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用于测量小鼠睡眠的多导生理记录操作流程

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DOI：

10.3791/53678

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2016年1月25日

 ,  ,  ,  ,  , 
1International Institute for Integrative Sleep Medicine (WPI-IIIS), University of Tsukuba, 2Public Sector/Medical Solutions, Kissei Comtech Co., Ltd

本文内容

摘要

在自由活动的小鼠中记录脑电图（EEG）和肌电图（EMG）是将行为与睡眠和觉醒的生理状态相关联的关键步骤。本文所述的实验方案提供了一种基于电缆的系统，用于在小鼠中获取脑电图和肌电图记录。

摘要

在小动物（如小鼠和大鼠）中记录硬膜外脑电图（EEG）和肌电图（EMG）对于研究睡眠-觉醒调节的稳态机制和神经环路至关重要。目前许多实验室采用基于电缆的睡眠记录系统，结合计算机软件对EEG数据进行功率谱分析，从而自动评分自由活动小鼠的警觉状态。本文详细描述了该系统。通过在单侧大脑半球的额叶皮层区和顶叶区上方植入钢质螺钉，用于监测EEG信号；此外，通过在双侧颈部肌肉中植入导线来记录EMG活动。非快速眼动睡眠（Non-REM；NREM）的特征是EEG中出现幅度大、频率慢的脑电波，其δ活动低于4 Hz；而在从NREM睡眠向REM睡眠过渡时，可观察到EEG由低频δ活动转变为6至10 Hzθ频段的快速低幅电活动。相比之下，清醒状态的特征是EEG轨迹中呈现低至中等幅度的脑电波，并伴有显著的EMG活动。

引言

技术进步常常推动神经生物学过程认知的飞跃。例如，汉斯·贝格尔（Hans Berger）于1929年发现，从人类头皮记录到的电位呈正弦波形式，其频率与受试者的清醒程度直接相关，这一发现促进了动物和人类睡眠-觉醒调控机制研究的迅速发展。1 迄今为止，脑电图（EEG）与肌电图（EMG）联合使用 即由骨骼肌产生的电活动，代表了数据 "骨架" 几乎所有旨在将行为和生理活动与动物（包括人类）行为状态下皮层神经元活动相关联的实验和临床评估都依赖于此。在大多数基础睡眠研究实验室中，这些脑电图记录是通过基于电缆的系统进行的图1）其中获取的数据将进行离线的模式和频谱分析[例如应用快速傅里叶变换（FFT）算法来确定被记录受试者的警觉状态。2, 3 睡眠包括快速眼动（REM）睡眠和非快速眼动（NREM）睡眠。REM 睡眠的特征是脑电图（EEG）表现为快速、低电压的波形，伴随随机的眼球运动以及肌肉失张力，即肌肉处于有效麻痹的状态。REM 睡眠也被称为矛盾睡眠，因为此时脑活动类似于清醒状态，而身体大部分与大脑失去联系，表现为深度睡眠。相比之下，NREM 睡眠期间运动神经元被激活，但无眼球运动。人类的 NREM 睡眠可分为 4 个阶段，其中第 4 阶段称为深度睡眠或慢波睡眠，其脑电图特征为具有 0.5 - 4 Hz δ 活动的大而缓慢的脑电波。然而，在大鼠和小鼠等体型较小的动物中，尚未建立 NREM 睡眠的明确分期，主要原因是这些动物不像人类那样具有长时间连续的睡眠周期。

多年来，基于脑电图（EEG）的解读，人们提出了多种关于睡眠-觉醒调节的模型，包括基于神经环路和体液因素的模型。睡眠需求或另一种说法——"睡眠驱动力"——的神经与细胞基础至今尚未明确，但通常被概念化为一种在清醒期间逐渐积累、并在睡眠中得以释放的稳态压力。一种理论认为，内源性促眠因子在清醒期间不断积累，其逐步积聚构成了睡眠稳态压力的基础。尽管最早正式提出睡眠由体液因子调节的假说可追溯至1892年Rosenbaum的研究4，但真正独立地在一百多年前证实促眠化学物质存在的，是Ishimori5, 6和Pieron7。两位研究者提出并确凿证明，在被剥夺睡眠的狗的脑脊液（CSF）中存在促眠物质或“催眠毒素”8。在过去的一个世纪中，人们又陆续鉴定出多种可能参与睡眠稳态过程的促眠物质（综述见参考文献9），包括前列腺素（PG）D2,10、细胞因子11、腺苷12、花生四烯乙醇胺（anandamide）13以及尾加压素II肽（urotensin II peptide）14。

