一种监测IRF3磷酸化依赖性激活的高分辨率方法

摘要

本文介绍了一种能够对IRF3转录因子的磷酸化依赖性激活进行详细分析的实验方法。该方法结合了高分辨率SDS-PAGE和天然PAGE，并利用多种磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析，从而实现对IRF3活化状态的精确检测。

摘要

IRF3 转录因子在抵御病原体的第一道防线中至关重要，主要通过诱导干扰素 β 和抗病毒基因的表达发挥作用。对 IRF3 激活的详细分析对于理解病原体如何诱导或逃逸先天性抗病毒反应具有重要意义。根据其磷酸化状态和单体形式的不同，可区分出多种不同的 IRF3 激活形式。 与 二聚体状态 体内 通过SDS-PAGE中IRF3磷酸化形式的迁移率变化，可实现对IRF3不同活化状态的区分。此外，可利用非变性电泳监测IRF3单体与二聚体的水平。本文详细描述了一种获得最高分辨率以全面获取IRF3活化状态信息的实验方法。该方法结合高分辨率SDS-PAGE与非变性PAGE，并联合使用多种全蛋白及磷酸化特异性抗体进行免疫印迹分析。这一实验策略经济且灵敏，可提供磷酸化介导的IRF3活化过程完整分析所需的全部信息。

引言

干扰素调节因子3（IRF3）是一种普遍且组成型表达的转录因子，在抵御病原体的第一道防线中起关键作用，主要通过诱导干扰素β（IFNβ）的表达实现，同时也通过诱导趋化因子（C-C模体）配体5（CCL5）以及多种抗病毒蛋白（包括含四肽重复序列的干扰素诱导蛋白IFIT1/2/3）发挥作用^1-3。已有研究报道，多种病毒感染，或暴露于聚胞苷酸-聚肌苷酸（poly I:C）或脂多糖（LPS）后，均可引发IRF3的活化⁴。重要的是，大多数已被研究的病毒已进化出逃逸IRF3介导免疫应答的机制，从而逃避宿主的天然免疫防御⁵。因此，监测IRF3的活化不仅对于理解宿主天然抗病毒防御的分子机制至关重要，也有助于揭示病毒对抗该免疫应答所采用的策略。

然而，许多已发表的研究仅对IRF3的激活进行了有限的分析，通常通过监测IRF3靶基因的诱导（IFNB1 和 IFIT1）和/或荧光素酶报告基因检测，并结合低分辨率的十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对IRF3进行分析。然而，大量生化研究、对多种IRF3突变体行为的分析以及IRF3晶体结构的解析^6-11已证实，IRF3会经历一系列复杂的、按顺序发生的翻译后磷酸化修饰，涉及多个位点。参与IRF3激活的磷酸化模式似乎依赖于刺激类型，且极有可能也依赖于细胞类型。在未感染的细胞中，IRF3以非磷酸化和低磷酸化形式共存，其中低磷酸....

方案

注意：本实验方案以感染仙台病毒（SeV）的 A549 细胞为例进行描述。然而，截至目前测试的所有人类和小鼠细胞类型（尤其是经多种可激活 IRF3 的刺激物处理的髓系细胞）均适用该 SDS-PAGE 和天然 PAGE 实验方案^{9,15,19,24,25}。

1. A549 细胞的感染

1. 在含有20 ml添加10%热灭活胎牛血清（HI-FBS）和1% L-谷氨酰胺的完全F12K/Ham培养基中，于37 °C、5% CO₂条件下，在15 cm培养皿中培养A549细胞。
   注意：所有用于细胞培养和处理的溶液必须无菌。
2. 感染前24小时，吸除培养基，并在室温下用10 ml蒸馏磷酸盐缓冲液（D-PBS）洗涤细胞。
3. 向每块培养皿中加入1 ml 0.25%胰蛋白酶-EDTA溶液，使其覆盖细胞，于37 °C孵育3分钟。
4. 一旦细胞开始从培养皿脱离，立即停止孵育，方法是用手轻轻敲击培养皿。每皿加入10 ml预热的完全F12K/Ham培养基以终止胰蛋白酶作用，并将细胞转移至15 ml锥形管中。
5. 在室温下以350 × g离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于8 ml完全F12K/Ham培养基中，获得均一的单细胞悬液。
6. 使用血细胞计数板对细胞进行计数。以每60 mm培养皿4 ml预热的完全F12K/Ham培养基接种1 × 10

