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方法文章

高灵敏度检测方法用于测量沙粒病毒与细胞的结合

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DOI：

10.3791/53682

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2016年3月2日

 , 
1Department of Medicine, Division of Immunobiology, University of Vermont, 2Department of Microbiology & Molecular Genetics, University of Vermont

本文内容

摘要

沙粒病毒生命周期的第一步是病毒颗粒与宿主细胞的结合。我们报告了一种基于定量（q）RT-PCR 的检测方法，可用于超灵敏地检测和定量沙粒病毒的结合事件。

摘要

沙粒病毒是一类包膜RNA病毒，可引起严重的人类疾病。沙粒病毒生命周期的第一步是病毒颗粒与宿主细胞的附着。虽然可通过使用生物素、放射性同位素或荧光染料标记的病毒颗粒来检测病毒与细胞的结合，但这些方法通常需要较高的感染复数（MOI）才能检测到结合的病毒。本文介绍一种基于定量（q）RT-PCR的检测方法，通过定量病毒颗粒包裹的病毒基因组RNA来测量胡宁病毒Candid 1株的附着能力。该方法具有多个优势，包括极高的灵敏度，能够在较宽的MOI动态范围内进行附着检测，且无需纯化或标记输入病毒。重要的是，通过使用病毒特异性的qRT-PCR试剂，该方法可轻松调整用于其他病毒的研究。此外，该检测方法还可进行修改，以用于检测病毒颗粒的内吞作用及基因组脱壳过程。总之，本文描述了一种简单而稳健的检测方法，可用于高灵敏度地测量沙粒病毒与细胞的附着过程。

引言

沙粒病毒是一类有包膜的单股RNA病毒，在自然界中主要以啮齿类动物为宿主1-3。尽管这些病毒在啮齿类宿主中通常引起无症状的持续性感染1,2，但可在人类中引发严重疾病3。重要的致病性病毒包括新大陆的胡宁病毒（Junin virus, JUNV）4和旧大陆的拉沙病毒（Lassa virus）5，它们分别是南美洲阿根廷出血热和非洲拉沙热的病原体。淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）是该病毒家族的原型病毒6，具有全球分布，可导致多种疾病状态，包括在免疫功能正常个体中引起无菌性脑膜炎6、在发育中的胎儿中导致严重先天性缺陷7，或在实体器官移植后免疫抑制个体中引发高致死率感染8,9。目前尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗或有效的抗病毒药物用于防治这些病毒，凸显了开发新型治疗策略以靶向这些新发或再发病原体的迫切需求。

沙粒病毒基因组由两条单链RNA片段组成，即大（L）片段（约7.2 kb）和小（S）片段（约3.6 kb）10。S片段编码病毒核蛋白（NP）和包膜糖蛋白（GP），而L片段编码病毒聚合酶（L）和基质蛋白（Z）。L和S基因组RNA片段（vRNA）被包装进病毒粒子中10-12。沙粒病毒感染的初始步骤是病毒颗粒通过其GP与宿主细胞受体之间的相互作用附着于宿主细胞，对于JUNV而言，其受体包括人转铁蛋白受体1（hTfR1）13,14。附着后，JUNV颗粒通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞15。随后，病毒颗粒被转运至晚期内体，在此酸性环境触发GP的活化16,17。GP活化后，其编码的融合肽插入内体膜，启动病毒膜与内体膜的融合。成功融合后，病毒粒子所携带的vRNA被释放到细胞质中，作为基因组复制和转录的模板。当病毒结构蛋白和vRNA积累到足够数量时，新的病毒颗粒在感染细胞内组装并出芽，完成其生命周期18。

