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大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（F-actin）斑点的定量分析

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DOI：

10.3791/53697

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2016年2月10日

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1Laboratory Program in Behavioral, Neuroscience, Department of Psychology, University of South Carolina

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。因此，对F-actin斑点进行定量是研究突触结构完整性的有效工具。本实验方案描述了在低密度原代皮层神经元培养物中，利用鬼笔环肽标记F-actin斑点并进行定量的实验步骤。

摘要

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。树突中富含F-actin的结构变化提示突触完整性与连接性的改变。本文提供了一种培养原代大鼠皮层神经元、对F-actin斑点进行鬼笔环肽染色以及后续定量分析的详细实验方案。首先，分离E18大鼠胚胎的额叶皮层组织，制备成低密度细胞培养物，随后培养神经元 体外 至少培养12-14天。实验处理后，皮层神经元使用AlexaFluor 488 Phalloidin染色（用于标记树突F-actin斑点）以及微管相关蛋白2（MAP2；用于验证神经元细胞及树突完整性）。最后，采用专业软件对随机选取的神经元树突进行分析与定量。富含F-actin的结构被识别于具有连续MAP2免疫荧光信号的二级树突分支上（长度范围为25-75 µm）。本方案将为研究实验处理后树突突触结构的变化提供一种有效的方法。

引言

本研究的主要目标是建立一种可靠的方法，用于测量（评估）神经元树突网络的突触完整性。本文描述了利用鬼笔环肽染色与树突的免疫细胞化学（ICC）检测相结合，对原代培养的大鼠神经元中的F-肌动蛋白（F-actin）斑点进行定量分析，并随后使用专业的NIS-Elements软件进行图像分析。

标记的鬼笔环肽对粗细肌动蛋白丝（F-actin）具有相似的亲和力，但与单体球状肌动蛋白（G-actin）不结合，这一点与某些肌动蛋白抗体不同1。鬼笔环肽的非特异性结合可忽略不计，因此在细胞成像过程中背景信号极低。鬼笔环肽的分子远小于通常用于荧光显微镜标记细胞蛋白的抗体，因而可实现对F-actin更强烈的标记。因此，利用标记的鬼笔环肽可以获得神经元中F-actin定位的详细图像。

神经元树突的鬼笔环肽（F-肌动蛋白）染色会产生离散的"热点"或明亮的"点状结构"，这些结构代表多种树突结构，包括成熟的树突棘、非棘状突触2以及未成熟的树突棘。未成熟的树突棘包括细长的丝状伪足及某些形态的斑块结构，可能代表树突棘形成的起始阶段3。未成熟的树突棘和非棘状斑块缺乏PSD954。F-肌动蛋白生成的变化不仅会导致树突棘的后续改变，还会影响其他树突结构，因此鬼笔环肽成为研究突触-树突完整性的关键工具5-7。通常，鬼笔环肽阳性（F-肌动蛋白）点状结构的数量反映了活性突触（兴奋性和抑制性突触）、肌动蛋白动态以及突触稳定性之间的平衡8。

尽管研究特定类型的突触非常重要即，兴奋性树突棘），当治疗靶点未知时，有必要首先评估多种树突结构的一般完整性。由于F-actin是树突棘及其他结构（包括抑制性突触）的主要组成成分，F-actin斑点数量的改变可能提示突触病变。随后可进一步探究该突触病变是否存在更特异性的改变。我们用于检测多种突触类型/结构的定量方法，可在不同实验处理后对树突突触的总体改变（增加或减少）提供评估。

