En Face 法检测完整动脉内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子

摘要

本文介绍了一种改良的相对简便的方法，利用荧光染料二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢乙啶（DHE），对肥胖小鼠模型新鲜分离的完整主动脉进行内皮表面（en face）同时检测和可视化细胞内一氧化氮（NO）与超氧阴离子（O₂^.−）。

摘要

内皮型一氧化氮合酶（eNOS）产生的内皮源性一氧化氮（NO）是心血管生理中最重要的血管保护分子之一。eNOS功能障碍（如eNOS解偶联）会导致NO生物利用度下降以及超氧阴离子（O₂⁻）生成增加。₂^.−）的生成，进而促进心血管疾病的发生。因此，对NO和O₂⁻进行适当的检测至关重要。₂^.− 内皮细胞中的一氧化氮（NO）和氧自由基水平对心血管疾病及其并发症的研究至关重要。由于NO和O₂^.−，很难测量NO和O₂^.− 直接进入血管。目前已开发出多种方法用于检测NO和O₂^.− 生产。然而，该方法要么灵敏度低，要么缺乏特异性，要么技术要求高且需要特殊设备。本文中，我们介绍了一种对荧光染料法的改进方案，用于 正面 同时检测与可视化细胞内一氧化氮和氧₂^.− 使用细胞膜通透性探针二氨基荧光素-2 二乙酸酯（DAF-2DA）和二氢溴化乙啶（DHE），分别检测高脂饮食诱导的肥胖小鼠模型完整主动脉中的细胞内一氧化氮和超氧阴离子水平。我们证实了细胞内一氧化氮减少，同时超氧阴离子增加₂^.− 与对照组瘦鼠相比，肥胖小鼠新鲜分离的完整主动脉中NO和O₂⁻水平的变化。我们证明，该方法是一种简便的技术，可用于直接检测和可视化NO与O₂⁻₂^.− 在完整的血管中进行研究，并可广泛应用于各种（生理）病理条件下内皮功能（失调）的探究。

引言

血管内皮细胞通过释放血管活性因子维持血管的功能和结构完整性¹在这些因素中，由L-精氨酸通过内皮型一氧化氮合酶（eNOS）在内皮细胞中生成的一氧化氮（NO），是心血管生理学中最为重要且研究最为清楚的因素。²一氧化氮（NO）可引起平滑肌松弛，抑制细胞增殖，抑制血小板聚集以及炎症细胞向内皮下区域的黏附和浸润，从而预防血管疾病的发生。³在多种生理和病理条件下，包括衰老、高血压、糖尿病、高脂血症， 等等。，以内皮功能障碍为特征，表现为一氧化氮（NO）生物利用度降低和超氧阴离子（O₂⁻）生成增加₂^.- 存在并促进动脉粥样硬化的发病机制²近年来的研究表明，eNOS解偶联是内皮功能障碍的重要机制，其中eNOS酶生成O₂^.- 而非NO，在上述各种条件下^1,4因此，内皮功能的分析，特别是内皮一氧化氮（NO）的生成和O₂^.- 生成对于心血管疾病及其并发症的实验研究至关重要。

已开发出多种方法学手段用于分析和测定生物样本中的一氧化氮（NO）生成。由于NO化学性质极不稳定，极易被氧化为亚硝酸根（NO₂^-）和硝酸根（NO₃^-），其半衰期仅为3至6秒，因此直接检测NO非常困难。因此，通常通过测定液体样本中NO₂^-/NO₃^-的含量作为细胞或组织释放NO的指标⁵。尽管该方法操作相对简便，但易受溶液中原本存在的稳定态NO₂^-/NO₃^-背景值较高的干扰。由于NO可激活可溶性鸟苷酸环化酶，促进环磷酸鸟苷（cGMP）的生成⁶，因此也常通过测定细胞内cGMP水平来间接评估NO的释放⁷。然而，这种方法同样是间接估算，且特异性较差，因为某些内皮源性因子（如C型利钠肽，CNP）也可通过激活颗粒型鸟苷酸环化酶来升高cGMP水平⁸。NO由L-精氨酸生成，同时产生L-瓜氨酸作为副产物⁹，因此测定L-瓜氨酸的生成量也被用作间接评估NO生成的方法之一。该方法的主要缺点在于其具有放射性，且无法反映生物活性NO的实际水平，因为释放出的NO可能迅速被超氧阴离子（O₂^.−）灭活；此外，L-瓜氨酸还可被重新转化为L-精氨酸¹⁰。其他化学检测方法，如化学发光法¹¹、电子自旋共振法¹²或电化学卟啉类NO传感器¹³，也被部分研究者所采用。这些方法通常操作复杂，检测过程繁琐，并需要特殊仪器设备。还需指出的是，许多研究采用离体血管灌流实验（organ bath实验），利用带有或不带内皮的离体血管来评估内皮功能，并间接测量内皮源性NO介导的血管舒张反应。然而，尽管该方法在生理相关性上较为接近真实情况，但严格来说并不直接测定NO的功能，而是总体评估由内皮介导的血管舒缩反应，其结果反映了内皮型一氧化氮合酶（eNOS）功能、其他内皮源性舒张因子与收缩因子的生成、超氧阴离子（O₂^.−）的产生以及平滑肌细胞对这些因子反应性的综合效应。因此，通常仍需对eNOS功能或NO生成进行特异性分析³。

