小鼠海马星形胶质细胞的性别差异 体外 缺血

摘要

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最重要的关键细胞之一。本文报道了一种实用的按性别分离的海马星形胶质细胞培养方案，用于研究新生雄性和雌性幼鼠星形胶质细胞功能背后的机制 体外 缺血

摘要

缺氧/缺血（HI）相关性脑损伤后发生的星形胶质细胞增生在新生儿发病率和死亡率升高过程中起重要作用。近期临床研究表明，脑损伤的严重程度似乎具有性别依赖性，男性新生儿对HI相关性脑损伤的影响更为易感，导致更严重的神经功能缺损和不良预后。 更严重 与具有相似脑损伤的女性相比，其神经学预后存在差异。建立可靠的方法以分离并维持高纯度的性别特异性海马星形胶质细胞群体，对于理解新生儿缺氧缺血性脑损伤病理后果中性别差异的细胞基础至关重要。在本研究中，我们描述了一种建立性别特异性海马星形胶质细胞培养的方法，该方法随后应用于一种缺氧缺血模型 体外 缺血，氧糖剥夺，随后复氧。通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100B的免疫染色检测继发的反应性星形胶质增生。该方法为分别研究新生期缺血缺氧后雄性和雌性海马星形胶质细胞的作用提供了有用的工具。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最重要的关键细胞之一。越来越多的证据表明，星形胶质细胞的作用远不止为神经元提供 支持。事实上，在生理条件下，星形胶质细胞的功能可能非常复杂，例如引导发育中轴突的迁移¹，调节中枢神经系统的血流²，维持突触间液的pH稳态³，以及参与血脑屏障⁴和突触传递⁵。在病理条件下，星形胶质细胞会通过一种称为反应性星形胶质增生的过程对损伤作出响应，此时星形胶质细胞的形态、数量、位置、拓扑结构（相对于损伤距离）和功能可能发生异质性的改变^6,7。新生儿缺氧缺血性脑病后出现的星形胶质增生可能与新生儿的发病率和死亡率相关⁸。

近期临床与实验研究表明，脑损伤的严重程度具有性别依赖性，男性新生儿对缺氧/缺血（HI）相关脑损伤的影响更为易感，相较于具有类似脑损伤的女性，其神经功能预后更为严重^9-11. 尽管损伤的定位取决于胎龄和 持续时间和损伤严重程度不同，海马是足月新生儿缺氧缺血后中枢神经系统中最常受累的区域之一， 并且通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的上调，已证实海马区星形胶质细胞增生在3天时增强 新生期缺氧缺血后^7,10,12,13脑缺血后，新生及成年啮齿类动物星形胶质细胞功能均表现出性别差异^14,15此外，....

方案

注：本研究遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》的建议。动物实验方案经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会批准。本文所采用的原代星形胶质细胞培养方案，参考了 Zhang Y¹⁹ et al. 和 Cengiz P²⁰ et al. 所发表的方案，并进行了部分修改。

1. 海马体解剖与星形胶质细胞培养

1. 准备所有必要的试剂和材料，包括手术剪、光滑细镊、平头镊、纸巾、废液袋、70%乙醇，以及两个盛有冰上预冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的解剖培养皿（直径3.5 cm，每皿含2 mL HBSS）。确保手术器械在使用前经过灭菌处理（高压灭菌），并准备好以下材料：星形胶质细胞接种培养基（DMEM + 5% 马血清 + 1% 青霉素-链霉素）、马血清、HBSS、0.25% 胰蛋白酶、玻璃盖玻片、培养皿、15/50 mL 离心管、T25 培养瓶。 等等。）作为预灭菌的。
2. 轻轻握住幼鼠的头部和颈部，用70%乙醇喷洒，然后使用锋利的无菌剪刀断头图1（1）].
3. 使用小剪刀沿头皮从后向前颅中线做切口，暴露脑组织图 1 (2-3)].
4. 用小剪刀从颈部至鼻部小心剪开颅骨。然后在嗅球前方和小....

