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小鼠海马星形胶质细胞的性别差异 体外 缺血

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DOI：

10.3791/53695

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2016年10月25日

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1Waisman Center, University of Wisconsin, 2Department of Neurological Surgery, University of Wisconsin, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin

本文内容

摘要

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最重要的关键细胞之一。本文报道了一种实用的按性别分离的海马星形胶质细胞培养方案，用于研究新生雄性和雌性幼鼠星形胶质细胞功能背后的机制 体外 缺血

摘要

缺氧/缺血（HI）相关性脑损伤后发生的星形胶质细胞增生在新生儿发病率和死亡率升高过程中起重要作用。近期临床研究表明，脑损伤的严重程度似乎具有性别依赖性，男性新生儿对HI相关性脑损伤的影响更为易感，导致更严重的神经功能缺损和不良预后。 更严重 与具有相似脑损伤的女性相比，其神经学预后存在差异。建立可靠的方法以分离并维持高纯度的性别特异性海马星形胶质细胞群体，对于理解新生儿缺氧缺血性脑损伤病理后果中性别差异的细胞基础至关重要。在本研究中，我们描述了一种建立性别特异性海马星形胶质细胞培养的方法，该方法随后应用于一种缺氧缺血模型 体外 缺血，氧糖剥夺，随后复氧。通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）和S100B的免疫染色检测继发的反应性星形胶质增生。该方法为分别研究新生期缺血缺氧后雄性和雌性海马星形胶质细胞的作用提供了有用的工具。

引言

星形胶质细胞是中枢神经系统（CNS）中最重要的关键细胞之一。越来越多的证据表明，星形胶质细胞的作用远不止为神经元提供 支持。事实上，在生理条件下，星形胶质细胞的功能可能非常复杂，例如引导发育中轴突的迁移1，调节中枢神经系统的血流2，维持突触间液的pH稳态3，以及参与血脑屏障4和突触传递5。在病理条件下，星形胶质细胞会通过一种称为反应性星形胶质增生的过程对损伤作出响应，此时星形胶质细胞的形态、数量、位置、拓扑结构（相对于损伤距离）和功能可能发生异质性的改变6,7。新生儿缺氧缺血性脑病后出现的星形胶质增生可能与新生儿的发病率和死亡率相关8。

近期临床与实验研究表明，脑损伤的严重程度具有性别依赖性，男性新生儿对缺氧/缺血（HI）相关脑损伤的影响更为易感，相较于具有类似脑损伤的女性，其神经功能预后更为严重9-11. 尽管损伤的定位取决于胎龄和 持续时间和损伤严重程度不同，海马是足月新生儿缺氧缺血后中枢神经系统中最常受累的区域之一， 并且通过胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的上调，已证实海马区星形胶质细胞增生在3天时增强 新生期缺氧缺血后7,10,12,13脑缺血后，新生及成年啮齿类动物星形胶质细胞功能均表现出性别差异14,15此外，男性星形胶质细胞对 体外 与培养的雌性皮层星形胶质细胞相比，缺血表现为细胞死亡增加16.

性别差异从胚胎期开始，并持续至死亡17。在过去十年中，美国医学研究所和美国国立卫生研究院（NIH）强调在细胞培养和体内 研究的实验条件中纳入两性的重要性，以探索生理和病理状态下性别差异的基本机制17,18。建立可靠的方法以分离和维持特定性别的海马星形胶质细胞群体，对于理解新生儿缺氧缺血（HI）病理后果中性别差异的细胞基础至关重要。本研究旨在提供从新生小鼠制备富集的性别特异性海马星形胶质细胞培养的技术，以评估在氧糖剥夺（OGD）和再氧合（REOX）条件下GFAP免疫反应性星形胶质细胞的作用， 在细胞培养环境中模拟 HI。该技术可用于检验与正常氧和缺血条件下新生雄性和雌性小鼠海马星形胶质细胞相关的任何假设。

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方案

注：本研究遵循美国国立卫生研究院（National Institute of Health）发布的《实验动物护理与使用指南》的建议。动物实验方案经威斯康星大学麦迪逊分校机构动物护理与使用委员会批准。本文所采用的原代星形胶质细胞培养方案，参考了 Zhang Y19 et al. 和 Cengiz P20 et al. 所发表的方案，并进行了部分修改。