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方案

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（保证编号：A3049-01）。

1. 低密度胚胎神经元培养

  1. 原代皮层神经元培养的准备工作
    1. 溶液：
      1. 将5 mg聚-L-赖氨酸溶解于10 ml硼酸盐缓冲液中，配制聚-L-赖氨酸储存液。
      2. 通过将1 ml聚-L-赖氨酸储存液加入49 ml硼酸盐缓冲液中，配制工作液。
      3. 制备硼酸盐缓冲液，pH 8.4：取395 ml去离子水2加入所有成分（1.24 g 硼酸 + 1.9 g 硼砂）。用 1 M NaOH 调节 pH 至 8.4。定容至 400 ml，并在通风橱中用 0.2 µm 尼龙膜滤器过滤。
      4. 准备 HBSS 溶液，起始使用 445 ml dH₂O，调节 pH 至 7.22O，并加入其余成分（50 ml 10X HBSS 储存液 + 1.2 g HEPES）。用1 N HCl调节pH至7.2，定容至500 ml，在通风橱中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。
      5. 制备铺板培养基：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。在超净台中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。
      6. 配制完全培养基：向50 ml Neurobasal培养基中加入以下补充成分（500 µl GlutaMax（100倍浓缩液）+ 500 µl 葡萄糖 + 1 ml B-27（50倍浓缩液）+ 500 µl 抗生素-抗真菌溶液（100倍浓缩液）+ 100 µl 7.5% 碳酸氢钠）。在超净台中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。
    2. 培养前两天：
      1. 在十二个35 mm玻璃底培养皿中各加入2 ml聚-L-赖氨酸工作液，于通风橱中孵育过夜。
    3. 培养前一天：
      1. 从培养皿中移除包被液，并用 ddH₂O 冲洗2O. 将培养皿置于通风橱内干燥一小时。
      2. 制备铺板培养基（DMEM/F12 加 10% 胎牛血清（占总体积的 10%））。每皿加入 2 ml 培养基，37℃ 过夜培养 oC，5% CO2.
        注意： 培养过程中应避免使用塑料培养皿。建议使用玻璃底培养皿（适用于倒置显微镜）或玻璃盖玻片（适用于正置显微镜），以获得清晰锐利的图像。与塑料底培养皿相比，玻璃底培养皿可避免荧光显微镜观察时产生不必要的色偏或眩光。
  2. 细胞培养方案：
    1. 将冷藏的HBSS缓冲液（100–150 ml）、100 mm培养皿、镊子、剪刀、50 ml离心管和15 ml离心管置于生物安全柜内的紫外灯下照射。
    2. 在培养室外的通风橱内，通过吸入致死剂量的5%七氟烷处死怀孕大鼠。
    3. 用70%乙醇消毒，用镊子提起下腹部皮肤，从尾侧向头侧沿腹腔中线剪开。用剪刀打开子宫以暴露胎盘。
    4. 取出8-10个E18胎鼠，将8-10个胎鼠置于含有HBSS溶液的培养皿中。
    5. 用镊子夹住胎鼠头部背面，然后用剪刀将头部与身体分离。将头部放入另一含有5-7 ml HBSS的培养皿中。将培养皿转移至超净台。
    6. 用冷的HBSS填充另外两个100 mm的培养皿。
    7. 剥离颅骨，将脑组织舀入盛有HBSS的新培养皿中。
    8. 使用锋利的弯头镊子分离小脑和脑干与大脑，然后将大脑转移至含有冷HBSS的新培养皿中。
    9. 用镊子固定，用弯头镊子分离半球。去除软脑膜，分离额叶皮层，并将组织块转移至已标记的15 ml离心管中。
    10. 向15 ml离心管中加入2 ml新鲜HBSS，并向每个15 ml离心管中加入20 µl胰蛋白酶EDTA（10倍浓缩液，含0.5%胰蛋白酶和5.3 mM EDTA）。
    11. 室温孵育10–15分钟，每隔几分钟轻轻摇动管子，避免沉淀。
    12. 孵育10–15分钟后，用玻璃移液管吸除旧的HBSS，再用新的HBSS冲洗两次。
    13. 加入胰蛋白酶抑制剂（1 mg/ml，2 mg 胰蛋白酶抑制剂溶于 2 ml HBSS 中），充分混匀，静置 5 分钟。用新鲜 HBSS 洗涤两次。
    14. 使用带橡胶吸头的玻璃移液管，将脑组织块缓慢吹打10–15次，注意避免产生气泡。随后使用校准移液管和无菌小口径吸头，再次缓慢吹打至均匀。
    15. 将解离后的细胞以所需密度（50个细胞/mm²）接种至预先包被的培养皿中。于37℃孵育过夜。 oC，5% CO2。
    16. 24小时后，将DMEM/F12培养基更换为新鲜配制的完全生长无血清Neurobasal培养基。
    17. 始终将细胞置于5% CO₂环境中培养2在实验前，将细胞置于含95%空气的加湿培养箱中培养至少12–14天。每5–6天更换一次新鲜的Neurobasal培养基，替换约50%的旧培养基。

