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在封闭式细胞培养系统中培养人多能性干细胞和神经干细胞用于基础与临床前研究

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DOI：

10.3791/53685

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2016年6月10日

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1National Human Neural Stem Cell Resource, Childrens Hospital of Orange County Research Institute

本文内容

摘要

以下是一种在封闭式细胞培养系统中培养多能干细胞（PSC）和神经干细胞（NSC）的实验方案，该系统可实现最大程度的无菌性和可重复性，取代传统的生物安全柜和培养箱。该设备符合临床生产质量管理规范（cGMP）和临床良好实验室规范（cGLP）指南。

摘要

本文介绍如何使用一种定制生产、商业可购的封闭式细胞培养系统进行基础研究和临床前研究。生物安全柜（BSC）和培养箱长期以来一直是基础研究和临床前研究中细胞系培养与扩增的标准设备。然而，随着许多干细胞实验室的研究重点从基础研究转向临床转化，细胞培养系统需要满足更高的要求。所有操作步骤必须有完善的记录，并对无菌性和可重复性提出极高要求。在传统培养箱中，每当细胞因换液、传代或其他操作被取出时，气体浓度和温度都会发生显著波动。这类中断导致培养环境无法符合cGMP和GLP指南的标准。特别是当细胞用于治疗用途时，必须尽可能减少此类干扰。从传统的生物安全柜与培养箱系统转向封闭式系统的主要动机在于，此类干扰在封闭系统中可降至几乎可以忽略的程度。封闭式系统为细胞培养的换液与操作提供一个工作空间，同时将细胞维持在温度和气体浓度均保持恒定的受控环境中。通过这种方式，多能性和多能干细胞可以从分离之初直至最终用于治疗的整个过程中，始终维持在最佳健康状态。

引言

标准的干细胞培养技术存在多种环境限制，这些限制会对细胞造成过度的压力，并使细胞暴露于不可接受的污染风险之中。在标准细胞培养条件下，细胞可能经历的应激之一是二氧化碳和氧气浓度水平的急剧变化3,4。当细胞从培养箱转移至生物安全柜和/或显微镜时，就会发生这种情况，而这些环境可能并不适合细胞生长。先前的研究已证实，在低氧条件下培养多能干细胞和神经干细胞具有多种优势4,11，而要获得最佳效果，这些低氧条件需要持续维持。此外，在细胞培养和操作的几乎每一个步骤中，实验室环境和人员都会对细胞造成干扰，从而增加细胞污染的风险。传统的洁净室虽是有效降低污染风险的一种方法，但其成本高昂、占用空间大，且无法解决与二氧化碳和氧气浓度相关的应激因素。

一种能够同时应对污染风险和气体浓度问题，并且可被认证符合cGMP标准9的细胞生产设施，可为基础科学研究以及临床应用1,6,7提供高质量的细胞。此类细胞生产设施至少包括以下组成部分：一个作为加热工作空间的工艺舱，用于细胞培养物的喂养和操作；一个层流罩，用于试剂、试管和工具的初始灭菌；两个位于层流罩与工艺舱之间的缓冲气闸舱；两个可从工艺舱进入的细胞培养孵育箱；一个毗邻工艺舱的显微镜舱；以及最后用于设定和监控各模块内环境条件的计算机软件。利用这一基本基础设施，可开展多种多样的操作，例如多能干细胞和多能神经干细胞的标准喂养与传代，以及诸如基于仙台病毒的重编程、体外迁移研究和用于电生理学表征的神经干细胞分化等更专业的实验方法。