为了促进发现治疗性靶向致病性沙粒病毒的新策略，我们的研究团队一直致力于鉴定对病毒增殖至关重要但对宿主非必需的宿主因子。在此背景下，明确这些宿主因子所调控的病毒生命周期的具体阶段，对于指导抗病毒策略的开发至关重要。本文中，我们描述了一种基于定量（q）RT-PCR的检测方法，可用于测量沙粒病毒与细胞的结合，以确定所选的宿主蛋白和/或抗病毒分子是否影响病毒入侵的这一初始阶段19。已有其他方法用于检测沙粒病毒与细胞的结合，例如使用生物素20、荧光染料21或放射性同位素22标记的病毒颗粒。这些方法的局限性可能包括需要大量输入病毒（例如，高感染复数（MOI））、使用放射性物质，和/或需要额外的操作步骤来制备输入病毒（例如，病毒的浓缩和/或标记）。特别是，使用高MOI会使得难以区分有效结合与非有效结合事件15,23。本文所述的基于qRT-PCR的检测方法仅需低至20个空斑形成单位（PFUs）的病毒即可检测结合事件，相当于在48孔板中MOI为0.0004。因此，该检测方法的高灵敏度克服了对高MOI的需求，也无需进行病毒标记或浓缩步骤。此外，该检测方法还可：i）经调整后用于测量病毒颗粒的内吞作用，以及融合后病毒基因组释放到细胞质的过程；ii）通过开发病毒特异性的qRT-PCR试剂，适配于其他病毒的研究（示例见24-27）。

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方案

注意：必须严格遵循PCR前技术进行所述实验操作（有关如何建立PCR前实验室以及如何采用良好的PCR前技术开展实验的详细概述，请参见28）。所有试剂和设备必须不含含有qPCR目标序列的扩增DNA，并应设置适当的对照以检测此类污染。本实验方案的总体流程见图1。

1. 准备培养基并将细胞接种至48孔板

  1. 通过向500 ml的DMEM培养基中加入50 ml热灭活的胎牛血清以及各5 ml的100倍浓缩青霉素-链霉素溶液和100倍浓缩HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸）缓冲液，配制500 ml含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% HEPES缓冲液的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。该试剂可在4 °C保存数月。
  2. 在48孔组织培养板中，每孔接种2.5 × 104个Vero E6细胞，最终体积为500 µl完全DMEM。将培养板置于含5% CO2的湿润培养箱中，37 °C孵育10至18小时。
    1. 在工作日结束前完成接种。每个病毒样本设两到三个复孔进行检测。
      注意：虽然本实验描述的是基于48孔板的平台，但也可将实验规模缩小，适用于96孔或384孔板。

2. 进行病毒-细胞吸附

注意：本方案中使用的病毒为JUNV Candid #1（C#1）毒株，已被成功用作减毒活疫苗以预防JUNV所致疾病29JUNV C#1 是通过在毒力较强的 JUNV 毒株 XJ 中连续传代获得的 体内 和 体外 与亲本XJ株相比，存在12个氨基酸的差异30由于JUNV C#1属于生物安全等级（BSL）-2级病原体，本节所述工作必须在符合相应BSL-2级防护规范的条件下进行31。这包括使用个人防护装备（例如 眼部防护、实验服、双层手套）、II级生物安全柜，并确保所有人员均已接受机构规定的培训并获得相应批准，能够安全操作该生物体。

  1. 将待检测的JUNV C#1样本用预冷的完全DMEM稀释至所需的PFU或焦点形成单位，并置于冰上保存，直至准备加入各孔。
    注意：除了使用完全DMEM稀释病毒进行结合实验外，也可选用含磷酸盐缓冲液（PBS）的最低限度培养基，其中血清浓度较低（2%），并添加适当的缓冲体系，以评估血清是否可能干扰病毒的吸附。已有文献报道，针对其他病毒的类似吸附实验采用不含碳酸氢盐的RPMI 1640培养基，其中添加0.2%牛血清白蛋白、10 mM (2-吗啉代)乙磺酸（MES）和10 mM HEPES，pH 6.832。此类结合用培养基可能更优，可防止在将培养基移出培养箱的CO2环境时发生pH变化。
    1. 每孔接种200至2,000 PFU范围内的病毒，以限制非特异性吸附事件。如图2所示，本实验方法最低可检测到20 PFU（最高可达2 × 106 PFU）的病毒吸附。
    2. 制备用于接种细胞的病毒母液混合物。每个病毒样本将以50 µl/孔的体积接种至两个重复孔中。因此，若每孔需加入2,000 PFU病毒，则应将4,800 PFU病毒稀释于总共120 µl的预冷完全DMEM中。
      1. 为控制实验特异性，可使用一对匹配的中国仓鼠卵巢（CHO）细胞系，其中一种不表达转铁蛋白受体1（TfR1，TRVb），另一种表达人源TfR1（hTfR1，TRVb-1），因为JUNV在这两类细胞上的吸附应分别表现为降低或不受影响13,33。或者，可用蛋白酶（如蛋白酶K）处理细胞，以阻止沙粒病毒的吸附34或进入35。此外，可考虑使用可溶性hTfR1或特异性识别hTfR1的单克隆抗体ch128.1，已知二者均可阻断JUNV进入细胞13,36。另外，预先用游离甘露糖处理细胞14，或用JUNV特异性中和抗体孵育病毒颗粒37，也可抑制病毒进入。
      2. 然而需注意的是，尽管这些试剂和方法能够阻断JUNV进入细胞，但尚未被证实可直接阻断病毒吸附，尽管这可能是其作用机制之一。本文所述方案可用于正式验证这些干预手段是否影响病毒颗粒的吸附过程。
  2. 从37 °C培养箱中取出培养板，置于4 °C冰箱或冰上15分钟，以抑制细胞的内吞能力。
  3. 随后吸除各孔中的完全DMEM，迅速用100 µl预冷的PBS（磷酸盐缓冲液，pH 7.4）洗涤每孔两次，然后向相应孔中加入50 µl预先稀释好的病毒样本（按步骤2.1制备）。
  4. 用封口膜包裹培养板，立即放回冰上或置于4 °C冰箱中孵育1至1.5小时，以允许病毒吸附发生。在此期间，始终保持培养板、洗涤缓冲液和病毒样本处于4 °C低温状态。
  5. 完成4 °C孵育后，吸除病毒接种液，并用200 µl预冷PBS洗涤每孔3次。