2. 荧光标记与免疫细胞化学

注意：原代皮层细胞培养物的免疫荧光标记在玻璃底35 mm细胞培养皿中进行，工作体积为1 ml。

  1. 用 pH 7.4 的磷酸盐缓冲液（PBS）清洗玻璃底培养皿两次。
  2. 用 4% 多聚甲醛在室温下固定细胞 15 分钟。
  3. 用 PBS 清洗细胞两次，然后用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 透化处理 5 分钟。
  4. 在室温下用 F-肌动蛋白特异性染料 AlexaFluor 488 Phalloidin（1:40，25 µl Phalloidin 溶于 1 ml PBS）处理细胞 20 分钟。
  5. 用 PBS 清洗细胞两次，然后在室温下用 10% 正常山羊血清封闭 1–2 小时。
  6. 将鸡多克隆抗 MAP2 抗体（1:2,500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释，4 oC 孵育过夜。
  7. 孵育结束后，用 PBS 冲洗两次。
  8. 将二抗（Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG，1:500）用含 2% 正常山羊血清的 PBS 稀释，在室温下孵育 2 小时。
  9. 用 PBS 冲洗后，每皿加入 10 µl Hoescht 染料。
  10. 室温孵育 3 分钟，再用 PBS 清洗两次。
    注意：标记后的细胞现已准备好进行步骤 3（F-肌动蛋白斑点计数）。
  11. 用 100 µl 抗荧光淬灭试剂作为封片剂保存细胞样本，并在 4 oC 避光条件下长期保存。
    注意： Phalloidin 在避光、4 °C 的 PBS 中相对稳定，可维持荧光达 1 周，且使用抗荧光淬灭封片试剂可进一步延长荧光保存时间。然而，最佳成像效果通常在染色后 1–3 天内获得，因为长期储存可能导致 Phalloidin 开始扩散。

3. F-肌动蛋白点状结构计数

  1. 打开荧光显微镜，切换至20×物镜。启动显微镜软件，设置程序参数为1280×960像素的图像尺寸，1×缩放倍数下的图像分辨率为0.17 µm/像素。
  2. 在绿色（495 nm）/红色（613 nm）荧光通道下采集共标记F-actin/MAP2神经元的图像。
  3. 选择5张绿色（F-actin）/红色（MAP2）免疫荧光标记/蓝色（Hoescht）染色的单个神经元图像，要求树突分支结构清晰可辨。
  4. 在二级树突片段（长度范围为25–75 µm）中识别富含F-actin的结构，且该片段需具有连续的MAP2免疫荧光信号。
  5. 将所选图像区域旋转至水平方向，复制并粘贴为新图像。
  6. 对图像进行背景扣除，每个培养皿使用一致的调整参数。
  7. 由经过培训的独立观察者手动计数明亮的绿色F-actin斑点，并追踪所选树突片段的长度。将数据导出至电子表格文件。
  8. 通过将F-actin标记的斑点总数（N）除以MAP2标记树突的长度（L），计算其密度。结果以每10 µm树突长度上的F-actin斑点数量表示。
    注意：纳入分析的F-actin荧光斑点（大小≤1.5 µm）需满足其峰值强度至少高于树突主干平均染色强度的50%。