方案

1. 初始设置

  1. 设定气体和温度浓度
    1. 使用软件，单击 "访客" 位于图形界面左上角的标签。使用指定的用户名和密码登录系统。确保每位用户都有各自的用户名和密码。
    2. 单击模块以进行调整（图1）。在显示当前设置的新窗口中，点击现有的 O2 设定点值以下 "设定点" 并输入所需的 O2 此模块的浓度水平。输入5% O₂2 如果多能干细胞将在本模块中进行培养或操作，且氧气浓度为9% O₂2 如果神经干细胞将被培养或操作，请点击绿色对勾以确认设定值。
      注意：两个模块无法调节气体：层流罩和显微镜室。层流罩内的气体浓度为大气浓度，而显微镜室内的气体浓度由操作室内的气体浓度被动维持。
    3. 对 CO 重复此步骤2. 设定一个5% CO的设定点2 除缓冲室仅可调节氧浓度外，其余模块均可调节2.
    4. 监测当前的气体浓度，这些浓度被标记为 "过程值"，以确保它们达到新的设定值。
    5. 调节所有模块的气体设定值至适当数值。匹配 CO2 和 O2 将相互连通的腔室调节至相同水平。例如，将工艺腔室调节至5% O₂2 在打开培养细胞的5% O₂培养箱之前2. 同时调节至5% O₂2 在此期间用于向工艺腔室中添加物品的任何缓冲腔室。
    6. 将工艺室温度设置为 37 °C，使用与调节气体相同的界面。同时将工艺室底板温度设置为 37 °C。
    7. 点击每个培养箱下方的孵育模块组，将模块组的温度调节至 37 °C。
  2. 缓冲室的操作
    1. 收集完成指定任务（喂养、传代、染色）所需的全部用品 等等。在操作开始时即做好准备，以避免工作流程延误。所有物品均需大量喷洒70%乙醇，并在超净台内晾干。切勿直接喷洒细胞培养瓶或培养板，应使用浸透70%乙醇的无菌纱布轻轻擦拭。
    2. 确保缓冲室的外门和内门均已牢固关闭，然后打开外侧门，将物品放入其中。
    3. 关闭外门。在软件中选择缓冲模块，点击稀释因子选项卡。在对数因子框中输入1。点击开始。
      注意：A "稀释倍数" 定义为缓冲模块的气氛将被抽真空，并用洁净的、经HEPA过滤的气体置换1次。
    4. 一旦图形界面停止闪烁 "稀释倍数"打开缓冲室的内门，将材料送入工艺腔室内部。
      注意：切勿让内门和外门同时打开，并且当缓冲室尚未进行稀释因子处理时，不得打开内门。
    5. 为从工艺腔室中取出物品，首先确保缓冲腔室已完成稀释处理。然后打开内门，将待取出的物品放入其中，关闭内门。随后打开外门，取出物品。
      注意：打开外门之前无需运行稀释因子。

2. 细胞的接种与培养

  1. 培养箱设置
    1. 在每个培养箱底部的水盘中放置3个培养皿。向这些培养皿中加入无菌水。切勿直接向水盘中加水。需维持培养皿中的水位，因为这对保持培养箱内相对湿度（RH）设定值至关重要。
    2. 在图形界面中点击培养箱。点击设定值下的相对湿度（RH）现有数值，输入85%。点击绿色对勾以确认该数值。
  2. 细胞生产设施的细胞准备
    1. 若尚未完成，请调整缓冲室、操作室及培养箱的气体设定值，以满足所引入细胞类型的需要。
    2. 使用无菌纱布和非易燃消毒剂清洁操作室表面。切勿使用任何含过氧乙酸的消毒剂，因为在密闭系统中，其强烈且持久的蒸气对哺乳动物细胞具有毒性。应使用基于苯扎氯铵的产品。
    3. 继续进行消毒。清洁常接触的手套和表面，例如门把手。应彻底但少量使用消毒剂，因为操作室内过多液体将增加湿度、导致冷凝并可能促进微生物生长。
    4. 用70%乙醇清洁超净工作台和缓冲室表面，并使其自然干燥。将细胞培养瓶或培养板（本例中为PSCs或NSCs）放入超净台内，并用浸透乙醇的无菌纱布快速擦拭其外表面。
    5. 将培养瓶或培养板放入缓冲室，并运行稀释因子程序（步骤1.2.3）。
    6. 稀释因子程序完成后，立即将培养瓶或培养板转移至相应培养箱。由于培养箱位于操作室后部，可将搁板拉出至操作室内以便放置细胞。应避免不必要或长时间打开培养箱门，因为操作室空气相较于培养箱极为干燥，会导致培养箱内湿度显著下降。
  3. 细胞培养换液
    1. 准备培养基组分、血清移液管、电子移液器、纱布和消毒剂。同时准备一个用于盛装废弃细胞培养基的废液容器，但切勿加入漂白剂。通过缓冲室将上述材料带入操作室，方法如第1.2节所述。在操作室内配制细胞培养基，方法如前所述9,10（另见材料表）
    2. 合理摆放物品，以获得最佳操作空间。避免将暂不使用的物品放置在操作室中央。
    3. 将培养基容器略微松盖，使其与系统内的CO2和O2水平达到平衡。某些PSC培养基制造商建议不要在37 ºC下预热培养基；若如此，请使用缓冲室进行平衡。让培养基平衡20分钟。
    4. 使用合适的血清移液管和电子移液器吸除孔中的旧培养基。对于PSCs，仅保留少量旧培养基，以防止换液过程中细胞干燥；对于NSCs，移除一半旧培养基。将废液移入废液容器中。
    5. 将使用过的移液管放回原包装内，并移至操作室一侧，或放入指定用于废弃物清除的缓冲室。使用新的无菌血清移液管向细胞培养板中加入新鲜培养基，并将培养板放回指定的培养箱中。
    6. 换液结束后，将消毒剂喷洒在纱布上，彻底清洁操作室的地面和门把手。若系统中同时培养多种细胞系，在更换不同细胞系之间应进行灭菌处理，以最大限度降低交叉污染风险。
    7. 操作完成后，通过任一缓冲室清除废弃物或其他不需要的物品。