1. 海马体解剖与星形胶质细胞培养

  1. 准备所有必要的试剂和材料，包括手术剪、光滑细镊、平头镊、纸巾、废液袋、70%乙醇，以及两个盛有冰上预冷的Hank's平衡盐溶液（HBSS）的解剖培养皿（直径3.5 cm，每皿含2 mL HBSS）。确保手术器械在使用前经过灭菌处理（高压灭菌），并准备好以下材料：星形胶质细胞接种培养基（DMEM + 5% 马血清 + 1% 青霉素-链霉素）、马血清、HBSS、0.25% 胰蛋白酶、玻璃盖玻片、培养皿、15/50 mL 离心管、T25 培养瓶。 等等。）作为预灭菌的。
  2. 轻轻握住幼鼠的头部和颈部，用70%乙醇喷洒，然后使用锋利的无菌剪刀断头图1（1）].
  3. 使用小剪刀沿头皮从后向前颅中线做切口，暴露脑组织图 1 (2-3)].
  4. 用小剪刀从颈部至鼻部小心剪开颅骨。然后在嗅球前方和小脑下方剪开颅骨，使颅骨与颅底分离。
  5. 在颅骨基底部做一个小切口，并沿中线剪开。使用无菌平头镊子剥离颅骨。借助弯头镊子取出脑干。将脑组织从颅腔中取出，放入第一个解剖皿中图 1 (4-9)]21.
  6. 使用弯头镊子将大脑翻转，使脑腹面朝上，然后用锋利的无菌手术刀分离两侧半球[图 1 (10,11)]
  7. 用无菌的扁平弯头镊子轻轻掀开大脑半球，小心移除膨出的中脑和丘脑组织，以暴露位于内侧颞叶的海马结构，其为一小的海马状结构[图 1 (12-14)].
  8. 取出两侧海马叶图 1 (15,16)] 用精细镊子轻轻牵拉，从脑叶上仔细剥离脑膜。此步骤可避免脑膜细胞和成纤维细胞污染最终的星形胶质细胞培养物。
  9. 将制备好的海马叶转移至第二个盛有HBSS的培养皿中，并放回冰上图 1 (17,18)将单只小鼠（P0 - P2）的两个海马叶合并，用于制备海马星形胶质细胞培养物，以获得合适的星形胶质细胞密度。使用锋利的无菌手术刀片将海马叶切碎（约4次）。
  10. 用连接1 mL移液器的无菌吸头吸除培养皿中的HBSS 并加入3 加入0.25%胰蛋白酶1 mL，混匀，转移至15 mL无菌锥形管中，于37 °C孵育20分钟，期间轻柔振荡。
  11. 离心管于300 × g离心5分钟。使用连接真空泵的无菌玻璃移液管小心吸除上清液。加入10 mL星形胶质细胞接种培养基，用火焰抛光的玻璃移液管吹打20–30次，直至组织块均匀分散。
  12. 离心管，300 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，加入 2 mL 新鲜预热的星形胶质细胞接种培养基。将细胞通过 70 μm 细胞筛滤器转移至新的 50 mL 离心管中 锥形管