3. 病毒RNA提取

  1. 使用商用试剂盒从附着于单层细胞的JUNV C#1颗粒中纯化病毒RNA例如，RNeasy Mini 试剂盒）的说明书进行操作。具体而言，遵循以下步骤 "使用离心柱技术从动物细胞中纯化总RNA的实验方案" 见《RNeasy Mini 手册》第23-28页（4th 第2版，2006年4月）并作如下修改。
    1. 按照步骤1B的指示，将350 µl裂解缓冲液RLT直接加入每个孔中以裂解细胞。反复吹打数次以确保细胞充分裂解。注意，细胞在此缓冲液中易于裂解，可通过倒置显微镜观察各孔来确认裂解是否完全。
    2. 将所得的细胞裂解液转移至试剂盒柱（步骤3a），并按照说明书其余步骤操作。此时病毒已被裂解缓冲液灭活，因此只要试剂盒管壁未被感染性病毒污染，后续步骤可在II级生物安全柜外进行。
    3. 包括制造商说明书中的可选步骤9，即对离心柱进行额外离心，以彻底去除任何可能残留的RPE缓冲液。
    4. 在最后一步（制造商方案的第10步），使用30 µl无核酸酶的ddH₂O从离心柱中洗脱纯化的RNA。2O. 此时可将RNA在-80 °C保存，或直接用于qRT-PCR检测。为防止核酸酶降解纯化的病毒RNA样本，应使用无核酸酶的试剂和设备，并将解冻后的RNA样本置于冰上。
      注意：RLT 缓冲液和 RW1 缓冲液含有胍盐，不得与漂白剂混合。RW1 缓冲液含有乙醇。