3. 细胞培养物的传代

  1. PSCs 或 NSCs 的酶法传代
    1. 收集传代所需的所有物品，包括培养基、酶或非酶细胞解离缓冲液（后者仅用于神经干细胞）、DPBS、培养板或培养瓶、细胞外基质（ECM）、锥形管和血清移液管。通过缓冲舱将这些物品带入系统。
    2. 按照先前所述方法，用ECM包被新鲜的培养板或培养瓶9,10某些细胞外基质（ECM）——例如来源于小鼠肉瘤细胞系的ECM——仅在4至15 °C之间呈液态，因此在加热的操作舱内操作时，应使用无菌冰块或冰袋保持ECM低温。
    3. 用移液器吸除培养物中的旧培养基，并弃置于废液容器中。
    4. 使用 1 ml DPBS/孔冲洗孔板或烧瓶表面，并弃去 DPBS。
    5. 每孔加入1 - 2 ml温热的酶溶液。仅细胞密度极高的培养物需要加入2 ml。
    6. 立即将培养皿或培养瓶转移至显微镜观察室，仔细观察细胞状态。注意观察是否有单个细胞开始从培养皿表面松脱的迹象。在细胞尚未完全悬浮之前，即应进行下一步操作，切勿等待细胞完全脱落悬浮。
    7. 将细胞放回主培养室。使用5 ml血清移液管，每1 ml酶加入4 ml DPBS，然后用力吹打混匀，使细胞从孔壁上脱落。若在多孔板中对多个孔进行传代，应在使各孔细胞脱落前，先向每个孔中加入DPBS。
    8. 将酶和PBS细胞悬液转移至适当大小的锥形管中。
    9. 如果细胞制备实验室没有离心机，应将锥形管严密封闭后放入缓冲间，并关闭密封门。
    10. 从层流侧的缓冲室中取出锥形管，在室温下以100 × g离心5分钟。
    11. 用70%乙醇喷洒锥形管，并通过缓冲室和稀释因子将其带入操作室。
    12. 吸去上清液，将细胞重悬于 2 ml PSC 或 NSC 培养基中。若传代 PSCs，需在培养基中加入 ROCK 抑制剂，浓度为 10 µM，具体操作如前所述。9,10.
    13. 使用血细胞计数板对细胞进行计数，并确定所需的孔板数量。以每孔 5 × 10⁵ 个细胞的密度接种 PSC。4 - 1 × 105 细胞/厘米²2以1:2的比例传代神经干细胞。
      注意：神经干细胞（NSCs）常出现聚团现象，难以在血细胞计数板中准确计数。
    14. 如果需要对细胞进行冷冻保存，请遵循相应的操作规程9,10，但需确保所有耗材和冻存培养基已预先准备好并放入程序降温盒中。DMSO 在 37 ºC 下对细胞具有很强的毒性，因此操作必须迅速。将异丙醇夹套式冻存容器置于超净台内室温环境中。一旦冻存管填充并密封完毕，应立即通过缓冲室将冻存管从程序降温盒中取出。
  2. PSCs 的手动传代
    1. 确认培养物需要传代，方法如前所述8若如此，则准备新鲜的经细胞外基质包被的培养板或培养瓶，并完全更换培养基。
    2. 用无菌纱布蘸取少量不可燃消毒剂擦拭显微镜腔室，消毒剂过多会导致腔内产生过多雾气。仅需清洁手套、地面区域和载物台。将数个独立包装的200 µl或1,000 µl移液器吸头带入腔室内。
    3. 将PSC培养板移入显微镜观察室，取下盖子，并将其倒置放置在 freshly cleaned 的地面上。保持盖子朝上会使培养板底部直接暴露于气流中，增加污染风险。
    4. 拆开移液枪头，借助显微镜观察培养物，用枪头尖端挑取形态良好的菌落并分散开。
      注意：如果使用者感觉更舒适，可将移液器吸头连接至移液器上。
    5. 将盖子重新盖回培养板上，并将培养板移回处理室。
    6. 吸出新培养板中多余的细胞外基质，将旧培养板中的培养基（含有悬浮的克隆片段）转移至新培养板中。如果旧培养板中仍含有尚未准备好挑取的克隆，也需对其进行换液培养。