Economo 的实验工作15, 16，莫鲁齐和马贡17以及20世纪早期和中期的其他研究者th 世纪以来的研究成果启发了基于神经回路的睡眠与觉醒理论，并在一定程度上掩盖了当时占主导地位的体液睡眠理论。迄今为止，已有若干 "电路模型" 已提出多种模型，每种模型所依据的数据在质量和数量上各不相同（综述见参考文献18）。例如，其中一种模型认为，慢波睡眠是通过腺苷介导的对基底前脑胆碱能神经元乙酰胆碱释放的抑制而产生的，该区域主要由布罗卡斜带水平支核和无名质组成。19 另一种流行的睡眠/觉醒调节模型基于腹外侧视前区促眠神经元与下丘脑及脑干促醒神经元之间的相互抑制作用，描述了一种双稳态开关机制。18, 20, 21 此外，对于REM睡眠的开启与关闭，脑干中的腹侧导水管周围灰质、脑桥外侧被盖区以及侧背侧核之间也提出了类似的相互抑制性作用机制。22 总体而言，这些模型已被证明是睡眠研究中富有价值的启发式工具，并为相关研究提供了重要的解释框架；然而，要更全面地理解调控睡眠-觉醒周期的分子机制和神经回路，仍需对这一系统的各个组分有更为完整的认识。下文详述的多导生理记录系统将有助于实现这一目标。

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方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得筑波大学机构动物实验委员会的批准。

1. 脑电图/肌电图记录用的电极和电缆的制备

  1. 按照以下步骤制备脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录电极。
    注意：该电极为一次性使用，仅可用于1只动物。请仔细规划所有连接器的布线配置，并在连接器上做好标记以确保正确的方向。
    1. 将4针排针的每一针脚焊接至一根2 cm长的不锈钢导线。具体操作为：将导线一端固定在针脚上，将热的焊烙铁接触导线与针脚的连接处，并熔化适量焊料，确保焊料平滑地流入连接点。注意不要对针脚施加过多热量，否则针脚周围的塑料会熔化。
    2. 将连接在排针上的两根导线的自由端分别焊接至直径为1.0 mm的不锈钢螺钉头部。具体操作为：将导线自由端固定在螺钉头部下方的螺纹处，将热的焊烙铁接触导线与螺钉的连接处，并熔化适量焊料，确保焊料平滑地流入连接点。带螺钉的两根导线作为脑电图（EEG）记录电极，而无螺钉的两根导线则作为肌电图（EMG）记录电极。
    3. 使用剪刀剥离肌电图（EMG）电极末端1 mm的绝缘层，以提高肌电图信号质量。
    4. 使用细木棒或牙签将环氧树脂胶完全覆盖所有焊接的针脚，以减少脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录过程中的电噪声。
  2. 按照以下说明制备用于连接电极与滑环的电缆。该电缆可重复使用。
    1. 将4针FFC/FPC连接器的每个针脚焊接至一根30 cm扁平电缆的导线上。具体操作为：将导线裸露端固定在针脚上，将热的焊烙铁接触导线与针脚的连接处，并熔化适量焊料，确保焊料平滑地流入连接点。
      注意：应根据用于脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录的实验动物笼具高度选择合适长度的扁平电缆。
    2. 将压接插孔焊接至扁平电缆另一端导线的末端。具体操作为：将压接插孔固定在导线裸露的自由端，将热的焊烙铁接触导线与插孔的连接处，并熔化适量焊料，确保焊料平滑地流入连接点。
    3. 将每个压接插孔插入4位压接外壳中。
    4. 使用细木棒或牙签将环氧树脂胶完全覆盖压接插孔。