4. 病毒基因组的qRT-PCR检测

  1. 将JUNV C#1 S片段RNA（步骤3.1.4中制备）进行反转录，总体积为50 µl，以生成cDNA用于后续qPCR。
    1. 为了建立逆转录反应，首先配制主混合液，每反应体系中包含以下试剂：6.75 µl 无核酸酶的ddH₂O2O，加入5 µl浓度为2 µM的RT引物S 2098-至2075-（5'-AAGGGTTTAAAAATGGTAGCAGAC-3'），该引物与S片段基因组RNA的NP区域互补，5 µl 10X PCR缓冲液II，11 µl 25 mM MgCl₂2 溶液，1.25 µl（62.5 Units）逆转录酶，1 µl（0.4 Units）RNase抑制剂，以及10 µl 500 µM的dNTP储存液。
      注意：在沙粒病毒复制过程中，会产生4种病毒S片段RNA：全长基因组RNA（vRNA）、全长抗基因组RNA（vcRNA）（即vRNA的反向互补链），以及分别编码NP和GP基因的两种亚基因组mRNA。此处列出的RT引物仅特异性针对S片段vRNA，而不针对vcRNA、NP mRNA或GP mRNA。
    2. 轻轻混匀反转录主混合液，然后将40 µl分装至各个0.2 ml PCR管中。每管加入10 µl病毒RNA。包括i）无模板对照管（例如 加入10 µl无核酸酶的ddH₂O20 至 40 µl 主混合液）以及 ii) 无逆转录酶对照（例如 加入10 µl已知阳性的病毒RNA样本至40 µl未添加逆转录酶的主混合液中，以检测逆转录试剂是否被含有病毒靶序列的扩增DNA污染。同时，将从未感染细胞中提取的RNA加入完整的逆转录主混合液中，以对照细胞RNA存在条件下检测方法的特异性。
    3. 此外，向完整的预混液中加入一份已知的阳性病毒RNA样本，以验证逆转录试剂的质量。注意，如有需要，可将逆转录反应体系体积减少至25 µl。
  2. 将RT反应管置于以下循环条件下：25 °C孵育10分钟，48 °C孵育30分钟，95 °C孵育5分钟。注意，此时样品可于-20 °C保存，或在热循环仪中添加4 °C步骤后过夜放置。
  3. 在总体积为25 µl的体系中进行qPCR。
    1. 将以下组分混合配制qPCR预混液：正向PCR引物S1937+至1958+（5'-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3'）2.5 µl（9 µM母液），反向PCR引物S2001-至1982-（5'-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3'）2.5 µl（9 µM母液），qPCR探针S1960+至1975+（5'-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3'）2.5 µl（2 µM母液），以及2X通用qPCR预混液12.5 µl。请注意，本文所报道的正向引物特异性针对JUNV C#1，与最初报道的引物序列相比存在1个核苷酸的差异38，该疫苗靶向强毒力的JUNV毒株Romero。
    2. 轻轻混匀溶液，然后向每个qPCR孔中加入20 µl。将每份RT反应产物5 µl加入相应的qPCR孔中。每个样本的qPCR实验设三个重复。注意，如有需要，PCR反应体系体积可减少至12.5 µl。
      注意：qPCR 仪器配套软件将通过将每个未知样本的值与一系列编码 JUNV C#1 NP 基因的质粒标准品稀释液进行比较，从而生成 JUNV C#1 S 片段基因组 RNA 的绝对拷贝数，该 NP 基因为 qPCR 引物和探针组的靶标。qPCR 检测仅能对落在标准曲线范围内的数值提供定量结果。因此，需设置以下质粒量（每组三个复孔）：5、50、5 × 103，5 × 105，以及 5 × 107 每孔拷贝数
  4. 将qPCR板放入热循环仪中，并运行以下反应程序：95 °C预变性10 min，随后进行40个循环，每个循环为95 °C变性15 sec，60 °C退火延伸1 min。
    1. 根据制造商说明书收集和分析数据，以确定每个样本中病毒RNA的含量。
  5. 使用含有qPCR目标序列的 newly purified 质粒样本建立标准曲线时，首先确定该溶液中质粒的拷贝数。
    1. 计算质粒的分子量。如果已知质粒的完整序列，可使用以下公式进行计算：MW = ([A × 312.2] + [G × 328.2] + [C × 288.2] + [T × 303.2] - 61.13)。请注意，需包含双链质粒每条链上特定核苷酸的总数。
    2. 如果质粒的大小已知但其确切序列未知，可假设每对双链DNA碱基的分子量为600，据此计算其分子量。
      注意：此处使用的 pCAGGS-JUNV C#1 NP 质粒分子量为 4.2 x 106.
    3. 确定质粒的分子量（MW）后，计算质粒储备液中每微升（µl）所含的拷贝数。
    4. 首先计算溶液中质粒的总微克数，然后将其转换为质粒的摩尔数（例如 如果300 µl水中含有69 µg质粒，则6.9 x 10-5 质粒克数 × 1 摩尔 / 4.2 × 106 质粒质量（g）= 1.6 × 10-11 质粒的摩尔数），可转换为拷贝数（例如 1.6 × 10-11 质粒的摩尔数 × 6.022 × 1023 分子/摩尔 = 9.8 × 1012 分子（或拷贝数）
    5. 将质粒溶液中质粒的总拷贝数除以该溶液的体积，得到每微升（µl）的拷贝数例如 9.8 × 1012 拷贝数/300 µl = 3.28 × 1010 拷贝。
    6. 将该溶液适当稀释，以便将5 µl体积加样至PCR板中，从而提供建立标准曲线所需的拷贝数范围。

