本文介绍了一种改良的相对简便的方法，利用荧光染料二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢乙啶（DHE），对肥胖小鼠模型新鲜分离的完整主动脉进行内皮表面（en face）同时检测和可视化细胞内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（O2.−）。
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摘要
摘要
内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的内皮源性一氧化氮（NO）是心血管生理中最重要的血管保护分子之一。eNOS功能障碍（如eNOS解偶联）会导致NO生物利用度下降以及超氧阴离子（O₂⁻）生成增加。2.−）的生成，进而促进心血管疾病的发生。因此，对NO和O₂⁻进行适当的检测至关重要。2.− 内皮细胞中的一氧化氮（NO）和氧自由基水平对心血管疾病及其并发症的研究至关重要。由于NO和O2.−，很难测量NO和O2.− 直接进入血管。目前已开发出多种方法用于检测NO和O2.− 生产。然而，该方法要么灵敏度低，要么缺乏特异性，要么技术要求高且需要特殊设备。本文中，我们介绍了一种对荧光染料法的改进方案，用于 正面 同时检测与可视化细胞内一氧化氮和氧2.− 使用细胞膜通透性探针二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢溴化乙啶（DHE），分别检测高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型完整主动脉中的细胞内一氧化氮和超氧阴离子水平。我们证实了细胞内一氧化氮减少，同时超氧阴离子增加2.− 与对照组瘦鼠相比，肥胖小鼠新鲜分离的完整主动脉中NO和O₂⁻水平的变化。我们证明，该方法是一种简便的技术，可用于直接检测和可视化NO与O₂⁻2.− 在完整的血管中进行研究，并可广泛应用于各种（生理）病理条件下内皮功能（失调）的探究。
引言
血管内皮细胞通过释放血管活性因子维持血管的功能和结构完整性1在这些因素中，由L-精氨酸通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在内皮细胞中生成的一氧化氮（NO），是心血管生理学中最为重要且研究最为清楚的因素。2一氧化氮（NO）可引起平滑肌松弛，抑制细胞增殖，抑制血小板聚集以及炎症细胞向内皮下区域的黏附和浸润，从而预防血管疾病的发生。3在多种生理和病理条件下，包括衰老、高血压、糖尿病、高脂血症， 等等。，以内皮功能障碍为特征，表现为一氧化氮（NO）生物利用度降低和超氧阴离子（O₂⁻）生成增加2.- 存在并促进动脉粥样硬化的发病机制2近年来的研究表明，eNOS解偶联是内皮功能障碍的重要机制，其中eNOS酶生成O2.- 而非NO，在上述各种条件下1,4因此，内皮功能的分析，特别是内皮一氧化氮（NO）的生成和O2.- 生成对于心血管疾病及其并发症的实验研究至关重要。
已开发出多种方法学手段用于分析和测定生物样本中的一氧化氮（NO）生成。由于NO化学性质极不稳定，极易被氧化为亚硝酸根（NO2-）和硝酸根（NO3-），其半衰期仅为3至6秒，因此直接检测....
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方案
动物实验已获得瑞士弗里堡州兽医办公室伦理委员会的批准。本方案遵循本机构关于动物护理和实验的指导方针。
1. 分离动脉孵育装置的准备
- 构建一个可加热至 37 °C 并能从二氧化碳气罐中通入 95% O2 和 5% CO2 进行充气的器官浴系统。
- 根据以下成分浓度配制所需量的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液：（118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1.2 mM MgSO4、1.2 mM KH2PO4、25 mM NaHCO3、0.026 mM EDTA 和 11.1 mM D-葡萄糖）。
- 将储备缓冲液置于冰上保存，并用 95% O2 和 5% CO2 对缓冲液进行持续充气。
- 开启器官浴系统，将温度设定为 37 °C，向每个腔室中加入 5 ml 即用型缓冲液，并持续用 95% O2 和 5% CO2 对缓冲液进行充气。
- 用克雷布斯-林格缓冲液清洗腔室一次，持续 30 分钟。
- 向每个腔室中加入 5 ml 克雷布斯-林格缓冲液，并覆盖腔室以防止蒸发。
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结果
肥胖是缺血性冠心病的重要危险因素，且与内皮一氧化氮（NO）生物利用度降低相关，后者是动脉粥样硬化性血管疾病的标志性特征21。已有研究表明，eNOS 去偶联是在多种生理和病理条件下导致内皮功能障碍的重要机制，这些条件包括衰老22、动脉粥样硬化和肥胖14。因此，本研究通过比较瘦型与肥胖小鼠，展示其主动脉中 NO 和 O2.− 水平的代表性结果。
从7周龄开始，雄性小鼠（C57BL/6J）分别自由摄取正常饲料（NC；能量组成：10.6%脂肪、27.6%蛋白质、57%碳水化合物，纤维4.8%）或高脂饮食（HFD，能量组成：55%脂肪、21%蛋白质、24%碳水化合物），持续14周。HFD喂养14周后，处死小鼠并分离胸主动脉，清除附着组织。在进行DAF-2DA和DHE染色前，向孵育 chamber 中加入eNOS抑制剂L-NG-硝基精.......
