沙粒病毒生命周期的第一步是病毒颗粒与宿主细胞的结合。我们报告了一种基于定量（q）RT-PCR 的检测方法，可用于超灵敏地检测和定量沙粒病毒的结合事件。
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本文内容
摘要
摘要
沙粒病毒是一类包膜RNA病毒，可引起严重的人类疾病。沙粒病毒生命周期的第一步是病毒颗粒与宿主细胞的附着。虽然可通过使用生物素、放射性同位素或荧光染料标记的病毒颗粒来检测病毒与细胞的结合，但这些方法通常需要较高的感染复数（MOI）才能检测到结合的病毒。本文介绍一种基于定量（q）RT-PCR的检测方法，通过定量病毒颗粒包裹的病毒基因组RNA来测量胡宁病毒Candid 1株的附着能力。该方法具有多个优势，包括极高的灵敏度，能够在较宽的MOI动态范围内进行附着检测，且无需纯化或标记输入病毒。重要的是，通过使用病毒特异性的qRT-PCR试剂，该方法可轻松调整用于其他病毒的研究。此外，该检测方法还可进行修改，以用于检测病毒颗粒的内吞作用及基因组脱壳过程。总之，本文描述了一种简单而稳健的检测方法，可用于高灵敏度地测量沙粒病毒与细胞的附着过程。
引言
沙粒病毒是一类有包膜的单股RNA病毒，在自然界中主要以啮齿类动物为宿主1-3。尽管这些病毒在啮齿类宿主中通常引起无症状的持续性感染1,2，但可在人类中引发严重疾病3。重要的致病性病毒包括新大陆的胡宁病毒（Junin virus, JUNV）4和旧大陆的拉沙病毒（Lassa virus）5，它们分别是南美洲阿根廷出血热和非洲拉沙热的病原体。淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒（Lymphocytic choriomeningitis virus, LCMV）是该病毒家族的原型病毒6，具有全球分布，可导致多种疾病状态，包括在免疫功能正常个体中引起无菌性脑膜炎6、在发育中的胎儿中导致严重先天性缺陷7，或在实体器官移植后免疫抑制个体中引发高致死率感染8,9。目前尚无美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗或有效的抗病毒药物用于防治这些病毒，凸显了开发新型治疗策略以靶向这些新发或再发病原体的迫切需求。
沙粒病毒基因组由两条单链RNA片段组成，即大（L）片段（约7.2 kb）和小（S）片段（约3.6 kb）10。S片段编码病毒核蛋白（NP）和包膜糖蛋白（GP），而L片段编码病毒聚合酶（L）和基质蛋白（Z）。L和S基因组RNA片段（vRNA）被包装进病毒粒子中10-12<....
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方案
注意：必须严格遵循PCR前技术进行所述实验操作（有关如何建立PCR前实验室以及如何采用良好的PCR前技术开展实验的详细概述，请参见28）。所有试剂和设备必须不含含有qPCR目标序列的扩增DNA，并应设置适当的对照以检测此类污染。本实验方案的总体流程见图1。
1. 准备培养基并将细胞接种至48孔板
- 通过向500 ml的DMEM培养基中加入50 ml热灭活的胎牛血清以及各5 ml的100倍浓缩青霉素-链霉素溶液和100倍浓缩HEPES（N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸）缓冲液，配制500 ml含10%胎牛血清、1%青霉素-链霉素和1% HEPES缓冲液的完全杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）。该试剂可在4 °C保存数月。
- 在48孔组织培养板中，每孔接种2.5 × 104个Vero E6细胞，最终体积为500 µl完全DMEM。将培养板置于含5% CO2的湿润培养箱中，37 °C孵育10至18小时。
- 在工作日结束前完成接种。每个病毒样本设两到三个复孔进行检测。
注意：虽然本实验描述的是基于48孔板的平台，但也可将实验规模缩小，适用于96孔或384孔板。
- 在工作日结束前完成接种。每个病毒样本设两到三个复孔进行检测。
2. 进行病毒-细胞吸附
注意：本方案中使用的病毒为JUNV Candid #....
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结果
为了验证qPCR检测方法的灵敏度和动态范围，将已知数量的编码JUNV C#1株NP基因的质粒（范围为5-5×107 拷贝）按照方案第4节所述进行qPCR检测。该检测方法具有高灵敏度，可稳定检测低至5个拷贝的目标核酸（图2）。此外，该方法的动态范围较宽，如图2所示，可覆盖至少7个数量级的模板浓度。尽管未在图中显示，我们已成功检测到高达5×109 拷贝的核酸。
为说明该检测方法在测量 JUNV C#1 病毒颗粒吸附方面的实用性，按照方案所述，将不同数量的 JUNV C#1 预先与 Vero E6 细胞结合。洗去未结合的病毒颗粒后，裂解细胞以提取 RNA，所得 RNA 样品进行 qRT-PCR 分析。如图 3所示，该检测方法可检测到低至 20 PFU 或高至 2 × 106 PFU 的病毒吸附.......
