本文介绍了一种利用生物发光报告基因的新型 Ca2+ 成像方法。该方法采用 GFP-aequorin 融合蛋白，该蛋白可结合 Ca2+ 并发光，无需外源光激发。该技术显著实现了长时间连续成像、深部脑结构的观测以及高时间分辨率。
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本文内容
摘要
摘要
功能性 在体内 成像已成为研究脑细胞及特定脑结构功能与生理学的有力手段。近年来，一种新的Ca2+- 利用生物发光报告基因GFP-aequorin（GA）的成像技术已经建立。该新技术依赖于GFP基因与aequorin基因的融合，产生一种能够结合钙离子的分子，并在加入其辅因子腔肠素（coelenterazine）后发出强光，可通过光子收集器进行监测。目前已构建出携带GFP-aequorin基因的转基因小鼠品系 果蝇 在 果蝇，绿色荧光蛋白-水母素（GFP-aequorin）基因已被置于GAL4/UAS双元表达系统的调控之下，从而实现脑内特定区域的靶向表达与成像。后续研究证实，该方法能够检测到内向钙离子（Ca²⁺）信号2+-瞬变和Ca2+-从细胞内储存库中释放。最重要的是，该方法能够实现更长时间的连续记录，对大脑更深层区域进行成像，并以高时间分辨率（高达8.3毫秒）进行记录。本文介绍了利用生物发光成像记录和分析Ca2+-果蝇脑中与学习和记忆相关的核心结构——蘑菇体内的活动。
引言
大脑及其离散结构内活动的基本图式与功能长期以来一直是神经科学领域深入研究的重点。或许最早成功解决这一问题的方法之一是直接进行生理学测量，即检测电活动的变化；然而，其他能够实时成像电压、pH值或钙离子浓度变化（作为神经活动的间接指标）的方法为神经元活动的研究提供了更多能力1。成像技术具有多种优势，例如侵入性更小，并能够监测整个脑结构内的活动。此外，在遗传操作较为便利的动物中（如果蝇Drosophila），研究人员已开发出基因编码的钙离子指示剂（如cameleon、GCaMPs等）1，使得单个神经元、神经元群体乃至整个脑结构的活动监测成为可能。尽管传统的基于GCaMPs（绿色荧光蛋白GFP与钙调蛋白融合）或FRET技术（CFP和YFP与钙调蛋白融合）的荧光钙成像方法已被证明是有效的，并具有良好的空间和时间分辨率，但其依赖光激发的基本机制也带来了一些实验应用上的限制。由于光激发的特性，不可避免地会产生自发荧光、光漂白和光毒性，从而限制了可成像结构的深度、记录的持续时间以及记录的实时连续性。换句话说，为避免这些不良副作用，记录通常必须间歇性地进行。
由于这些挑战，人们已开发出其他替代性的钙成像方法。其中最有前景的方法之一是生物发光成像，该方法依赖于钙结合后通过酶促反应产生的光。生物发光成像不需要激发光，因此不会遇到传统钙成像所面临的相同困难。生物发光报告分子Aequorin来源于Aequorea victoria<....
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方案
1. 样品制备
- 溶液制备与实验装置搭建
- 保持所有 黑腹果蝇 24代 °在标准食物培养基上饲养。在试管中以低密度培养和保存果蝇，以获得大小和体重标准化的个体。
- 将10只处女雌蝇与10只雄蝇放入一试剂瓶中，让其交配，并每2天转移至新的试剂瓶。10天后，当果蝇开始羽化时，每天收集果蝇。准确记录果蝇的日龄，并保持其良好状态。
- 第3天将雄蝇与雌蝇分开，每瓶保留20只雌蝇。在果蝇4至5日龄时进行记录。
- 配制任氏液，其成分为：130 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM MgCl₂2，2 mM CaCl₂2，5 mM HEPES 和 36 mM 蔗糖，并将溶液的 pH 精确调整至 7.3。准备 25 的灌注溶液 µM 尼古丁和 100 mM KCl 的任氏液。
- 制备 1,000 µl 移液器吸头：使用剃须刀片将吸头尖端切成斜面（约 35° 从尖端末端开始，去除多余的基部部分 ½ 尖端以下厘米处
- 准备一个用于孵育期间储存样品的盒子（23 cm × 17 cm × 8.5 cm），在盒子底部放置两块吸水后的海绵（12 cm × 8 cm × 3 cm），并在海绵上方放置一个小的支架装置，用于承载已完成制备的样品，以防止样品干燥。 ....
- 保持所有 黑腹果蝇 24代 °在标准食物培养基上饲养。在试管中以低密度培养和保存果蝇，以获得大小和体重标准化的个体。
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结果
将GFP与aequorin融合，使我们能够在显微镜的荧光模式下激发GFP，从而在进行生物发光成像之前可视化我们的目标区域（图3A、4A、6A、6E）。刺激蘑菇体的最简单方法之一是激活离子型烟碱型乙酰胆碱受体。尽管乙酰胆碱是该受体的内源性配体，但我们发现尼古丁在蘑菇体中能产生更可重复的反应。部分原因是蘑菇体特异性表达烟碱型乙酰胆碱受体，因此使用尼古丁可避免激活脑内其他区域表达的毒蕈碱型乙酰胆碱受体。此外，尼古丁比乙酰胆碱更稳定，因而能够实现更佳且更可靠的刺激控制。典型的反应首先表现为萼区、细胞体（CCB）和内侧叶（ML）的快速激活（参见图4A中标注的图像）。通常情况下，CCB的反应持续时间更长，且生物发光信号强于叶区，如反应的连续图像面板所示（图3C-H）。图4B显示了在25 µM尼古丁灌注1分钟的反应峰值期间，以100毫秒（10 Hz）时间分辨率记录的10秒光子累积情况。在经过10分钟的洗脱和恢复期后，开始第二次刺激，即灌注100 mM KCl持续1分钟（图4C、E），.......
