大鼠皮层神经元中丝状肌动蛋白（F-actin）斑点的定量分析

摘要

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。因此，对F-actin斑点进行定量是研究突触结构完整性的有效工具。本实验方案描述了在低密度原代皮层神经元培养物中，利用鬼笔环肽标记F-actin斑点并进行定量的实验步骤。

摘要

丝状肌动蛋白（F-actin）在树突棘生成、突触可塑性及突触稳定性中发挥重要作用。树突中富含F-actin的结构变化提示突触完整性与连接性的改变。本文提供了一种培养原代大鼠皮层神经元、对F-actin斑点进行鬼笔环肽染色以及后续定量分析的详细实验方案。首先，分离E18大鼠胚胎的额叶皮层组织，制备成低密度细胞培养物，随后培养神经元 体外 至少培养12-14天。实验处理后，皮层神经元使用AlexaFluor 488 Phalloidin染色（用于标记树突F-actin斑点）以及微管相关蛋白2（MAP2；用于验证神经元细胞及树突完整性）。最后，采用专业软件对随机选取的神经元树突进行分析与定量。富含F-actin的结构被识别于具有连续MAP2免疫荧光信号的二级树突分支上（长度范围为25-75 µm）。本方案将为研究实验处理后树突突触结构的变化提供一种有效的方法。

引言

本研究的主要目标是建立一种可靠的方法，用于测量（评估）神经元树突网络的突触完整性。本文描述了利用鬼笔环肽染色与树突的免疫细胞化学（ICC）检测相结合，对原代培养的大鼠神经元中的F-肌动蛋白（F-actin）斑点进行定量分析，并随后使用专业的NIS-Elements软件进行图像分析。

标记的鬼笔环肽对粗细肌动蛋白丝（F-actin）具有相似的亲和力，但与单体球状肌动蛋白（G-actin）不结合，这一点与某些肌动蛋白抗体不同¹。鬼笔环肽的非特异性结合可忽略不计，因此在细胞成像过程中背景信号极低。鬼笔环肽的分子远小于通常用于荧光显微镜标记细胞蛋白的抗体，因而可实现对F-actin更强烈的标记。因此，利用标记的鬼笔环肽可以获得神经元中F-actin定位的详细图像。

神经元树突的鬼笔环肽（F-肌动蛋白）染色会产生离散的"热点"或明亮的"点状结构"，这些结构代表多种树突结构，包括成熟的树突棘、非棘状突触²以及未成熟的树突棘。未成熟的树突棘包括细长的丝状伪足及某些形态的斑块结构，可能代表树突棘形成的起始阶段³。未成熟的树突棘和非棘状斑块缺乏PSD95⁴。F-肌动蛋白生成的变化不仅会导致树突棘的后续改变，还会影响其他树突结构，因此鬼笔环肽成为研究突触-树突完整性的关键工具^5-7。通常，鬼笔环肽阳性....

方案

所有动物实验方案均经南卡罗来纳大学动物护理与使用委员会审查并批准（保证编号：A3049-01）。

1. 低密度胚胎神经元培养

1. 原代皮层神经元培养的准备工作
   1. 溶液：
      1. 将5 mg聚-L-赖氨酸溶解于10 ml硼酸盐缓冲液中，配制聚-L-赖氨酸储存液。
      2. 通过将1 ml聚-L-赖氨酸储存液加入49 ml硼酸盐缓冲液中，配制工作液。
      3. 制备硼酸盐缓冲液，pH 8.4：取395 ml去离子水₂加入所有成分（1.24 g 硼酸 + 1.9 g 硼砂）。用 1 M NaOH 调节 pH 至 8.4。定容至 400 ml，并在通风橱中用 0.2 µm 尼龙膜滤器过滤。
      4. 准备 HBSS 溶液，起始使用 445 ml dH₂O，调节 pH 至 7.2₂O，并加入其余成分（50 ml 10X HBSS 储存液 + 1.2 g HEPES）。用1 N HCl调节pH至7.2，定容至500 ml，在通风橱中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。
      5. 制备铺板培养基：含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基。在超净台中用0.2 µm尼龙膜滤器过滤。
      6. 配制完全培养基：向50 ml Neurobasal培养基中加入以下补充成分（500 µl GlutaM....