2. 小鼠头部电极植入（持续时间：约 20 分钟）

  1. 在手术前，将所有手术器械在热珠灭菌器中灭菌。通过腹腔注射戊巴比妥（50 mg/kg）对一只雄性小鼠（10–20周龄，20–30 g）进行麻醉。通过夹捏脚趾确认小鼠已深度麻醉后，使用电推剪剃除头颈部的毛发。
  2. 将小鼠移至立体定位仪，用两个耳杆固定头部。在眼睛上涂抹凡士林以防止干燥。用酒精清洁剃毛区域的皮肤，并用手术刀沿中线切开以暴露颅骨。用夹子固定皮肤以保持手术区域开放。
  3. 使用碳化钨钻头（钻头尺寸：直径0.8 mm），根据Paxinos和Franklin立体定位坐标，在颅骨上钻两个孔，分别位于右半球额叶皮质区域（前囟前1 mm，中线外侧1.5 mm）和顶叶区域（人字缝前1 mm，中线外侧1.5 mm）。23
  4. 使用钟表螺丝刀将不锈钢脑电图记录螺钉插入孔中，每个螺钉旋转2至2.5圈，使其位于硬脑膜外皮层上方。
    注意：切勿将螺钉旋入过深，以免损伤脑组织。检查螺钉是否牢固固定于颅骨上，这对于在长时间多次记录期间（通常超过1个月）获得稳定的脑电图信号至关重要。松动的螺钉会产生脑电图伪迹，并可能在实验结束前脱落。
  5. 将电极组件（参见第1.1节，针脚朝上）用瞬干胶固定于颅骨，并以牙科水泥覆盖。用镊子在斜方肌（颈部）肌肉两侧打小孔，将作为肌电图电极的不锈钢丝插入孔中。用丝线（直径0.1 mm）缝合皮肤，避免肌肉暴露。
  6. 将小鼠从立体定位仪中取出。为预防细菌感染，经腹腔注射氨苄青霉素（100 mg/kg）；为减轻术后疼痛，经腹腔注射美洛昔康（1 mg/kg）。将小鼠置于加热垫上，并持续监测，直至其恢复足够意识以维持胸卧位。术后恢复期间将小鼠单独饲养，以防止其他动物撕扯电极，并在手术后第一天再次经腹腔注射美洛昔康（1 mg/kg）。

3. 记录和采集脑电图/肌电图数据

  1. 经过1周的恢复期后，将每只小鼠单独饲养于放置在隔音记录室内的实验笼中。保持环境温度为23 ± 1 °C，并自动控制12小时光照/12小时黑暗循环（光照开启时间为08:00，照度约为100 lux）。
  2. 将小鼠头部的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）电极组件连接至记录电缆。确保记录电缆连接至滑环（其设计可避免小鼠活动时电缆缠绕受限）以及EEG/EMG信号放大器。对EEG/EMG信号进行滤波处理（EEG：0.5–64 Hz；EMG：16–64 Hz），通过模数转换器（A/D）以128 Hz的采样率进行数字化，并最终由运行EEG/EMG记录软件的计算机进行记录（见“材料”表，4）th 从底部进入。
  3. 将小鼠在记录舱内适应 2 - 3 天。如果 EEG/EMG 记录过程中包含腹腔给药，应在每次给药时间点于适应期每日轻柔地抓握小鼠进行操作。
  4. 随后，启动 EEG/EMG 记录软件（材料表，4）th 从底部进入
    1. 选择“数据文件信息”选项卡，点击文件名旁的复选框。输入文件名后点击“保存”。
    2. 选择“记录条件”选项卡，并选中所有将要记录的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）通道。
    3. 在“记录条件”选项卡中选择采样频率（128 Hz）。
    4. 检查所选通道是否在“通道信息”选项卡中正确显示。
    5. 选择“定时设置”选项卡，然后点击“监测”以显示脑电图（EEG）和肌电图（EMG）。
    6. 检查 EEG/EMG 信号是否正确显示。
    7. 选择“定时设置”选项卡，然后在“主定时器”区域设置记录开始和结束的时钟时间。
    8. 在“定时器设置”选项卡中点击“监控”以开始记录。
  5. 在基线条件下记录 EEG/EMG 信号即，自由活动小鼠的睡眠/觉醒行为）以及不同处理条件（例如，咖啡因给药或假处理）数天。在最后一次实验后，通过腹腔注射戊巴比妥（200 mg/kg）处死小鼠。