近年来，包括我们研究组在内的许多科研团队均采用荧光染料法检测细胞内一氧化氮的生成^14-19. 在该方法中，采用细胞可渗透的荧光指示剂二氨基荧光素-2 二乙酸盐（DAF-2DA）来检测活细胞和组织中的游离一氧化氮及一氧化氮合酶功能 体外 或 离体其原理是：在活细胞内，DAF-2DA 被细胞内酯酶去乙酰化生成无荧光的 4,5-二氨基荧光素（DAF-2），后者再与一氧化氮（NO）反应生成具有荧光的 DAF-2 三唑（DAF-2T）。DAF-2T 的荧光可在荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜下观察。 ¹⁴因此，细胞内荧光强度反映了细胞或完整血管内皮中的细胞内一氧化氮（NO）生成水平。结合使用特定荧光染料如二氢乙啶（DHE），可同时评估细胞内NO和O₂⁻水平。₂^.− 细胞或血管中的生成¹⁴同样，DHE 也是一种可渗透细胞的化合物，可被 O₂^.− 细胞内，其氧化产物随后与核酸嵌插结合，发出明亮的红色荧光，可通过荧光显微镜或荧光共聚焦显微镜进行定量检测。DHE 是一种用于检测 O₂⁻ 的高度特异性染料₂^.− 从生物样本中检测超氧阴离子自由基时具有优势，因其几乎专一性地检测超氧阴离子自由基，细胞保留效果良好，甚至可耐受轻度固定处理²⁰该荧光染料方法的优点之一在于能够检测并可视化一氧化氮（NO）和/或超氧阴离子（O₂⁻）₂^.− 正面 直接作用于活体血管的完整内皮层。

本文中，我们描述了一种用于检测一氧化氮（NO）和超氧阴离子（O₂^.−）的荧光染料方法，该方法已被我们改进，适用于高脂饮食（HFD）诱导的肥胖小鼠模型完整主动脉中NO和O₂^.−的内皮面（en face）检测。我们证明，该方法能够成功且可靠地测量肥胖状态下新鲜分离的小鼠完整主动脉内皮层中的NO和O₂^.−水平，并评估内皮型一氧化氮合酶（eNOS）的功能状态（正常或功能障碍）。

方案

动物实验已获得瑞士弗里堡州兽医办公室伦理委员会的批准。本方案遵循本机构关于动物护理和实验的指导方针。

1. 分离动脉孵育装置的准备

1. 构建一个可加热至 37 °C 并能从二氧化碳气罐中通入 95% O₂ 和 5% CO₂ 进行充气的器官浴系统。
2. 根据以下成分浓度配制所需量的克雷布斯-林格碳酸氢盐缓冲液：（118 mM NaCl、4.7 mM KCl、2.5 mM CaCl₂、1.2 mM MgSO₄、1.2 mM KH₂PO₄、25 mM NaHCO₃、0.026 mM EDTA 和 11.1 mM D-葡萄糖）。
3. 将储备缓冲液置于冰上保存，并用 95% O₂ 和 5% CO₂ 对缓冲液进行持续充气。
4. 开启器官浴系统，将温度设定为 37 °C，向每个腔室中加入 5 ml 即用型缓冲液，并持续用 95% O₂ 和 5% CO₂ 对缓冲液进行充气。
5. 用克雷布斯-林格缓冲液清洗腔室一次，持续 30 分钟。
6. 向每个腔室中加入 5 ml 克雷布斯-林格缓冲液，并覆盖腔室以防止蒸发。