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结果

为了验证qPCR检测方法的灵敏度和动态范围，将已知数量的编码JUNV C#1株NP基因的质粒（范围为5-5×107 拷贝）按照方案第4节所述进行qPCR检测。该检测方法具有高灵敏度，可稳定检测低至5个拷贝的目标核酸（图2）。此外，该方法的动态范围较宽，如图2所示，可覆盖至少7个数量级的模板浓度。尽管未在图中显示，我们已成功检测到高达5×109 拷贝的核酸。

为说明该检测方法在测量 JUNV C#1 病毒颗粒吸附方面的实用性，按照方案所述，将不同数量的 JUNV C#1 预先与 Vero E6 细胞结合。洗去未结合的病毒颗粒后，裂解细胞以提取 RNA，所得 RNA 样品进行 qRT-PCR 分析。如图 3所示，该检测方法可检测到低至 20 PFU 或高至 2 × 106 PFU 的病毒吸附...

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讨论

我们所描述的实验方案简单且可靠，但需遵循以下关键注意事项。首先，必须严格遵守PCR前操作技术（详见参考文献28中的优秀综述）。所有试剂和设备必须不含含有qPCR靶序列的扩增DNA，并应设置适当的对照以检测此类污染。其次，在病毒-细胞结合实验步骤中，病毒、细胞和培养基必须始终保持在4 °C，以防止表面结合的病毒颗粒被内吞。第三，用于RNA提取的细胞数量不得超过RNA纯化滤膜的RNA结合容量。第四，纯化的病毒RNA样品必须通过使用无核酸酶试剂和设备，并在解冻后置于冰上，以防止核糖核酸酶介导的降解。第五，qPCR检测中包含的标准曲线范围必须足够宽，以涵盖所有未知样品中观察到的数值。第六，应对实验的病毒-细胞结合部分以及各个RNA样品的qPCR检测均设置技术重复。第七，可引入对照（例如表达或不表达hTfR1的细胞系），以控制实验的特异性。最后，所有操作人员必须接受适当的生物安全培训，并获得机构批准，方可操作具有感染性的JUNV C#1或其他致病性沙粒病毒。

该方案的qPCR部分主要采用qPCR探针，以确保PCR反应各阶段扩增产物的特异性。然而，可通过...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

我们感谢Markus Thali、Nathan Roy、Christopher Ziegler、Emily Bruce和Benjamin King提供的有益讨论，以及美国国立卫生研究院通过资助项目T32 AI055402（JK）、R21 AI088059（JB）和P20RR021905（JB）对本研究提供的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEMLife Technologies11965-118
青霉素-链霉素Life Technologies15140-163100倍浓度
HEPES 缓冲液Life Technologies15630-130100倍浓度
PBS pH 7.4Life Technologies10010-0231倍浓度
Vero E6 细胞美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection）CRL-1586
Costar 48 孔板Corning3548
RNeasy 小量试剂盒Qiagen74106切勿将 RLT 或 RW1 缓冲液与漂白剂混合
QIAshredder 匀浆器Qiagen79654
TaqMan 通用 PCR 主混合液Life Technologies4326614
多转录酶逆转录酶（50U/µl）Life Technologies4311235
dNTP 混合液（10 mM；每种 dNTP 2.5 mM）Life TechnologiesN808-0260
GeneAmp 10X PCR 缓冲液 II 与 25 mM MgCl2 溶液Life TechnologiesN808-0010
RNase 抑制剂（5000U/100 µl）Life TechnologiesN808-0119
RT 引物 5’-AAGGGTTTAAAAAT
GGTAGCAGAC-3’		Integrated DNA Technologies250 nmol DNA 寡核苷酸标准脱盐
qPCR 正向引物  5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’Life Technologies4304971标准脱盐
qPCR 反向引物 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’Life Technologies4304971标准脱盐
TaqMan 探针 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’Life Technologies4316033HPLC 纯化
MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（0.1 mL）Life Technologies4346906
StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统Life Technologies4376598或其他 qPCR 仪器

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