本实验方案旨在描述一种功能缺失和功能获得的方法，可用于鉴定新生素（neogenin）作为植入前小鼠胚胎中滋养外胚层和内细胞团分化的阶段特异性受体。
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本文内容
摘要
摘要
基因沉默和过表达技术对于鉴定参与胚胎发育的基因至关重要。在植入前胚胎中直接对靶基因进行修饰，为研究参与例如滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM）细胞分化的相关基因的潜在机制提供了手段。本文描述了一种研究新发现蛋白（neogenin）作为植入前小鼠胚胎早期细胞命运决定真实受体作用的实验方案。首先，我们讨论了通过显微注射neogenin cDNA和shRNA实现neogenin功能获得和缺失的实验操作；该方法的有效性通过红色荧光蛋白（RFP）或绿色荧光蛋白（GFP）的成对表达水平与免疫细胞化学定量检测的neogenin表达水平之间高度相关性得以验证。其次，在植入前小鼠胚胎中过表达neogenin可支持正常的ICM发育，而neogenin表达下调则导致ICM发育异常，提示neogenin可能是传递胞外信号以驱动卵裂球向早期细胞命运分化的受体。鉴于该详细方案在研究一种新型胚胎发育阶段特异性受体功能上的成功，我们提出该方法有望促进胚胎发生过程中其他阶段特异性基因的探索与鉴定。
引言
胚胎着床前发育可分为若干明显阶段，从单细胞阶段经桑葚胚至囊胚阶段。大量证据表明，极性与位置信号在早期细胞命运决定分化为滋养外胚层（TE）和内细胞团（ICM）的过程中发挥重要作用。然而，这些信号的本质、它们如何被转导为细胞内信号，以及此类信号在何种生理环境下能够启动细胞谱系分化，目前仍不清楚。这些已分化的细胞随后进一步特化，开始形成胚胎本体构建及胎盘发育所必需的特定结构与功能1-3。
植入前胚胎特别适合通过直接注射修饰的遗传物质（如siRNA或目的cDNA）进行操作，因此可用于研究特定靶分子。目前越来越认识到，对脊椎动物胚胎进行遗传学分析对于深入理解胚胎发育过程至关重要4。在适当的时间窗口内将野生型基因或突变型基因精确导入胚胎，以实现基因的获得或缺失功能，极大地促进了对发育调控基因的研究。由于早期非哺乳类和哺乳类胚胎体积较大且易于接受外源物质，通过显微注射将遗传物质导入单个胚胎以实现功能获得或缺失相对简便5。显微注射通常使用非病毒载体进行。相比病毒载体和转基因技术，非病毒载体具有操作简便的显著优势。目前已建立一种在小鼠胚胎中快速实现基因功能获得或缺失的表达系统，使我们能够解析并理解脊椎动物胚胎学中基因的功能6,7。
对胚胎进行荧光标记将极大地方便筛选显微注射或基因操作后的胚胎，同时可根据荧光强度间接定量评估显微注射的siRNA或cDNA的表达水平8。为实现该标记，可将编码荧光蛋白的cDNA（GFP或RFP）作为融合构建体或单独地共同注射。GFP或RFP的荧光强度可反映siRNA或外源DNA的表达程度，从而确认是否已实现基因功能的缺失或获得。
本文介绍了一种显微操作技术方案，该方案通过功能缺失和功能获得实验方法，帮助我们鉴定出neogenin是一种受体，能够传递对小鼠着床前胚胎早期细胞分化至关重要的胞外信号。
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方案
注意：所有动物繁育和护理操作均依照韩国首尔善明大学动物护理与使用委员会（IACUC ）的规定进行。
1. 超数排卵、配种与输卵管分离
- 将近交系 C57BL/6 小鼠饲养在以下条件下：22 ± 3 °C，相对湿度约 60%，12 小时光照/黑暗循环，自由饮水和进食。
- 对 3–5 周龄的雌性小鼠进行超数排卵诱导：每只腹腔注射 5 IU 孕马血清促性腺激素（PMSG），剂量为 0.1 ml/只；48 小时后，再腹腔注射 5 IU 人绒毛膜促性腺激素（hCG），剂量为 0.1 ml/只。
