 博士及神经外科系提供的学术领导与支持；感谢 M. Dahlgren、D. Tomford 和 S. Napolitan 提供卓越的行政支持；感谢 M. Dzaman 提供出色的技术协助；感谢 Phil F. Jenkins 为购置蔡司 3D 扫描电子显微镜提供的慷慨支持。我们还感谢哈佛医学院 Kuchroo 实验室，本研究中用于分离脑单核细胞的改良密度梯度离心介质法即源于该实验室。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
杜尔贝科’s 修改的伊格尔培养基Gibco12430-054含 4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、25 mM HEPES 和酚红 
杜尔贝科’磷酸盐缓冲液 Gibco14190-144 不含氯化钙或氯化镁
胎牛血清Omega Scientific Inc.FB-11
青霉素-链霉素 Gibco15140-12210,000 U/ml 青霉素；10,000 μg/ml 链霉素 
L-谷氨酰胺Gibco25030-081200 mM
G418硫酸盐 Omega Scientific Inc.GN-04
嘌呤霉素二盐酸盐  Sigma-AldrichP8833来自 Streptomyces alboniger
HyClone HyQTase 非哺乳动物胰蛋白酶替代液 赛默飞世尔科技SV30030.01在含EDTA的DPBS中 
相差显微镜血细胞计数板Sigma-AldrichZ3596290.1 mm 深
台盼蓝染色Gibco15250-061
无菌0.9%氯化钠注射液，USPHospiraNDC：0409-488810 ml 小瓶
0.6 ml 锥形聚丙烯微量离心管Genesee Scientific22-272
盐酸阿替美唑注射液Orion PharmaNDC：52483-62985 mg/ml 溶液
盐酸氯胺酮注射液福特·多德NDC：0409-2051100 mg/ml 溶液
盐酸右美托咪定注射液硕腾NDC：54771-28050.5 mg/ml 溶液
盐酸赛拉嗪注射液劳埃德NDC：61311-481100 mg/ml 溶液
卡洛芬注射液辉瑞NDC：61106-850150 mg/ml 溶液
盐酸丁丙诺啡注射液Reckitt BenckiserNDC：12496-07570.3 mg/ml 安瓿瓶
1 ml 结核菌素注射器 Covidien8881501400
26G x ½ (0.45 mm × 13 mm) 注射器针头 BD305111
手术剪3M9661
聚维酮碘溶液Aplicare82-217NDC：52380-1905
无菌凡士林眼膏 DechraNDC：17033-211
70% 异丙醇消毒垫肯德尔6818
无菌纱布Covidien8044无纺布，4" × 4"，4层 
1.7 ml 锥形聚丙烯微量离心管Genesee Scientific22-281
小鼠立体定位仪斯托尔廷51730
手术灯Philips BurtonCS316WCoolspot II 可调光斑照明系统
弯头解剖镊Ted Pella 公司5431
科利布里拉钩 FST17000-03
无线精密电钻Dremel 1100-01触控笔型号；7.2伏锂离子电池，带底座充电站
雕刻刀Dremel1051/32" 或0.8 mm钻头直径
微量注射器Hamilton75Hamilton 微量注射器 700 系列；5 μl 体积
微升注射器针头Hamilton7762-0633G，小鲁尔接头RN针头，1.5英寸，3型针尖，6支/包
Ethilon 3-0 黑色单丝尼龙缝线 Ethicon1663
磁力搅拌子VWR74950-2967.9 毫米直径 × 50 毫米长度（5/16）" 直径 × 2" 长度
1 L 玻璃螺口储存瓶康宁13951型A级硼硅酸盐玻璃
肝素钠 SagentNDC：25021-4001,000 U/ml 溶液
蠕动泵Cole Parmer仪器集团77200-60Master Flex Easy Load II 控制台驱动器
压缩碳合气（95% O₂，5% CO₂）2 / 5% CO₂2)可从本地供应商处获取N/AA型大圆柱 
20 G × 1 ½" 铝制针座钝头针肯德尔88812023630.9 mm x 38.1 mm
聚氨酯冰桶Fisherbrand02-591-45容量：0.152 盎司（4.5 L）
胶原酶（I-S型）Sigma AldrichC1639来自艰难梭菌（Clostridium histolyticum） 
脱氧核糖核酸酶 I沃辛顿生化公司LS002007>每毫克干重2,000 Kunitz单位
抗静电聚苯乙烯六角称量皿Ted Pella 公司20157-3顶部内径 115 mm，底部内径 85 mm，容积 203 ml 
不锈钢单刃剃须刀片 加维40475
骨剪FST16001-15
止血钳FST13014-14
大型解剖剪Ted Pella 公司1316
小型解剖剪FST14094-11
钝端镊子Ted Pella 公司13250
7 ml 玻璃Dounce组织研磨器KontesKT885300-0007
Percoll 密度梯度离心介质 GE HealthcareGE17-0891-01
10 ml 血清移液管Genesee Scientific12-104一次性使用；无菌
70 μm 无菌尼龙筛网细胞过滤器 Fisherbrand22363548
Alexa Fluor 700 标记的大鼠抗小鼠 CD45 抗体（克隆号：30-F11）Biolegend103128
APC标记的小鼠抗小鼠NK1.1（克隆：PK136）eBiosciences 17-5941-82
PE标记的抗小鼠Gr-1大鼠单克隆抗体（克隆号：RB6-8C5）BD Pharmigen553128
PerCP/Cy5.5 标记的大鼠抗小鼠 CD11b 抗体（克隆号：M1/70） Biolegend101228
Alexa Fluor 700 标记的大鼠 IgG2b κ （克隆：RTK4530）同型对照 Biolegend400628
APC标记的小鼠IgG2a κ （克隆：eBM2a）同型对照 eBioscience17-4724
PE标记的鼠IgG2b κ （克隆：eB149/10H5）同型对照 eBioscience12-4031-82
PerCP/Cy5.5 标记的大鼠 IgG2b κ （克隆：RTK4530）同型对照Biolegend400632
太平洋蓝染料标记的小鼠抗小鼠颗粒酶B抗体（克隆：GB11） Biolegend515403
太平洋蓝染料标记的小鼠 IgG1 κ （克隆：MOPC-21）同型对照 Biolegend400151
Cytofix/CytopermBD554714
15 ml 聚丙烯离心管Genesee Scientific21-103锥形底部 
50 ml 聚丙烯离心管Genesee Scientific21-108锥形底部
12 mm x 75 mm 圆底聚丙烯FACS管 Fisherbrand14-956-1B
FACSAria 特殊订单研究产品 流式细胞仪/细胞分选仪BD 650033
II级生物安全柜The Baker CompanySG603型号：SterilGARD III Advance

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