4. 专用培养技术

  1. 仙台病毒介导成纤维细胞重编程为多能干细胞（PSCs）
    1. 在细胞制备实验室中，将人皮肤成纤维细胞1在成纤维细胞培养基中扩增，培养基含DMEM/F12、10% 胎牛血清（FBS）和20 ng/ml FGF2，在5% O2条件下培养。使用经0.1%明胶包被的6孔培养板。
    2. 用每孔1 ml的0.25%胰蛋白酶消化细胞，使其解离，以进行病毒转导。加入1 ml成纤维细胞培养基中和胰蛋白酶活性。在200 × g条件下离心，将细胞重悬于1 ml成纤维细胞培养基中，并用血细胞计数板进行计数。
      1. 将2.0 × 105个细胞重悬于2 ml成纤维细胞培养基中，将细胞悬液加入一个经明胶包被的6孔板的1个孔中（2.1 × 104 个细胞/cm2）。将细胞放回培养箱中继续培养。
    3. 静置24小时，使细胞充分贴附于培养板底部。
    4. 将新鲜成纤维细胞培养基放入操作舱内（每孔待转导细胞加入1 ml培养基），使其与气体环境平衡。
    5. 用70%乙醇对预冷的冰盒进行灭菌，并将其置于缓冲舱中。若无商用冰盒，可使用带孔的冰袋代替。
      注意：根据转导试剂盒版本不同，通常包含3–4种不同的仙台病毒，需快速解冻，但解冻后必须立即置于冰盒中保持低温。
    6. 将病毒管下半部分浸入37 °C水浴中15秒（切勿完全浸没），随后立即用70%乙醇擦拭管外壁。将病毒管置于缓冲舱内的灭菌冰盒上，并进行稀释计算。
    7. 迅速将每种仙台重编程病毒所需体积加入已气体平衡的培养基中2。所需病毒体积由三个变量决定：细胞数量、每种病毒的滴度以及每种病毒期望的感染复数（MOI）。请参考试剂盒说明书推荐的MOI值。计算公式如下：

      [（待转染细胞数）×（感染复数）×（1,000）] /（病毒滴度）= 所需病毒体积（µl）
       
    8. 吸除待重编程细胞孔中的上清液。每孔加入含病毒的培养基1 ml。轻轻摇动培养板，注意避免液体溢出，随后将培养板放回5% O2培养箱中。
    9. 2小时后轻轻摇动培养板一次，再过2小时后重复一次。
    10. 24小时后（转导后第1天），每孔加入1 ml多能干细胞培养基进行换液。第2天重复此操作，但无需移除原有培养基。
    11. 第3天和第4天，更换一半培养基。
    12. 从第5天起及之后，更换全部培养基。
    13. 当出现细胞集落时，使用无菌抗体对培养物进行染色，以确认这些集落确实具有多能性，方法如前所述2。与换液操作类似，需确保含抗体的PSC培养基已在细胞制备实验室中与气体环境充分平衡。
      注意：在成功重编程的情况下，诱导多能干细胞（iPSC）集落通常在转导后约两周出现1。
    14. 当集落生长至足够大小时，使用显微镜标记，并通过机械法传代至细胞外基质（ECM）包被的培养板上，具体操作见第3.2节。
    15. 按照先前所述方法9,10，通过手动或酶解方式扩增集落。

5. 每日使用后的清洁

  1. 将所有废弃物（包括废液瓶）放入无菌缓冲室中。使用无菌纱布和非易燃消毒剂擦拭处理室表面以及所有与物品接触过的区域。
  2. 从缓冲室中清除所有固体废弃物，并丢弃至适当的废物容器中。
  3. 将废液倒入合适的废液容器中，或直接与漂白剂混合后倒入下水道。用肥皂和刷子清洗废液容器，再用70%乙醇灭菌，并通过缓冲室将其移回处理室。
    注意：不建议在系统内部使用漂白剂处理废液容器，因为漂白剂挥发的气体可能循环回流，对细胞培养造成损害。
  4. 出于卫生考虑，使用70%乙醇擦拭系统处理室前方的塑料表面，以清除使用者前额可能留下的汗液和皮肤油脂。
  5. 若处理室内已产生冷凝水，需运行稀释程序以清除冷凝。请至少预留1小时完成该过程。