- 在注射 hCG 后立即与同品系性成熟的雄性小鼠合笼过夜，以进行交配。
- 次日早晨，通过检查雌性小鼠生殖道是否存在交配栓或阴道栓来确认交配是否成功。
- 在注射 hCG 后 18–20 小时，采用 CO2 窒息法处死怀孕雌鼠，随后进行颈椎脱臼以确保安乐死。
- 使用精细剪刀剪开皮肤，再剪开腹膜层，暴露腹腔。
- 用精细镊子夹住子宫角，轻柔地将子宫、输卵管、卵巢及脂肪垫从体腔中分离并拉出。
- 用精细剪刀剪断输卵管与卵巢之间的连接区域；重新放置镊子，再在靠近输卵管处剪断子宫，保留至少 1 cm 的子宫上段与输卵管相连。
- 将输卵管壶腹部转移至含有 M16 培养基的 35 mm 培养皿中，室温下保存。可将多只小鼠的输卵管置于同一培养皿中。
- 将培养皿置于体视显微镜下，以便回收胚胎。
2. 二原核（2-PN）胚胎的获取与培养
- 剪断30或32 G一次性皮下注射针的末端，将其磨成钝头，用作冲卵针。
- 用精细镊子将输卵管末端套入冲卵针尖端，轻轻将针尖抵住培养皿底部以固定。用约0.1 ml M16培养基冲洗输卵管，将2-原核（2-PN）胚胎冲入培养皿中。
- 在体视显微镜下，用无菌玻璃移液管从冲洗液中回收2-PN胚胎及其周围的卵丘细胞团，并转移至新的培养皿中。
- 将胚胎置于含1.0 ml 0.1–0.5%透明质酸酶的杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）中，于37 °C孵育5–10分钟，通过酶消化法去除卵丘细胞。
- 用玻璃移液管轻轻吹打，机械去除残留的卵丘细胞，以获得裸胚。
- 每个胚胎用30–50 ml新鲜磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤三次。
- 将去除了卵丘细胞的胚胎置于35 mm塑料培养皿中的M16培养基中，培养基中添加10 mg/ml牛血清白蛋白（BSA, Fraction V），在37 °C、5% CO2的湿润化培养箱中孵育，直至进行显微注射，通常在4小时内完成。
3. 胚胎逆转录（RT）与聚合酶链式反应（PCR）
- 从每个发育阶段至囊胚阶段分别收集至少10个胚胎，并将它们汇集到含有逆转录酶、RNase抑制剂、oligo dT引物、随机六聚体引物、dNTP混合物及反应缓冲液的4.0 μl 5倍逆转录预混液中，置于PCR管内。
- 加入无RNase的蒸馏H2O，使总体积达到20 μl，随后在200 W条件下对汇集的胚胎进行30秒超声处理。立即在42 °C下启动逆转录反应，反应1小时，接着在95 °C孵育5分钟。
- 每生成5.0 μl cDNA溶液，使用neogenin、Cdx2、Sox2、Tead4、Nanog、Oct3/4或β-actin的引物进行常规PCR扩增（引物序列见表1）。PCR反应包括40个循环：95 °C孵育15秒，退火温度（见表1）孵育30秒，72 °C孵育30秒。
- 通过2%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，经溴化乙锭染色后在紫外光下观察凝胶。
- 以β-actin表达水平为参照，对目的基因表达进行归一化处理。
4. 胚胎免疫细胞化学
- 在室温下用 PBS 中 4% 多聚甲醛固定各阶段胚胎 30 分钟，随后用含 0.01% BSA 的 PBS 短暂洗涤 3 次。
- 将 10 个胚胎在含 0.1% Tween 20 和 0.1% TritonX-100 的 1.0 ml PBS 中室温孵育 10 分钟，以通透细胞膜。
- 为阻断非特异性结合，将通透后的胚胎在含 10% 正常山羊血清的 1.0 ml PBS 中室温孵育 30 分钟。
- 将阻断后的胚胎在含 0.1% BSA 的 PBS 中以 1:100 稀释的兔抗 neogenin 抗体溶液中 4 °C 过夜孵育。
- 在 PBS 滴液中每次洗涤 30 秒，共洗涤三次后，将胚胎在含 BSA 的 PBS 溶液中以 1:500 稀释的 Alexa 488 标记的山羊抗兔 IgG 或 Alexa 568 标记的山羊抗兔 IgG 中 4 °C 过夜孵育。