结果

在本方法中，我们首先将大鼠皮层神经元以低密度培养于35 mm玻璃底培养皿中，以便识别单个神经元的树突。在图1中，微分干涉差（DIC）图像显示了体外培养的大鼠胎儿皮层神经元在第4、6、10、14、21和27天的形态学变化。体外培养的大鼠原代神经元随着成熟，其树突长度和数量均增加。实验所用神经元需培养至少14天以上方可使用。

为了检测树突和突触的变化，我们将Phalloidin标记F-肌动蛋白与MAP2抗体标记树突的方法相结合。由于Phalloidin对F-肌动蛋白的标记非常迅速（20–30分钟），因此可以在进行免疫细胞化学抗体标记之前，直观评估突触-树突网络的完整性（图2）。MAP2可标记完整的树突，并与Phalloidin染色区域重叠，从而确认F-肌动蛋白斑点位于神经元树突上，而非定位于其他细胞（如星形胶质细胞）。

讨论

在本实验方案中，我们描述了在35 mm玻璃底培养皿中以低密度培养大鼠皮层神经元的方法，该方法可使我们识别单个神经元的树突。接着，我们使用鬼笔环肽（Phalloidin）和微管相关蛋白2（MAP2）染色来检测树突的形态变化。随后，我们利用专业软件对F-肌动蛋白（F-actin）斑点的变化进行定量分析。

为了确定F-actin斑点的变化，必须清晰显示单个神经元的整个神经网络，以便从单个神经元中选择合适的二级树突区段。低密度接种至关重要，既有助于清晰观察单个神经元，又能最大限度减少胶质细胞的存在。星形胶质细胞也含有F-actin，若无神经元特异性标记物，可能会干扰对F-actin阳性斑点的分析。低密度培养结合使用Neurobasal培养基，有助于减少细胞培养中星形胶质细胞的增殖。然而，鉴于F-actin蛋白并非神经元特有，应将Phalloidin与特异性神经元蛋白标记物（如MAP2）联合使用。此外，也可将其他蛋白抗体与Phalloidin共用，例如酪氨酸羟化酶（TH），用于鉴定培养物中特定的神经元群体。

研究突触及其形态的一种常用技.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
35 mm 玻璃底培养皿，1.5 号盖玻片	MatTek Corporation	P35G-1.5-20-C
DMEM/F12 培养基	Life Technologies	10565-018
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400-054
聚-L-赖氨酸	Sigma	P9155
硼酸	Sigma	B0252
硼砂	Sigma	B9876
GlutaMax	Life Technologies	35050-061	100X
葡萄糖	VWR	101174Y
HBSS	Sigma	H4641	10X
Neurobasal 培养基	Life Technologies	21103-049
B-27 添加剂	Life Technologies	17504-044	50X
抗生素-抗真菌素溶液	Cellgro	30004CI	100X
碳酸氢钠	Life Technologies	25080
Vannas 剪刀	World Precision Instruments	500086
虹膜剪刀	World Precision Instruments	500216
虹膜镊	World Precision Instruments	15914
Dumont #7 镊子	World Precision Instruments	14097
Dumont #5 镊子	World Precision Instruments	14095
ProLong Gold	Life Technologies	P36930
多聚甲醛	Sigma	P6148
盖玻片	VWR	631-0137
AlexaFluor 488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379
正常马血清	Life Technologies	26050-070
鸡多克隆抗 MAP2 抗体	abcam	Ab92434
Alexa Red 594 标记的山羊抗鸡 IgG	Life Technologies	A11042
NucBlue 活细胞染色试剂 ReadyProbes（Hoescht 33342）	Life Technologies	R37605
NIS-Elements 软件包	Nikon Instruments
Nikon Eclipse TE2000-E 倒置荧光计算机控制显微镜	Nikon Instruments
0.2 μm Nalgene 尼龙膜过滤器	Fishersci	151-4020