  13. 将整个细胞悬液接种至含有3 mL星形胶质细胞接种培养基的无菌T25培养瓶中，该培养瓶预先用多聚-D-赖氨酸/层粘连蛋白（Poly-D-Lysine/Laminin）包被，随后将培养瓶置于37 °C、5% CO₂培养箱中孵育2 培养箱
  14. 第天吸弃全部培养基i体外 （接种后）第1天、第3天和第7天，更换为2 mL新鲜的星形胶质细胞接种培养基。每次更换培养基时，在光学显微镜下观察细胞进展及星形胶质细胞的融合程度。
    注意：在体外培养第1天（DIV 1），所有存活的星形胶质细胞均已贴附于培养瓶表面，而包括神经元在内的死亡或濒死细胞则悬浮于上清液中。在体外培养第3天（DIV 3），贴壁细胞开始分裂，形成星形胶质细胞层。在缺乏支持性条件的情况下，培养体系中几乎无神经元生长。在体外培养第7天（DIV 7），星形胶质细胞层的融合度约为80–90%，其表面可见少量小胶质细胞及少突胶质前体细胞。
  15. 吸去培养瓶中的铺板培养基，加入 2 mL 新鲜预热的星形胶质细胞铺板培养基，于 DIV 11（星形胶质细胞汇合且准备进行传代培养时）轻柔冲洗后再次移除。
  16. 加入2 mL 0.25%胰蛋白酶，轻轻旋转培养瓶数次，用无菌玻璃移液管吸除胰蛋白酶。
  17. 加入2 mL 0.25%胰蛋白酶，将培养瓶置于组织培养罩内，室温静置4–5分钟。
  18. 移除胰蛋白酶，并将培养瓶置于37 °C、5% CO₂条件下培养2 在培养箱中孵育10分钟。加入5 mL预热的星形胶质细胞接种培养基，通过将培养瓶轻敲手掌3–4次使星形胶质细胞层脱落，随后轻轻吹打以实现完全解离，并将星形胶质细胞收集至15 mL锥形管中。
  19. 离心管，300 × g 离心 5 分钟，吸除上清液，加入 1 mL 新鲜星形胶质细胞接种培养基。
  20. 将10 μL细胞悬液加入血细胞计数板，计数中央大方格区域（1 mm）内的细胞2) 使用倒置相差显微镜（10倍物镜）观察。乘以104 以估算每毫升的细胞数量。一个T25培养瓶将获得约1 x 106 总解离细胞。接种约 1 x 105 将细胞接种于24孔培养板的孔中，每孔含2 mL星形胶质细胞接种培养基，并使用直径为12 mm的多聚-D-赖氨酸预包被玻璃盖玻片。
  21. 在37 °C、5% CO₂条件下孵育2 培养箱。在DIV 12–14进行氧糖剥夺/复氧（OGD/REOX）处理（第2节）。
  22. 若需获得无小胶质细胞的海马神经元培养物，在DIV 3时用5 mM L-亮氨酸甲酯（LME）盐酸盐处理星形胶质细胞培养物，持续至DIV 11。LME孵育后，将培养物置于300 rpm摇床震荡1小时，以去除污染的小胶质细胞。
    注意：LME 是一种小胶质细胞毒性试剂，已被广泛用作消除增殖性小胶质细胞的方法。22.