- 为观察肌动蛋白丝，将胚胎在含 1 µg/ml 鬼笔环肽（phalloidin）的 PBS 中室温孵育 1 小时。
- 加入含 1 µg/ml DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐）的 5 ml PBS，室温孵育 5 分钟，对细胞核进行染色。
- 用 PBS 简短洗涤胚胎 3 次。
- 将胚胎转移至载玻片上，并覆盖一滴矿物油。
- 使用共聚焦显微镜在 1,000 倍放大倍数下，以相应波长激发光采集图像。
5. Neogenin-RFP 和 Neogenin-siRNA GFP 质粒的制备
- 将编码小鼠neogenin的cDNA亚克隆至含有红色荧光蛋白（Red Fluorescent Protein, RFP）的载体中，构建neogenin-flag-RFP融合表达载体。
- 将靶向neogenin的小发夹RNA（small hairpin RNA）亚克隆至含有翡翠绿色荧光蛋白（Emerald Green Fluorescent Protein, EmGFP）的载体中，构建pcDNA-EmGFP-miR-neogenin质粒（如图1所示）。
- 通过常规方法扩增neogenin-flag-RFP和pcDNA-EmGFP-miR-neogenin质粒，并进行纯化。
- 用无菌Tris-EDTA（TE）缓冲液将质粒终浓度调整至约1.0 µg/ml。
6. 将质粒显微注射到2-PN胚胎中
- 用新鲜的M16培养基将去透明带的2-PN胚胎快速洗涤一次。
- 将2-细胞期胚胎在台式离心机中以1,000 × g离心10分钟，以便观察原核。
- 将胚胎置于含有矿物油覆盖的微滴中，每枚胚胎使用20–30 µl M16培养基，于37 °C、5% CO₂条件下孵育2 再继续孵育1-2小时。
- 使用机械拉针仪将硼硅酸盐玻璃毛细管（外径 = 1.2 mm；内径 = 0.94 mm）拉制成注射毛细管和固定毛细管。
- 制备注射移液管，使其具有钝端和抛光的开口 <500 µm 尖端长度和 1–2 µm 尖端内径，使用微磨机和微锻机加工。
- 制备持卵管，使其具有钝化尖端和抛光开口，内径为20 µm，外径为100 µm。
- 用足量的溶液填充注射移液管>1.0 µg/µl 质粒溶液 200 nl
- 显微注射 使用连接至电动显微操作仪的显微注射仪，将每枚2-PN胚胎约10 pl质粒溶液注入其中一个原核；操作过程中，用持卵针施加负压以固定胚胎位置。
- 显微注射后，用新鲜的M16培养基将2-PN胚胎洗涤3次，每次时间少于1分钟。
- 将2-PN胚胎置于塑料培养皿中的一滴新鲜M16培养基内，并在培养基液滴上覆盖矿物油以防止培养基蒸发。
- 在倒置微分干涉差（DIC）显微镜下以200倍放大倍数，每隔24小时观察一次胚胎。
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结果
我们发现，新生素（neogenin）在小鼠胚胎着床前早期发育阶段呈 transient 表达，最早在2细胞阶段出现，持续至早期桑葚胚阶段，但在晚期桑葚胚和囊胚阶段则表达缺失（图 2A）。此外，新生素的空间分布主要局限于外层细胞。RT-PCR 分析结果与新生素表达的早期性和 transient 特征一致，在4细胞阶段达到峰值，而在16细胞阶段或更晚阶段则完全检测不到（图 2B）。相比之下，F-actin 并未表现出类似的 transient 和极性表达模式。
接下来，我们通过向2-细胞期受精卵显微注射neogenin cDNA载体（neogenin过表达）或携带靶向neogenin的shRNA载体（neogenin缺失），探究neogenin水平是否可被调控。为直观区分neogenin过表达与neogenin缺失，同时共表达RFP和GFP作为指示标记图3...