4. 基于脑电图/肌电图数据的行为状态评分

  1. 启动用于脑电图/肌电图分析的软件（材料表，4）th 从底部进入）。打开在步骤3中生成的脑电图/肌电图原始数据（.kcd文件）。点击“Sleep”标签，选择Epoch时间，设置为10秒。
  2. 点击“睡眠”标签，选择“多屏分析”，以自动将所有10秒时段分为3个阶段即基于脑电图（EEG）和肌电图（EMG）的振幅以及脑电图的功率谱分析，区分非快速眼动睡眠（NREM）、快速眼动睡眠（REM）和清醒状态。3
  3. 点击“EEG的FFT条件”。
  4. 设置功率谱分析的参数［256 个数据点（对应 2 秒的 EEG 信号）、Hanning 窗函数，以及每 epoch 平均 5 个谱］。3 点击“确定”。
  5. 单击“开始筛选”以启动自动筛选。打开已评分的数据（.raf 文件）。
  6. 检查自动筛选的结果，并根据标准准则（参见代表性结果），在必要时进行手动校正。 图1B 和 表1).2, 3 简而言之，用鼠标左键点击并按住标记错误的时段，拖动光标选中一系列标记错误的时段；松开鼠标左键后，在弹出窗口中选择正确的行为状态。
    注意：偶尔，在两种警觉状态之间的过渡期，可能难以明确地将某一时间段归入其中一种状态。在此类情况下，应将该时间段归入表观状态，并在整个实验过程中对类似的时间段应用相同的标准，以确保数据的可重复性。

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结果

图1B 展示了小鼠在不同觉醒状态下的脑电图示例。如表1所示，若脑电图显示低于4 Hz的δ节律大而慢的脑波，且肌电图仅有微弱或无信号，则将该时间段归类为非快速眼动睡眠（NREM睡眠）。若脑电图显示6至10 Hzθ频段的快速低电压脑波，且肌电图显示低振幅，则将该时间段归类为快速眼动睡眠（REM睡眠）。其余时间段应归类为清醒状态（即，脑电图为低至中等电压，并出现肌电活动）。

例如，本方案中描述的脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录装置可用于测定C57BL/6小鼠在基线条件或咖啡因处理后的睡眠时长及睡眠/觉醒谱型。图2和图3).

在基线条件下，小鼠作为夜行性动物表现出明显的昼夜睡眠-觉醒节律，如图中所示，在光照期的睡眠量...

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讨论

本方案描述了一种用于脑电图（EEG）/肌电图（EMG）记录的实验装置，可在低噪声、低成本且高通量的条件下评估睡眠与觉醒状态。由于EEG/EMG电极头端组件体积较小，该系统可与其他脑内植入装置联合使用，包括光遗传学实验（光纤植入）或结合同时进行的套管植入，实现向小鼠脑内微量输注药物31。此外，电极头端组件采用多针接口设计，若需记录额外的电信号（例如：对侧EEG、眼电图或局部场电位），可灵活调整记录通道的数量。

然而，本方案中所述的基于电缆的设计需要单独饲养，因此限制了对行为状态的评估。 即，睡眠与觉醒状态，结合社交互动或复杂行为学测试。在这些情况下，无线睡眠监测系统可能更为合适，尽管遥测设备并非没有其自身的局限性，尤其是电池成本和寿命问题。

根据图1和表1所示标准对行为状态进行评分时，脑电图（EEG）和肌电图（EMG）信号的质量至关重要。电极（即，螺丝）松动通常是导致电噪声的原因，从而在...

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披露

作者 Yujiro Tauguchi 和 Sayaka Kohtoh 是 Kissei Comtech Co., Ltd 的员工，该公司开发了本研究中用于采集和自动分析 EEG/EMG 数据的 SleepSign 软件。

致谢

感谢 Larry D. Frye 博士在本文手稿编辑方面提供的帮助。本研究得到了日本科学促进会科学研究费补助金 24300129（授予 M.L.）、25890005（授予 Y.O.）和 26640025（授予 Y.T.）、日本国立农业与食品研究机构（授予 Y.U.）、文部科学省世界顶级国际研究中心计划（WPI）（授予 Y.O.、Y.T.、Y.U. 和 M.L.）以及日本雀巢营养理事会（授予 M.L.）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
4针插头HiroseA3B-4PA-2DSA(71)
氨苄青霉素明治制果
模数转换器ContecAD16-16U(PCIEV)
咖啡因SigmaC0750
硬质合金切削刀具MinitorB1055
压接外壳HiroseDF11-4DS-2C
压接插座HiroseDF11-30SC
牙科水泥（Toughron Rebase）Miki Chemical Product
环氧粘合剂Konishi#16351
FFC/FPC连接器本田通信工业FFC-10BMEP1(B)
扁平电缆日立电线20528-ST LF
瞬干胶（Aron Alpha A）东曹N/A
美洛昔康勃林格殷格翰N/A
戊巴比妥协和化学工业N/A
信号放大器BiotexN/A
睡眠记录舱APLN/A
SleepSign软件Kissei ComtecN/A用于脑电图/肌电图记录/分析
滑环BiotexN/A
不锈钢螺钉山崎N/Aφ1.0 × 2.0
不锈钢导线Cooner WireAS633

参考文献

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