2. 小鼠主动脉的分离

1. 以150 mg/kg的剂量将戊巴比妥钠溶解于0.9% NaCl溶液中，通过腹腔注射以处死小鼠。
2. 将小鼠仰卧位固定于手术板上。
3. 用70%乙醇喷洒胸部区域的毛发，以达到消毒和湿润的目的。
4. 沿肋骨剪开胸腔，暴露心脏和肺，并取出肺组织。
5. 用纸巾轻轻吸除胸腔内的血液。
6. 用镊子轻轻夹住心脏，用手术剪刀剪除主动脉与脊柱之间的血管周围脂肪组织，分离胸主动脉。
7. 立即将全部组织浸入冰浴（4 °C）的Krebs-Ringer缓冲液中。
8. 在解剖显微镜下分离心脏和主动脉弓，并将胸主动脉节段保留在缓冲液中。
9. 在显微镜下使用手术剪刀和镊子将主动脉从附着的血管周围组织中仔细剥离。
10. 用镊子夹住主动脉末端，使用26 G × 1/2ʺ注射器轻轻冲洗Krebs-Ringer缓冲液，以清除血管腔内的血液。
11. 将清洗后的主动脉环切成3 mm长的节段。
    注意：此步骤需注意避免损伤内皮层。

3. DHE 和 DAF-2DA 染色

1. 用镊子将清洗干净的主动脉节段转移至盛有 Krebs-Ringer 缓冲液的器官浴槽中，缓冲液温度维持在 37 °C，并以 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体持续通气。
   注意：仅可用镊子接触主动脉环的外膜侧，切勿夹压血管。
2. 将动脉在器官浴槽中平衡孵育 30 分钟。
3. 向器官浴槽中加入乙酰胆碱（ACh），使其终浓度为 1 µM，继续孵育动脉 10 分钟。
4. 在 1.5 ml 微量离心管中，用预热的 Krebs-Ringer 缓冲液配制 1 ml DHE/DAF-2DA 溶液（每种染料终浓度为 5 µM，由 1,000× 储液稀释而来）。用铝箔包裹微量离心管以避光。
5. 刺激完成后，将主动脉环从器官浴槽转移至含 DHE/DAF-2DA 溶液的微量离心管中，在 37 °C 下以 95% O₂ 和 5% CO₂ 混合气体通气，孵育 30 分钟。
   注意：从本步骤开始，始终将主动脉置于避光环境中。
6. 将主动脉环转移至另一新的含 Krebs-Ringer 缓冲液的微量离心管中进行清洗，1 分钟内重复清洗三次。
7. 将主动脉环转移至 4% 多聚甲醛溶液中固定 30 分钟。
8. 在 1.5 ml 微量离心管中，用磷酸盐缓冲液（PBS）配制 1 ml 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）溶液（终浓度 300 nM，由 1,000× 储液稀释而来）。对主动脉进行复染，染色时间为 3 分钟。
9. 将主动脉转移至另一新的含 PBS 缓冲液的微量离心管中清洗 1 分钟，重复清洗三次。
   注意：操作时注意避免夹压主动脉环或损伤内皮层。

4. En Face 封片

1. 在载玻片上加一滴封片剂。
2. 在显微镜下用显微手术剪将主动脉环纵向剪开，使卷曲的主动脉展平并固定 正面 将主动脉置于载玻片的封片介质上，内皮面朝下。不要来回移动主动脉。
3. 用盖玻片覆盖载玻片，并用指甲油密封。
4. 避光干燥后，数小时内直接用于成像，或于-20 °C保存数天后使用。

5. 共聚焦显微镜成像

1. 使用共聚焦显微镜检测荧光信号。打开仪器，并优化成像参数，如放大倍数、扫描速度、分辨率和Z轴步进。
   1. 本方案中，使用200 Hz的扫描速度、分辨率为1,024 × 1,024像素，Z轴步进为0.25 µm。使用488 nm氩激光激发DAF-2DA的荧光，并在515 nm处检测信号；使用514 nm激光激发DHE的荧光，并在605 nm发射波长处检测信号。
2. 先用10倍物镜对样品进行聚焦，直至在紫外光下观察到清晰的DAPI信号，然后将物镜调整至40倍放大。
3. 通过调节控制面板上的Z轴位置，确定内皮层的范围。DAPI染色的细胞核在内皮层中呈现为椭圆形或圆形的点状信号。
4. 从样品顶部（管腔边界处的内皮层）开始，贯穿整个内皮信号的厚度进行扫描并记录图像。每个样品至少选择3个不同的视野进行扫描。