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讨论
在本实验方案中，我们展示了将遗传物质（包括 cDNA 或 shRNA）显微注射到 2-原核期小鼠胚胎中的新方法，以研究新生素（neogenin）在小鼠胚胎发生过程中早期细胞分化的作用。对植入前胚胎进行遗传修饰是一种强大的技术，可用于揭示诸如首次细胞谱系决定等过程背后的关键分子机制。遗传修饰是确定基因功能最常用的方法之一。由于 2-原核期胚胎对外源性遗传物质具有相对较高的接受能力，并且可实现将 cDNA 和 shRNA 显微注射入 2-原核期胚胎，因此该胚胎操作技术可在对胚胎造成最小物理干扰的情况下实施，更不用说这种遗传操作本身所具有的内在互补性。
考虑到细胞质注射比核注射更容易且对存活的影响更小，但核注射通常能实现外源DNA的更高表达，因此应强调的一种改进方法是在对细胞核进行显微注射前，利用离心法将原核定位。其中技术上最复杂且要求最高的步骤是将外源DNA显微注射到受精卵的原核中。该步骤至关重要，需要较高的技术水平以及大量训练才能熟练掌握显微注射操作。然而一旦掌握此项技能，技术上的变异性和操作误差将降至最低。在我机构中，显微注射后胚胎的常规存活率为80–90%。
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披露
作者声明无竞争性财务利益。
致谢
作者还感谢佐治亚健康科学大学Xiong博士的研究团队制备并分享了neogenin cDNA和shRNA载体的构建体。本研究得到了韩国研究基金会资助的基础科学研究中心项目（2013R1A1A4A01012572）以及沙姆尤克大学研究基金的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| M16 培养基 | Gibco BRL (美国纽约州格兰德岛) | M7292 批号：11A832 | |
| 山羊血清 | Dako (丹麦格洛斯楚普) | X0907 | |
| PMSG | Folligon，Intervet，荷兰 | G4877-1000IU 批号：SLBD0719V | |
| 矿物油 | Sigma Aldrich | CG5-1VL 批号：SLBC6783V | |
| 人绒毛膜促性腺激素和孕马血清促性腺激素 | (Intervet，荷兰) | (Invitrogen，15596-026) | |
| SuperScript® III 逆转录酶 | LifeTechnologies | 18080-044 | |
| PCR 预混液 | (Bioneer，韩国大田) | GenDEPOT，A0224-050 | |
| 琼脂糖（分子级） | BioRad | 161-3101 | |
| 4% 多聚甲醛 PBS 溶液 | Affymetrix 美国 | 19943 | |
| 兔多克隆抗新生素抗体 | Santa Cruz Biotechnology，美国 | SC-15337 | |
| Alexa Fluor 488 标记的抗兔抗体 | Molecular Probes (Invitrogen，美国) | A-11094 | |
| Alexa Fluor 555 标记的抗兔抗体 | Molecular Probes (Invitrogen，美国) | A-21428 | |
| Alexa Fluor® 555 Phalloidin | Molecular Probes (Invitrogen，美国) | A34055 | |
| DAPI (4',6-二脒基-2-苯基吲哚，盐酸盐) | Invitrogen，美国 | D1306 | |
| 重组人 RGM-C/血幼素 | R&D Systems | 3720-RG | |
| 所有质粒构建体 | 由佐治亚健康科学大学（美国佐治亚州奥古斯塔）熊文成教授提供 | 本研究中所使用的质粒构建体由 慷慨提供 | |
| Neon® 转染系统 | LifeTech | MPK10096 | |
| 体视显微镜 | Nikon | SMZ1000 | |
| 配备 Nikon 的显微操作系统 | Nikon | Narishige ONM-1 | |
| 显微注射器 | Nikon Narishige | GASTIGHT #1750 | |
| 持针器 | Nikon Narishige | Narishige IM 16 | |
| 微量离心机 | Nikon Narishige | Narishige MF-900 | |
| 磨针仪 | Narishige | EG400 | |
| 拉针仪 | Sutter Instrument 公司 | P-97 | |
| CO2 培养箱 | Thermo Scientific Forma | EW-39320-16 | |
| Veriti® 384 孔 PCR 仪 | LifeTechnologies | 4388444 |
参考文献
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