6. 常规非每日任务

  1. 根据需要，使用无菌蒸馏水补充细胞培养箱中的水盘。至少每周补充一次水盘中的水。然而，蒸发速率会因培养箱门开启频率、培养液的体积以及培养箱设置的不同而有所变化。
  2. 每月一次，重新校准所有培养室中的 O2 和 CO2 设置。此操作需使用 SPAN（校准）气体，该气体含有已知浓度的 O2 和 CO2，作为参考标准。开始校准前，请确保有足够的 SPAN 气体供应。系统使用位于各模块内的专用气体传感器来检测气体浓度；因此，使用高质量的 SPAN 气体可确保传感器可靠地提供准确的气体浓度读数。
  3. 定期更换操作室和显微镜室的手套。无论系统使用频率如何，均应每 2 个月更换一次手套。安装前，需用消毒剂对新手套进行灭菌处理。更换手套后，应对操作室执行一次稀释因子运行。
    注意：当丁腈手套被拉伸覆盖在系统袖口上时，在承受物理应力和热暴露的区域容易出现小孔。这是正常且不可避免的磨损现象。
  4. 每 6 个月更换所有培养室中的注射器滤器。
  5. 一旦层流罩的初效过滤器开始显得脏污，应立即更换或清洗。
  6. 请定期查阅制造商提供的文件，了解主要部件更换的相关信息。

7. 系统清洗

  1. 若发生重大污染事件，影响到大多数细胞培养物时，应将幸存的细胞培养物移出系统，或（如有可能）转移至未受影响的培养箱中。
  2. 关闭所有腔室的气体控制，仅保留未受影响培养箱的气体供应。
  3. 拆下设备的柔性前面板，并从受污染的细胞培养箱中取出不锈钢搁架，同时取出水盘。
  4. 对培养箱搁架和水盘进行高压灭菌后，将其放回培养箱内。用70%乙醇擦拭培养箱内部表面，待乙醇完全挥发后关闭培养箱门。
  5. 用70%乙醇擦拭操作室和显微镜室的表面，并重新安装设备的前面板。
  6. 使用不可燃消毒剂擦拭设备内部表面，包括受污染的培养箱内部。保持受污染培养箱的门处于打开状态，并对操作室执行稀释程序，同时确保显微镜室的门也处于打开状态。
  7. 进行细胞培养箱的常规清洁时，需确保培养箱与操作室处于相同的气体环境条件下。打开培养箱门，将所有细胞培养皿暂时转移至操作室表面。
  8. 使用不可燃消毒剂擦拭培养箱的搁架及内部表面，待消毒剂完全挥发后，尽快将细胞培养物移回培养箱，以避免细胞培养物发生干燥。

结果

本文较为详细地描述了一个细胞生产设施，以及在封闭系统内培养细胞的独特之处。该细胞生产设施的主体部分由一套定制的封闭式细胞培养装置组成，占地面积小，可轻松安置于6 × 7.5 m2的房间内（图2）。在整个操作过程中，装置内的细胞始终不会暴露于实验室人员或外界环境。该装置包含多个模块：一个操作室、一个层流罩、位于层流罩与操作室之间的两个缓冲气闸室、两台细胞培养箱，以及紧邻操作室的显微镜观察室（图3）。整个系统由软件控制，可对环境参数进行调控和监测（图1）。运行该软件的计算机连接有不间断电源。氧气、氮气和二氧化碳通过各自的歧管系统输入系统（图4）。设备所用气体由配备两组气瓶（一组为工作组，另一组为备用组）的歧管系统供应。当工作组气瓶压力降低时，歧管系统将自动切换至备用组，同时工作人员安排更换气瓶。电力系统配备有备用发电机。

多能干细胞和神经干细胞可利用已建立的方案9在此设施中于低氧条件下培养，但需考虑新型设备带来的额外复杂性。可使用仙台病毒诱导产生多能干细胞，并利用多能性特异性抗体鉴定完全转染的克隆，随后将其分离并扩增。（图5A 和 B）从这些诱导多能干细胞（iPSCs）出发，可通过双SMAD抑制法诱导生成神经干细胞和神经元，并使用神经干细胞特异性抗体验证其表型（图5C 和 D）。

控制系统界面截图；工业设备的过程值、设定点和调谐。
图 1. 细胞生产设施的图形界面。（A）CPF 的图形表示为默认屏幕，与 图 3 所示的 CAD 图纸一致。用鼠标单击缓冲模块 1（图 1 中的 2F）可打开其控制界面（B），在此可设置 O2 值以匹配处理室（图 3 中的 3）。同样，单击处理室或培养箱 1 将分别调出其对应的控制界面（分别为 C 和 D），可在其中根据需要更改或监控参数值。请点击此处查看此图的放大版本。