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讨论
我们所描述的实验方案简单且可靠，但需遵循以下关键注意事项。首先，必须严格遵守PCR前操作技术（详见参考文献28中的优秀综述）。所有试剂和设备必须不含含有qPCR靶序列的扩增DNA，并应设置适当的对照以检测此类污染。其次，在病毒-细胞结合实验步骤中，病毒、细胞和培养基必须始终保持在4 °C，以防止表面结合的病毒颗粒被内吞。第三，用于RNA提取的细胞数量不得超过RNA纯化滤膜的RNA结合容量。第四，纯化的病毒RNA样品必须通过使用无核酸酶试剂和设备，并在解冻后置于冰上，以防止核糖核酸酶介导的降解。第五，qPCR检测中包含的标准曲线范围必须足够宽，以涵盖所有未知样品中观察到的数值。第六，应对实验的病毒-细胞结合部分以及各个RNA样品的qPCR检测均设置技术重复。第七，可引入对照（例如表达或不表达hTfR1的细胞系），以控制实验的特异性。最后，所有操作人员必须接受适当的生物安全培训，并获得机构批准，方可操作具有感染性的JUNV C#1或其他致病性沙粒病毒。
该方案的qPCR部分主要采用qPCR探针，以确保PCR反应各阶段扩增产物的特异性。然而，可通过.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
我们感谢Markus Thali、Nathan Roy、Christopher Ziegler、Emily Bruce和Benjamin King提供的有益讨论，以及美国国立卫生研究院通过资助项目T32 AI055402（JK）、R21 AI088059（JB）和P20RR021905（JB）对本研究提供的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Life Technologies | 11965-118 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-163 | 100倍浓度 |
| HEPES 缓冲液 | Life Technologies | 15630-130 | 100倍浓度 |
| PBS pH 7.4 | Life Technologies | 10010-023 | 1倍浓度 |
| Vero E6 细胞 | 美国模式培养物集存库（American Type Culture Collection） | CRL-1586 | |
| Costar 48 孔板 | Corning | 3548 | |
| RNeasy 小量试剂盒 | Qiagen | 74106 | 切勿将 RLT 或 RW1 缓冲液与漂白剂混合 |
| QIAshredder 匀浆器 | Qiagen | 79654 | |
| TaqMan 通用 PCR 主混合液 | Life Technologies | 4326614 | |
| 多转录酶逆转录酶（50U/µl） | Life Technologies | 4311235 | |
| dNTP 混合液（10 mM；每种 dNTP 2.5 mM） | Life Technologies | N808-0260 | |
| GeneAmp 10X PCR 缓冲液 II 与 25 mM MgCl2 溶液 | Life Technologies | N808-0010 | |
| RNase 抑制剂（5000U/100 µl） | Life Technologies | N808-0119 | |
| RT 引物 5’-AAGGGTTTAAAAAT GGTAGCAGAC-3’ | Integrated DNA Technologies | 250 nmol DNA 寡核苷酸 | 标准脱盐 |
| qPCR 正向引物 5’-CATGGAGGTCAAACAACTTCCT-3’ | Life Technologies | 4304971 | 标准脱盐 |
| qPCR 反向引物 5’-GCCTCCAGACATGGTTGTGA-3’ | Life Technologies | 4304971 | 标准脱盐 |
| TaqMan 探针 5’-6FAM-ATGTCATCGGATCCTT-MGBNFQ-3’ | Life Technologies | 4316033 | HPLC 纯化 |
| MicroAmp 快速光学 96 孔反应板（0.1 mL） | Life Technologies | 4346906 | |
| StepOnePlus 实时荧光定量 PCR 系统 | Life Technologies | 4376598 | 或其他 qPCR 仪器 |
参考文献
- Childs, J. C., Peters, C. J. The Arenaviridae. Salvato, M. S. , Plenum Press. 331-373 (1993).
- Salazar-Bravo, J., Ruedas, L. A., Yates, T. L. Mammalian reservoirs of arenaviruses. Curr. Top. Microbiol. Immunol. 262, 25-63 (2002).
- Buchmeier, M. J., de la Torre, J. C., Peters, C. J., et al. Ch. 50.
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重印与许可