2. 氧糖剥夺/复氧处理

  1. 吸除含有贴壁星形胶质细胞培养物（DIV 12–14）的盖玻片中的培养基，用 1 mL 等渗 OGD 溶液（pH 7.4）轻轻旋转冲洗 24 孔培养板数次，共冲洗 3 次 。OGD 溶液成分（单位：mM）为：0 葡萄糖、21 NaHCO3、120 NaCl、5.36 KCl、0.33 Na2HPO4、0.44 KH2PO4、1.27 CaCl2 和 0.81 MgSO4。
  2. 向孔中加入 0.2 mL OGD 溶液以覆盖盖玻片，置于含 94% N2、1% O2 和 5% CO2 的缺氧培养箱中孵育 2 小时。在缺氧开始的前 30 分钟内，使用轨道摇床（50 rpm）轻轻混匀，以促进气体交换。
  3. 将常氧对照组细胞在与 OGD 溶液成分相同但添加了 5.5 mM 葡萄糖的缓冲液中，于 5% CO2 和大气空气条件下孵育 2 小时。
  4. 对于复氧（REOX）处理，吸除 OGD 溶液，加入 2 mL 星形胶质细胞接种培养基，在 37°C、5% CO2 和大气空气条件下孵育 5 小时。

3. 免疫细胞化学染色

  1. 使用连接真空泵的无菌玻璃移液管吸除培养基，然后向孔中加入 1 mL 0.1 M Tris 缓冲盐水（TBS）（154 mM NaCl，16 mM Trizma Base，84 mM Tris-HCl，pH 7.4）快速冲洗盖玻片一次。吸除液体后加入 2 mL 含 4% 多聚甲醛（PFA）的 1× 磷酸盐缓冲液（PBS），室温孵育 15 分钟。
  2. 吸除固定液，加入 1 mL 0.1 M TBS，置于摇床上振荡 2 分钟。重复此洗涤步骤 3 次。加入 1 mL 封闭液（含 10% 山羊血清、10 mg/mL BSA 和 0.025% Triton X-100 的 0.1 M TBS 溶液），在 37 °C 摇床上孵育 30 分钟。
  3. 吸除封闭液，加入初级抗体：在封闭液中按 1:500 稀释的鼠单克隆抗 GFAP 抗体（0.2 mL）以及兔多克隆抗 S100B 抗体（1:500）或兔多克隆抗 HIF1α 抗体（1:200），在 37 °C 摇床上孵育 60 分钟。
  4. 或者，部分星形胶质细胞可使用兔多克隆抗 IBA1 抗体（1:200）和鼠单克隆抗 MAP2 抗体进行共孵育，以评估培养纯度。
  5. 吸除初级抗体溶液，加入 1 mL 0.1 M TBS 冲洗盖玻片，置于摇床上振荡 2 分钟后吸除。重复此洗涤步骤两次。
  6. 加入 0.2 mL 用封闭液按 1:200 稀释的二抗溶液（山羊抗兔 IgG 488 标记和抗鼠 IgG 568 标记抗体），在 37 °C 摇床上孵育 60 分钟。
  7. 吸除二抗溶液，加入 1 mL 0.1 M TBS 冲洗盖玻片，置于摇床上振荡 2 分钟后吸除。重复此洗涤步骤两次。
  8. 将盖玻片从孔中取出，放置于载玻片干燥仪上的载玻片上使其干燥。将盖玻片倒置在含 DAPI（1.5 ng/μL）的 VECTASHIELD 硬封片剂单滴液上，封固于新的载玻片上。
  9. 使用共聚焦显微镜，选择 20X 干镜或 60X 油镜观察盖玻片。采集图像（512 × 512 分辨率），DAPI 激发波长 405 nm，发射波长 450 nm；GFAP 抗体标记的荧光染料 488 激发波长 488 nm，发射波长 515 nm。在 20X 和 60X 组内保持图像采集参数一致。

4. 使用 PCR 进行性别鉴定

  1. 将幼鼠脚趾或手指剪取物在含有 50 mM NaOH 的溶液中 95 °C 加热 45 分钟，然后加入等体积的 1 M Tris（pH 6.8）进行中和。
  2. 取 1 μL 提取的 DNA 溶液加入到 19 μL 下述混合液中：含 Myog 和 Sry 基因的引物各 5 pmol、1× 反应缓冲液、每种脱氧核苷酸 0.2 mM 以及 8 U Taq 聚合酶。
  3. 使用以下引物序列：Sry 5'TCATGAGACTGCCAACCACAG3'、5'CATGACCACCACCACCACCAA3' 和 Myog 5'TTACGTCCATCGTGGACAGC3'、5'TGGGCTGGGTGTTAGTCTTA3'23。
  4. 进行以下 PCR 扩增程序：95 °C 预变性 3 分钟，随后进行 30 个循环，每个循环包括 95 °C 变性 15 秒、58 °C 退火 15 秒、72 °C 延伸 1 分钟；30 个循环结束后，再于 72 °C 进行最终延伸 1 分钟。
  5. 将 PCR 产物在含有溴化乙锭的 2% 琼脂糖凝胶中进行电泳分离，并在紫外光下观察成像。（图 2A。）注意！ 溴化乙锭为潜在致癌物，必须按照所在机构的规定小心操作并妥善处理。

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结果

在生理或病理生理条件下，通过培养这些细胞已极大地阐明了不同性别的星形胶质细胞功能的作用 体外 条件。进行性别分选培养的关键在于使用小鼠仔鼠之前确定其性别。我们通过PCR以及肉眼观察法从遗传学角度确定小鼠的性别。图2)16采用McClive和Sinclair的PCR性别鉴定方法并加以改进，该方法快速、简便且具有高度可重复性。23. 图 2A 展示了使用PCR进行性别鉴定的代表性结果。PCR产物由两个典型的P1代雄性和雌性小鼠尾尖提取的DNA扩增而来。该反应包含多重引物对，用于 Sry 和 Myog 分别产生雄性特异性441 bp条带和雌性特异性245 bp条带的基因。通过肉眼观察新生小鼠（P1–3）肛门与生殖器开口之间是否存在微小的深色斑点（仅雄性具有）来判断其性别。图2B)16,24.