实验室生物安全柜、去污室、低温储存设备、显微镜单元。
图 2. 细胞生产设施。（A）从右前方观察的系统整体视图。注意天花板上的电源和气体连接装置，以及右侧带有显微镜配件和计算机的推车。（B）层流罩，右侧可见通往缓冲模块的门。（C）工艺舱，后部可见两个培养箱（黑色门）。（D）从系统右侧观察的视图，显示显微镜和显示器，远处可见通往缓冲舱的门。请点击此处查看此图的放大版本。

带有层流罩、培养箱模块和用于细胞培养的UCPC模块的实验室设置示意图。
图3. 细胞生产设施的CAD示意图。所有进入设备的物品首先在层流罩（1）中用酒精擦拭并风干。随后，物品被转移至前缓冲模块（2F）中适宜的环境，再送入UCPC模块，即工艺舱（3）。细胞在两个培养箱（4、5）中进行培养。活细胞染色、克隆挑选、细胞形态学观察及迁移分析在UPC模块，即显微镜舱（6）中完成。最后，废弃物通过后缓冲模块（2R）排出系统。请点击此处查看该图的放大版本。

用于实验室实验的气体钢瓶装置，显示加压系统和安全配置。
图 4. 气体与电源来源。（A）CO2 气体分配系统为 4×4 配置，可为实验室内的所有培养箱供气。（B）O2 气体分配系统为 2×2 配置，仅向细胞生产设施供气。系统所用氮气由汽化器（C，位于出口标志正下方）产生，该汽化器连接至液氮分配系统（右侧），并可自动为超低温冰箱（左下）补充满液氮。该分配系统为 2×2 配置，由两对 160 L 液氮罐供气。CO2、O2 和 N2 均通过天花板上的截止阀（D）供应。该位置同时提供中央真空系统。在气体供应截止阀后方可见一对电源电缆，用于为系统供电。请点击此处查看该图的放大版本。

显示荧光的细胞培养显微图像；各图板展示不同的染色方法。
图 5. 在低氧条件下利用仙台病毒获得的多能干细胞。 （A）SC187-SF4-2I0-E3 诱导性多能干细胞（iPSCs）（命名法见 Stover 等9），10倍相差显微镜图像。（B）SC88.1-UH1-2I0 iPSCs 使用 AF-594 标记的 Tra-1-60 进行活细胞染色，培养基中稀释比例为 1:100。所有 iPSCs 均在含 5% O2 的细胞生产设施中通过仙台病毒转导获得。（C）SC68.1-UH0-2I0-M0S13-N2G6 iPSCs 分化而来的神经前体细胞（NSCs），在 5% O2 条件下培养于腔室载玻片中。细胞经 4% 多聚甲醛固定后，使用抗人 Nestin 一抗及 Alex-488 标记的二抗进行免疫染色。所有比例尺均为 100 µm。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

细胞在CPF内生长时，从培养箱转移到处理室、显微镜室再返回的过程中，其周围的氧气和二氧化碳浓度不会发生变化。确保装置内各腔室的条件与细胞取出前所在的特定培养箱条件一致至关重要。设备内部的空气持续经过高效微粒空气（HEPA）过滤，并可根据需要调节氧气和二氧化碳浓度。细胞可在人多能干细胞（PSCs）或神经干细胞（NSCs）的标准浓度下培养，分别为5%和9%；也可根据不同的细胞类型或特定实验需求选择其他浓度。因此，该设备配备了持续供应的医用级氧气、二氧化碳和氮气（图4）。这三种气体均由专用的气体歧管系统供应，以确保持续稳定的供给。设备还配备了一种校准气体混合物，成分为含10%（± 0.01%）二氧化碳的氧气。气体歧管系统安装在细胞生产设施外部，气体通过天花板管道输送至设施内部。校准气体则存放于设施内部。此外，设备还通过天花板接入中央真空系统。通过电子监控系统和无线信号发送单元，所有歧管的输出压力均被持续监测。一旦发现任何压力超出设定范围，细胞生产设施的操作人员将自动接到电话通知，以便及时采取相应措施。