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讨论
一氧化氮或氧气的检测2.− 使用荧光染料的方法在培养的内皮细胞以及组织冰冻切片的多项研究中经常被采用23在此，我们将该方法拓展应用于完整且存活的血管组织， 即, 正面 一氧化氮与氧气的检测2.− 分别使用 DAF-2DA 和 DHE 检测内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子水平，该方法有效、相对简便且直观。与血管冷冻切片法相比，该方法背景信号更低，定量性更佳，因为动脉中膜（尤其是主动脉冷冻切片）中的弹性纤维会产生强烈的自发荧光信号，可能干扰特异性的 NO 或 O₂⁻ 检测。2.− 内皮细胞中产生的信号。此外，特定的O2.− 由血管中膜平滑肌细胞中的NADPH氧化酶或其他酶产生的活性氧可能干扰血管节段内皮细胞中的信号，这是使用血管冷冻切片方法的一个缺点。相比之下， 正面 染色方法可特异性检测完整血管节段内皮层的信号，因而可提供更精确的分析。用于制备冷冻切片的恒冷切片机也是一笔昂贵的投入。与其他生物.......
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作由瑞士国家科学基金会（310030_141070/1）、瑞士心脏基金会和瑞士国家能力研究中心（NCCR-Kidney.CH）资助。余毅受到中国国家留学基金管理委员会的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二氢乙啶（DHE） | Invitrogen | D 1168 | 用DMSO溶解至5 mmol/L作为1,000倍储存液，储存于-20 °C |
| 二乙酸二氨基荧光素-2（DAF-2DA） | Calbiochem | 251505 | 用DMSO溶解至5 mmol/L作为1,000倍储存液，储存于-20 °C |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI） | Invitrogen | D 1306 | 用水溶解至300 µmol/L作为1,000倍储存液，储存于4 °C |
| 封片剂 | Vector labor. (reactolab) | H-1000 | |
| Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME） | Sigma-aldrich | N5751 | |
| 戊巴比妥 | Sigma-aldrich | P3636 | |
| 多通道肌张力测定系统 | Danish Myo Technology A/S | Model 610M | |
| 显微镜 | Nikon | SMZ800 | |
| 共聚焦显微镜 | Leica | DM6000 | |
| 图像处理软件 | 美国国立卫生研究院（NIH） | Image J | |
| 手术剪 | S&T AG | SDC-11 | |
| 显微外科剪 | F.S.T | 15000-01 | |
| 镊子 | S&T AG | JF-5 | |
| 圆形盖玻片，直径15 mm | VWR | 631-1579 | |
| 1 ml吸头 | VWR | RFL-1200c | |
| 200 μl吸头 | VWR | 613.0659 | |
| Eppendorf安全锁扣管，1.5 ml | Eppendorf | 30120086 | |
| 乙酰胆碱氯化物 | Sigma-aldrich | A-6625 |
参考文献
- Yang, Z., Ming, X. F. Arginase: the emerging therapeutic target for vascular oxidative stress and inflammation. Front Immunol. 4, 149(2013).
- Forstermann, U., Sessa, W. C. Nitric oxide synthases: regulation and function. Eur Heart J. 33 (7), 829-837....
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重印与许可