6. 图像分析

1. 使用软件打开共聚焦显微镜扫描的数据。每视野选择三张连续图像进行分析，每个样本至少分析三个不同的视野。导出所选图像并保存为 JPEG 文件。
2. 使用图像处理软件对 DAF-2DA、DHE 和 DAPI 染色的图像进行定量分析。对于 DAPI 染色图像，选择“Plugins”→“Analyze”→“Cell Counter”来计数 DAPI 阳性细胞核的数量。
   1. 对于 DAF-2DA 和 DHE 染色的图像，选择“Analyze”→“Measure”分析信号强度，并以“Mean”值作为相对信号强度。结果以 DAF-2DA 与 DAPI 阳性细胞核的比值或 DHE 与 DAPI 的比值表示。对每个样本，取每张图像和每个视野的平均值。
3. 将每个样本的结果除以对照组的平均值，得到倍数变化。统计分析采用非配对 Student t 检验或 ANOVA 结合 Dunnett 或 Bonferroni 事后检验。数据以均值±标准误（mean±SEM）表示。当 p<0.05 时，认为均值差异具有统计学显著性¹⁴。

结果

肥胖是缺血性冠心病的重要危险因素，且与内皮一氧化氮（NO）生物利用度降低相关，后者是动脉粥样硬化性血管疾病的典型特征²¹。已有研究表明，eNOS去偶联是在多种生理和病理条件下内皮功能障碍的重要机制，这些条件包括衰老²²、动脉粥样硬化和肥胖¹⁴。因此，本文通过比较瘦型与肥胖小鼠，展示主动脉中NO和O₂^.−水平的代表性结果。

从7周龄开始，雄性小鼠（C57BL/6J）被自由摄食正常饲料（NC；能量组成：10.6%脂肪、27.6%蛋白质和57%碳水化合物，纤维4.8%）或高脂饲料（HFD；能量组成：55%脂肪、21%蛋白质和24%碳水化合物），持续14周。HFD喂养14周后，处死小鼠并分离胸主动脉，清除附着组织。在进行DAF-2DA和DHE染色前，将eNOS抑制剂L-N^G-硝基精氨酸甲酯（L-NAME）（1 mM）加入浴槽中孵育...

讨论

一氧化氮或氧气的检测₂^.− 使用荧光染料的方法在培养的内皮细胞以及组织冰冻切片的多项研究中经常被采用²³在此，我们将该方法拓展应用于完整且存活的血管组织， 即, 正面 一氧化氮与氧气的检测₂^.− 分别使用 DAF-2DA 和 DHE 检测内皮层中的一氧化氮和超氧阴离子水平，该方法有效、相对简便且直观。与血管冷冻切片法相比，该方法背景信号更低，定量性更佳，因为动脉中膜（尤其是主动脉冷冻切片）中的弹性纤维会产生强烈的自发荧光信号，可能干扰特异性的 NO 或 O₂⁻ 检测。₂^.− 内皮细胞中产生的信号。此外，特定的O₂^.− 由血管中膜平滑肌细胞中的NADPH氧化酶或其他酶产生的活性氧可能干扰血管节段内皮细胞中的信号，这是使用血管冷冻切片方法的一个缺点。相比之下， 正面 染色方法可特异性检测完整血管节段内皮层的信号，因而可提供更精确的分析。用于制备冷冻切片的恒冷切片机也是一笔昂贵的投入。与其他生物...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二氢乙啶（DHE）	Invitrogen	D 1168	用DMSO溶解至5 mmol/L作为1,000倍储存液，储存于-20 °C
二乙酸二氨基荧光素-2（DAF-2DA）	Calbiochem	251505	用DMSO溶解至5 mmol/L作为1,000倍储存液，储存于-20 °C
4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）	Invitrogen	D 1306	用水溶解至300 µmol/L作为1,000倍储存液，储存于4 °C
封片剂	Vector labor. (reactolab)	H-1000
Nω-硝基-L-精氨酸甲酯盐酸盐（L-NAME）	Sigma-aldrich	N5751
戊巴比妥	Sigma-aldrich	P3636
多通道肌张力测定系统	Danish Myo Technology A/S	Model 610M
显微镜	Nikon	SMZ800
共聚焦显微镜	Leica	DM6000
图像处理软件	美国国立卫生研究院（NIH）	Image J
手术剪	S&T AG	SDC-11
显微外科剪	F.S.T	15000-01
镊子	S&T AG	JF-5
圆形盖玻片，直径15 mm	VWR	631-1579
1 ml吸头	VWR	RFL-1200c
200 μl吸头	VWR	613.0659
Eppendorf安全锁扣管，1.5 ml	Eppendorf	30120086
乙酰胆碱氯化物	Sigma-aldrich	A-6625