该设备的电力需求由从天花板垂下的六条专用120 V电路提供，并连接至医院的备用发电机，以确保持续供电。设备的操作通过一台由不间断电源供电的基于PC的计算机上的软件进行控制。这些电力和计算机配置确保了即使在公共电网发生故障的情况下，系统仍能持续运行。控制设备的软件具有用户友好的图形界面（图1），可调节氧气和二氧化碳浓度，以及温度、湿度和舱内压力。所有这些参数的数值均被持续记录，以提供设备运行参数的实时记录。这些数据每晚自动备份至远程服务器，以确保其完整性。管理用户可通过远程方式访问计算机和软件，以评估和/或调整任意参数。此外，计算机和软件支持远程访问，便于与本地用户进行交互式参数评估和故障排查。设备另配备一个报警信号发送单元，当设备出现超出设定范围的情况时，细胞生产设施的操作人员将及时收到通知。远程访问功能还支持登录并查看超限状况的具体细节。

该装置在宏观和微观层面上均设计为模块化系统。细胞培养的各个模块，例如培养箱和处理室，可根据其尺寸、需求以及相互之间的布局进行定制。此外，各个模块的大多数控制功能本身也具有模块化特性，例如，可轻松更换独立的气体环境控制器，而不会对系统造成显著干扰。

可轻松将专用处理室（例如用于显微观察和操作细胞培养物的处理室）适配到该系统中。系统内部集成了相差显微镜和荧光显微镜（图6），可在与培养箱内相同的大气条件下对活细胞进行染色，并对细胞克隆进行解剖操作。通过处理室侧壁上的密封衬套布设电缆，可将电源、计算机等设备置于装置外部，通常放置于推车上（图6）。

细胞生产设施中的处理舱具有与传统生物安全柜不同的气流模式。在传统生物安全柜中，气流从中央排气口向下流动，并分为两个独立的气流，随后由柜体底部前部和后部的两个不同进气口吸入。相比之下，细胞生产设施的处理舱在天花板前部设有一个单一排气口。空气向下流动并朝舱体后方移动，然后被向上吸入后部的进气口。尽管细胞生产设施本身洁净度极高，但这种独特的气流模式意味着技术人员必须略微调整操作技术，以降低污染风险。与使用传统生物安全柜相同，实验人员应避免将双手置于开放的细胞培养皿和培养基瓶的上游方向。然而，在细胞生产设施中，上游方向已经发生了改变。

细胞制备设施实验室本身较为标准，配备有-20 °C 冰箱、-80 °C 冰箱、4 °C 冷藏柜、离心机和水浴锅。实验室还设有带脚控装置的水槽，便于实现免手操作。然而，要使该实验室成为功能齐全的临床细胞制备设施，仍需进行若干额外改造。首先，设备本身必须升级，以具备监测挥发性有机化合物、颗粒物以及用于去污的二氧化氯浓度的能力。其次，可设置一个包含FACS仪器的处理舱，并通过缓冲模块将其与设备其余部分连接。这将能够在适当的环境条件下对可移植细胞群体进行细胞分选和纯化。最后，整个设备必须置于软壁式洁净室中，以为设备提供符合国际标准化组织（ISO）8级标准的环境5。

CPF 的高无菌性及计算机控制特性使其成为未来细胞治疗和良好生产规范应用的理想系统。污染风险被大大降低，但更重要的是，细胞扩增过程中的各项条件均由计算机系统自动记录并存档。气体浓度、温度、湿度的变化以及所有进入系统的操作事件均被严格记录，这在调查产品质量问题时具有重要帮助。然而，该系统仍存在局限性。任何试剂和耗材的使用（例如， 培养基成分、移液器、培养板等耗材必须单独记录。此外，还存在大量潜在问题（包括多种形式的人为误差），这些问题与CPF监测系统所记录的变量完全无关。因此，仍需依赖经过高度培训的专业人员，并对各项操作进行详细的手动记录。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