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讨论
本文介绍的基于生物发光的GFP-aequorin方法最近得到发展，可实现对不同神经元中Ca2+活性的体内功能记录，也可根据需要用于其他类型细胞（如Cabrero et al., 20135中报道的肾星状细胞）的记录。
修改步骤、故障排除、附加组件及关键步骤
Drosophila 饲养管理
将GFP-aequorin转基因（pG5A）4插入pUAST载体中，构建了三个独立的转基因品系6。对所有品系均检测了其生物发光特性，结果表明它们均能响应体内的Ca2+活性6。然而，近期实验发现，插入第三号染色体的GA2品系所产生的信号比插入第二号染色体的GA1品系更为强烈。本文所示代表性结果系通过将UA.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们衷心感谢美国 Sciences Wares 公司的 E. Karplus 提供的宝贵且富有成效的帮助与建议。感谢 E. Carbognin、A. Avet-Rochex、M. Murmu、P. Pavot、D. Minocci、G. Vinatier 和 J. Stinnakre 为本技术的开发与改进所做出的贡献。我们还感谢美国阿什本霍华德·休斯医学研究所珍利亚农场（Janelia Farm, H.H.M.I.）的 B. Pfeiffer 和 G. Rubin 提供 pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP 品系。本研究得到了美国华盛顿法国大使馆的夏多布里昂奖学金（Chateaubriand Fellowship）对 A. Lark 的资助，美国国家科学基金会（National Science Foundation，项目编号 IOS 1352882）对 T. Kitamoto 的资助，以及法国国家研究局（ANR）（项目 ANR-05-NEUR-009 Drosaequorin，2005 年，和 FlyBrainImaging，2011 年）、法兰西岛大区议会（Conseil Régional Ile-De France，NeRF 和 DIM 项目）、IFR-144、法国国家科学研究中心（CNRS）物理-化学-生物学交叉项目（2009 年）和法国国家科学研究中心（CNRS）对 JR Martin 的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| CaCl2 | Merck | 1023911000 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | 7365-45-9 | |
| KCl | prolabo | 26 764.298 | normapur |
| MgCl2 | prolabo | 25 108.295 | normapur |
| 蔗糖 | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| 尼古丁 | Sigma-Aldrich | N3876 | |
| ATP | Sigma-Aldrich | A2383 | 腺苷-5′-三磷酸二钠盐水合物 |
| 苄基腔肠素 | Prolume, nanolight | Cat #301 Coelenterazine h | http://www.prolume.com/ |
| 牙科胶 | 3M ESPE™ | 46954 | Protemp IV |
| 硅胶 | 3M ESPE™ | 36958 | Express 2 Regular Body Quick |
| 胶带 | 3M Scotch | 122s | 3M Scotch Magic Tape |
| 移液器吸头 | Corning Incorporated | 4868 | 100–1,000 µl 通用移液器吸头 |
| 灌流室及支架（载物台） | 自制 | ||
| 孵育盒 | 自制 | ||
| 镊子（5号） | Fine Science Tools | 11252-00 | 显微解剖镊 |
| 弯头镊子 | Sigma-Aldrich | F4142 | 显微解剖镊 |
| 胶水涂布器 | 自制 | ||
| 刀片 | Fine Science Tools | 10316-14 | 5 mm 深度 15° 刺切刀 |
| EM-CCD 相机 | Andor | DU-897E-CS0-#BV | iXon（冷却至 -80 °C） |
| 显微镜 | Nikon | Eclipse-E800 | |
| 浸油物镜 | Nikon | 20X Fluor .5w | |
| 带荧光功能的解剖显微镜 | Leica MZ Fl III | Leica 解剖显微镜及荧光灯 | |
| 密闭暗箱 | Science Wares | 由 Science Wares 定制制作 | |
| 蠕动泵 | Gilson | Minipuls 2 | |
| 管路 | Fisher Scientific | 取决于厚度 | Tygon R3603, St-Gobain |
| 灌流系统 | Warner | 64-0135 (VC-66CS) | 灌流阀控制系统，完整配置，带夹管阀，6通道 |
| 灌流调节器 | Leventon | 201108 | Dosi-flow 3 |
| 测量与自动化管理器 | Sciences Wares & National Instruments | N/A | 软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| 光子成像软件 | Science Wares & National Instruments | N/A | 软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| 光子查看器 | Science Wares & National Instuments | N/A | 软件 http://sine.ni.com/nips/cds/view/p/lang/en/nid/1380 |
| Excel | Microsoft | N/A | 软件 https://www.microsoft.com |
| VirtualDub | 开源软件 | N/A | 软件 http://virtualdub.sourceforge.net/ |
| UAS-GA2 | Martin et al., 2007, 参考文献 1 | N/A | 目前无公开品系 |
| pJFRC65-13XLexAop2-IVS-G5A-BP | B. Pfeiffer, Janelia Farms, Ashburn 美国 | (STOCK #1117340) | pfeifferb@janelia.hhmi.org |
| P2X2 | Lima 和 Misenboeck，参考文献 11 | N/A | 目前无公开品系 |
| OK107 | Bloomington 果蝇品系中心 | 854 | http://flystocks.bio.indiana.edu/ |
参考文献
- Martin, J. -R. In vivo brain imaging: fluorescence or bioluminescence, which to choose. J Neurogenet. 22 (3), 285-307 (2008).
- Shimomura, O., Johnson, F. H. Peroxidized coelenterazine, the active group in the photoprotein aequorin. Proc Natl Acad Sci....
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重印与许可
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