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讨论

为了研究生理和病理条件下星形胶质细胞特性与功能的性别差异，体外培养性别明确的原代星形胶质细胞是一种重要的研究工具。本研究报道了一种高效且可重复的方法，用于培养来自新生（P0-P2）C57Bl/6（野生型）或K19F（GFAP基因敲除）小鼠的高纯度、均一的性别明确的海马星形胶质细胞群体。 体外建立该方法有助于研究人员理解不同性别的海马星形胶质细胞在生理及病理条件下的功能。 体外 缺血

建立该方法包含两个关键步骤：一是在胰蛋白酶消化过程中保持无菌状态，二是对海马组织进行充分消化，随后通过吹打消化后的组织以获得单细胞悬液。在整个培养过程中，防止原代星形胶质细胞被污染是最具挑战性的问题之一。细菌和/或真菌污染是两种常见的污染形式，若操作过程中未采取适当预防措施，可能导致培养细胞完全失效。因此，为确保实验成功，必须在无菌工作环境中进行操作，包括使用前对工作区域进行消毒，使用无菌手术器械和材料，避免无菌材料与非无菌表面接触，使用超净工作台，并避免将未加盖的培养瓶移出超净台。此外，在酶解离过程中，海马组织与胰蛋白酶孵育时间过长，或在消化后过度吹打，可能导致组织...

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披露

所有作者均无竞争 或利益冲突。

致谢

美国国家转化科学促进中心（NCATS）临床与转化科学奖项目 UL1 TR0000427 和 KL2 TR000428（Cengiz P），美国国立卫生研究院（NIH）/NCATS 资助威斯康星大学转化研究机构（UW ICTR）的 UL1TR000427 项目以及威斯曼中心（Waisman Center）提供的资金（Cengiz P），美国国家神经疾病与卒中研究所（NINDS）K08 NS088563-01A1 项目（Cengiz P）以及 NIH P30 HD03352（威斯曼中心），NIH/NINDS 1K08NS078113 项目（Ferrazzano P）。我们感谢 Albee Messing 博士为我们提供 GFAP 基因敲除小鼠。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
星形胶质细胞培养基
DMEM，高糖cellgro10-013-CV
马血清Gibco26050-070终浓度：10%
青霉素-链霉素Cellgro 30-002-CI终浓度：1%
L-亮氨酸甲酯盐酸盐AldrichL1002-25G终浓度：5 mM
脑组织消化液
HBSSLife Technologies14170-088
胰蛋白酶cellgro25-050-CI终浓度：0.25%
其他
70%（体积/体积）乙醇Roth9065.2
聚-D-赖氨酸（PDL）12 mm圆形盖玻片 Corning354087
水SigmaW3500细胞培养级
PBScellgro21-040-CV细胞培养级
0.05% 胰蛋白酶-EDTA Life Technologies25300-062
70 μm 无菌细胞筛 Fisher scientific22363548
3.5 cm 培养皿BD Falcon353001
15 mL Falcon管BD Falcon352096
50 mL Falcon管BD Falcon352070
镊子，精细 Dumont2-1032; 2-1033# 3c；# 5
镊子，平头KLS Martin12-120-11
13 cm 外科剪刀AesculapBC-140-R
共聚焦显微镜尼康A1RSi 
离心Eppendorf5805000.0175804R
轨道摇床赛默飞世尔科技SHKE 4450-1CEMaxQ 4450 
抗 IBA1Wako019-19741兔单克隆
抗-MAP2SigmaM2320小鼠单克隆
抗HIF1αabcamab179483兔单克隆
抗S100BSigmaHPA015768兔多克隆
抗GFAP（混合抗体）Biolegend837602
VECTASTAIN Elite ABC试剂盒（兔IgG）Vector LabsPK-6101包含 4 种试剂 
山羊抗兔 Alexa Fluor 488InvitrogenA11070
Alexa Fluor 568 标记的山羊抗小鼠抗体InvitrogenA11004

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GFAP S100B

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