作者谨向Biospherix的工作人员致以谢意，感谢他们在学习使用Xvivo封闭式细胞培养系统过程中提供的帮助，特别是Matt Freeman；向Miles & Kelley Construction Company, Inc.公司的员工致谢，感谢他们在实验室基础设施建设中的工作，特别是Russ Hughes；向加州橙县儿童医院设施与支持服务部门的员工致谢，感谢他们在协调实验室改造方面的工作，特别是Adam Lukhard和Devin Hugie；向加州橙县儿童医院信息系统部门的员工致谢，感谢他们在数据管理基础设施及远程访问设置方面的协助，特别是Viet Tran；向加州橙县儿童医院执行管理团队致谢，感谢他们对本项目长期的支持，特别是Maria Minon博士和Brent Dethlefs。本研究由加州橙县儿童医院和加州再生医学研究所通过资助号TR3-05476资助给PHS。所有作者对本工作均作出了同等贡献。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
Xvivo SystemBiospherixcustom made
Xvivo 软件Biospherixversion i.o.2.1.2.1
O2 气体分配管路AmicoP-M2H-C3-S-U-OXY
CO2 气体分配管路AmicoM2H-C3-D-U-CO2
N2 气体分配管路Western InnovatorCTM75-7-2-2-BM
配备 DP21 相机和荧光功能的显微镜Olympus CorporationCKX41
名称公司目录编号备注
试剂
DMEM/F12 GlutamaxLife Technologies10565-018
StemPro hESC 补充剂Life TechnologiesA100006-01
AccutaseMilliporeSCR005
磷酸盐缓冲液Hyclone9236
成纤维细胞生长因子 2R&D SystemsAFL233
二甲基亚砜ProtidePP1130
基于 Hank's 液的细胞解离缓冲液Life Technologies13150-016
2-巯基乙醇Life Technologies21985-023
表皮生长因子R&D SystemsAFL236
Oct-3/4 抗体MilliporeAB3209
TRA-1-60 抗体MilliporeMAB4260
SSEA4 抗体MilliporeMAB4304
BIT-9500 血清补充剂Stemcell Technologies9500
名称公司目录编号备注
耗材
2 ml 移液管VWR89130-894
5 ml 移液管Olympus Plastics12-102
10 ml 移液管Olympus Plastics12-104
25 ml 移液管Olympus Plastics12-106
50 ml 移液管Olympus Plastics12-107
6 孔板Corning353046
12 孔板Corning353043
T25 培养瓶TPP90026
T-75 培养瓶TPP90076
20 µl 吸头Eppendorf22491130
200 µl 吸头Eppendorf22491148
1,000 吸头Eppendorf22491156
冻存管Thermo Scientific5000.102
70% 乙醇BDHBDH1164-4LP
Sanimaster 4Ecolab65332960
漂白剂CloroxA714239

参考文献

  1. Brick, D. J., et al. The Autism Spectrum Disorders Stem Cell Resource at Children's Hospital of Orange County: Implications for Disease Modeling and Drug Discovery. Stem Cells Transl.Med. 3 (11), 1275-1286 (2014).
  2. Nethercott, H. E., Brick, D. J., Schwartz, P. H. Derivation of induced pluripotent stem cells by lentiviral transduction. Methods Mol.Biol. 767, 67-85 (2011).
  3. Pistollato, F., et al. Hypoxia and HIF1alpha repress the differentiative effects of BMPs in high-grade glioma. Stem Cells. 27 (1), 7-17 (2009).
  4. Pistollato, F., Chen, H. L., Schwartz, P. H., Basso, G., Panchision, D. M. Oxygen tension controls the expansion of human CNS precursors and the generation of astrocytes and oligodendrocytes. Mol.Cell Neurosci. 35, 424-435 (2007).
  5. Raval, J. S., Koch, E., Donnenberg, A. D. Real-time monitoring of non-viable airborne particles correlates with airborne colonies and represents an acceptable surrogate for daily assessment of cell-processing cleanroom performance. Cytotherapy. 14 (9), 1144-1150 (2012).
  6. Schwartz, P. H. The potential of stem cell therapies for neurological diseases. Expert.Rev.Neurother. 6, 153-161 (2006).
  7. Schwartz, P. H., Brick, D. J. Stem cell therapies for the lysosomal storage diseases - the quintessential neurodegenerative diseases. Curr.Stem Cell Res.Ther. 3 (2), 88-98 (2008).
  8. Schwartz, P. H., Brick, D. J., Nethercott, H. E., Stover, A. E. Traditional human embryonic stem cell culture. Methods Mol.Biol. 767, 107-123 (2011).
  9. Stover, A. E., et al. Process-based expansion and neural differentiation of human pluripotent stem cells for transplantation and disease modeling. J Neurosci.Res. 91 (10), 1247-1262 (2013).
  10. Stover, A. E., Schwartz, P. H. Adaptation of human pluripotent stem cells to feeder-free conditions in chemically defined medium with enzymatic single-cell passaging. Methods Mol.Biol. 767, 137-146 (2011).
  11. Yoshida, Y., Takahashi, K., Okita, K., Ichisaka, T., Yamanaka, S. Hypoxia enhances the generation of induced pluripotent stem cells. Cell Stem Cell. 5 (3), 237-241 (2009).

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在封闭式细胞培养系统中培养人多能性干细胞和神经干细胞用于基础与临床前研究
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