结果

在生理或病理生理条件下，通过培养这些细胞已极大地阐明了不同性别的星形胶质细胞功能的作用 体外 条件。进行性别分选培养的关键在于使用小鼠仔鼠之前确定其性别。我们通过PCR以及肉眼观察法从遗传学角度确定小鼠的性别。图2)¹⁶采用McClive和Sinclair的PCR性别鉴定方法并加以改进，该方法快速、简便且具有高度可重复性。²³. 图 2A 展示了使用PCR进行性别鉴定的代表性结果。PCR产物由两个典型的P1代雄性和雌性小鼠尾尖提取的DNA扩增而来。该反应包含多重引物对，用于 Sry 和 Myog 分别产生雄性特异性441 bp条带和雌性特异性245 bp条带的基因。通过肉眼观察新生小鼠（P1–3）肛门与生殖器开口之间是否存在微小的深色斑点（仅雄性具有）来判断其性别。图2B)^16,24.

讨论

为了研究生理和病理条件下星形胶质细胞特性与功能的性别差异，体外培养性别明确的原代星形胶质细胞是一种重要的研究工具。本研究报道了一种高效且可重复的方法，用于培养来自新生（P0-P2）C57Bl/6（野生型）或K19F（GFAP基因敲除）小鼠的高纯度、均一的性别明确的海马星形胶质细胞群体。 体外建立该方法有助于研究人员理解不同性别的海马星形胶质细胞在生理及病理条件下的功能。 体外 缺血

建立该方法包含两个关键步骤：一是在胰蛋白酶消化过程中保持无菌状态，二是对海马组织进行充分消化，随后通过吹打消化后的组织以获得单细胞悬液。在整个培养过程中，防止原代星形胶质细胞被污染是最具挑战性的问题之一。细菌和/或真菌污染是两种常见的污染形式，若操作过程中未采取适当预防措施，可能导致培养细胞完全失效。因此，为确保实验成功，必须在无菌工作环境中进行操作，包括使用前对工作区域进行消毒，使用无菌手术器械和材料，避免无菌材料与非无菌表面接触，使用超净工作台，并避免将未加盖的培养瓶移出超净台。此外，在酶解离过程中，海马组织与胰蛋白酶孵育时间过长，或在消化后过度吹打，可能导致组织.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
星形胶质细胞培养基
DMEM，高糖	cellgro	10-013-CV
马血清	Gibco	26050-070	终浓度：10%
青霉素-链霉素	Cellgro	30-002-CI	终浓度：1%
L-亮氨酸甲酯盐酸盐	Aldrich	L1002-25G	终浓度：5 mM
脑组织消化液
HBSS	Life Technologies	14170-088
胰蛋白酶	cellgro	25-050-CI	终浓度：0.25%
其他
70%（体积/体积）乙醇	Roth	9065.2
聚-D-赖氨酸（PDL）12 mm圆形盖玻片	Corning	354087
水	Sigma	W3500	细胞培养级
PBS	cellgro	21-040-CV	细胞培养级
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	25300-062
70 μm 无菌细胞筛	Fisher scientific	22363548
3.5 cm 培养皿	BD Falcon	353001
15 mL Falcon管	BD Falcon	352096
50 mL Falcon管	BD Falcon	352070
镊子，精细	Dumont	2-1032; 2-1033	# 3c；# 5
镊子，平头	KLS Martin	12-120-11
13 cm 外科剪刀	Aesculap	BC-140-R
共聚焦显微镜	尼康	A1RSi
离心	Eppendorf	5805000.017	5804R
轨道摇床	赛默飞世尔科技	SHKE 4450-1CE	MaxQ 4450
抗 IBA1	Wako	019-19741	兔单克隆
抗-MAP2	Sigma	M2320	小鼠单克隆
抗HIF1α	abcam	ab179483	兔单克隆
抗S100B	Sigma	HPA015768	兔多克隆
抗GFAP（混合抗体）	Biolegend	837602
VECTASTAIN Elite ABC试剂盒（兔IgG）	Vector Labs	PK-6101	包含 4 种试剂
山羊抗兔 Alexa Fluor 488	Invitrogen	A11070
Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠抗体	Invitrogen	A11004