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结果

在本方法中，我们首先将大鼠皮层神经元以低密度培养于35 mm玻璃底培养皿中，以便识别单个神经元的树突。 图1，微分干涉相差（DIC）图像显示了发育中的胎鼠皮层神经元在第4、6、10、14、21和27天的形态学变化 体外注意，培养的大鼠原代神经元在成熟过程中，树突的长度和数量会增加。实验中使用的神经元需培养至少14天以上方可使用。

为了检测树突和突触的变化，我们将Phalloidin标记F-肌动蛋白与MAP2抗体标记树突的方法相结合。由于Phalloidin对F-肌动蛋白的标记非常迅速（20–30分钟），因此可以在进行免疫细胞化学抗体标记之前，直观评估突触-树突网络的完整性（图2）。MAP2可标记完整的树突，并与Phalloidin染色区域重叠，从而确认F-肌动蛋白斑点位于神经元树突上，而非定位于其他细胞（如星形胶质细胞）。

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讨论

在本实验方案中，我们描述了在35 mm玻璃底培养皿中以低密度培养大鼠皮层神经元的方法，该方法可使我们识别单个神经元的树突。接着，我们使用鬼笔环肽（Phalloidin）和微管相关蛋白2（MAP2）染色来检测树突的形态变化。随后，我们利用专业软件对F-肌动蛋白（F-actin）斑点的变化进行定量分析。

为了确定F-actin斑点的变化，必须清晰显示单个神经元的整个神经网络，以便从单个神经元中选择合适的二级树突区段。低密度接种至关重要，既有助于清晰观察单个神经元，又能最大限度减少胶质细胞的存在。星形胶质细胞也含有F-actin，若无神经元特异性标记物，可能会干扰对F-actin阳性斑点的分析。低密度培养结合使用Neurobasal培养基，有助于减少细胞培养中星形胶质细胞的增殖。然而，鉴于F-actin蛋白并非神经元特有，应将Phalloidin与特异性神经元蛋白标记物（如MAP2）联合使用。此外，也可将其他蛋白抗体与Phalloidin共用，例如酪氨酸羟化酶（TH），用于鉴定培养物中特定的神经元群体。

研究突触及其形态的一种常用技...

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披露

所有作者均无利益冲突需要声明。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助，项目编号为 DA013137、DA031604 和 HD043680。部分支持来自 NIH T32 生物医学-行为科学培训项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片MatTek CorporationP35G-1.5-20-C
DMEM/F12 培养基Life Technologies10565-018
胰蛋白酶-EDTALife Technologies15400-054
聚-L-赖氨酸SigmaP9155
硼酸SigmaB0252
硼砂SigmaB9876
GlutaMaxLife Technologies35050-061100X
葡萄糖VWR101174Y
HBSSSigmaH464110X
Neurobasal 培养基Life Technologies21103-049
B-27 添加剂Life Technologies17504-04450X
抗生素-抗真菌素溶液Cellgro30004CI100X
碳酸氢钠Life Technologies25080
Vannas 剪刀World Precision Instruments500086
虹膜剪刀World Precision Instruments500216
虹膜镊World Precision Instruments15914
Dumont #7 镊子World Precision Instruments14097
Dumont #5 镊子World Precision Instruments14095
ProLong GoldLife TechnologiesP36930
多聚甲醛 SigmaP6148
盖玻片VWR631-0137
AlexaFluor 488 鬼笔环肽Life TechnologiesA12379
正常马血清Life Technologies26050-070
鸡多克隆抗 MAP2 抗体abcamAb92434
Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgGLife TechnologiesA11042
NucBlue 活细胞染色试剂 ReadyProbes（Hoescht 33342）Life TechnologiesR37605
NIS-Elements 软件包Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 倒置荧光计算机控制显微镜 Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene 尼龙膜过滤器Fishersci151-4020

参考文献

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MAP2

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