结果

图2显示了通过高分辨率SDS-PAGE分离WCE后，使用IRF3总抗体以及针对Ser396和Ser398的IRF3磷酸化特异性抗体检测到的典型免疫印迹图像。在未受刺激的A549细胞中，IRF3在SDS-PAGE上表现为50和53 kDa的两条条带，分别对应于非磷酸化的（形式I）和低磷酸化的（形式II）IRF3。A549细胞经SeV处理3–9小时后，出现时间依赖性的迁移减缓的高磷酸化形式III和IV，这些形式与形式I和II有明显区分。高磷酸化条带迁移至55–57 kDa。形式III和IV也可通过针对Ser396和Ser398的磷酸化特异性抗体特异性地检测到。肌动蛋白（actin）的免疫检测用于各泳道上样量一致性的对照。SeV感染的对照通过病毒核衣壳蛋白（N）的累积来显示，该蛋白迁移至60 kDa。

在图3中，展示了通过非变性PAGE分离WCE后，使用抗IRF3-NES抗体和针对Ser38.......

讨论

本文所述方案结合了高分辨率SDS-PAGE与天然PAGE，并联合使用多种磷酸化特异性抗体，以区分IRF3的单体/二聚体形式及其磷酸化修饰形式I-IV。在特定实验条件下，对这些IRF3形式的准确检测对于全面表征IRF3的活化状态至关重要。例如，LPS刺激活化的巨噬细胞可诱导形成二聚化的IRF3，其Ser396/398位点发生磷酸化，在SDS-PAGE中表现为低度磷酸化（形式II），但不表现为高度磷酸化（形式III和IV）的条带模式¹⁵。利用本方案，可将此模式与病毒感染诱导的高度磷酸化形式区分开来，后者除Ser386和Ser396磷酸化外，还需额外的Ser339磷酸化¹⁰。重要的是，该方法还可区分那些虽发生Ser396磷酸化但未形成二聚体、却仍具有转录活性的IRF3形式¹⁰。需要特别指出的是，IRF3磷酸化形式I-IV的分类模式适用于人源IRF3；小鼠IRF3不呈现类似的电泳迁移模式，因此其活化状态的鉴定仅能依赖于SDS-PAGE后免疫印迹中磷酸化特异性抗体的检测以及天然PAGE分析。

通过SDS-PAGE实现IRF3不.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
F12/Ham	Life Technologies	11765-054	使用前在 37 °C 水浴中预热。
胎牛血清	Life Technologies	12483-020
L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-081
D-PBS	Life Technologies	14190-144	用于细胞培养。
0.25% 胰蛋白酶/EDTA	Life Technologies	25200-072
仙台病毒 Cantell 株	Charles River Laboratories	600503
HEPES	Bioshop	HEP001
氯化钠 (NaCl)	Bioshop	SOD001.5
EDTA	Bioshop	EDT001
甘油	Bioshop	GLY001.1	由于黏度很高，需剪去吸头尖端并缓慢移液。
IGEPAL CA-630	Sigma-Aldrich	I7771	注册商标，对应辛基苯氧基聚乙氧基乙醇（Nonidet P-40）去垢剂
亮抑蛋白酶肽	Bioshop	LEU001
抑肽酶	Bioshop	APR600.25
氟化钠	Sigma-Aldrich	201154
正钒酸钠	MP Biomedicals	159664	0.2 M 正钒酸钠活化步骤：1) 使用 1 N NaOH 或 1 N HCl 将 pH 调至 10.0。正钒酸钠溶液的初始 pH 可能因不同批次试剂而异。2) 溶液在 pH 10.0 时呈黄色。3) 煮沸至无色。4) 冷却至室温。5) 重新调节 pH 至 10.0，并重复步骤 3–4，直至溶液保持无色且 pH 稳定在 10.0。将活化后的正钒酸钠分装后于 -20 °C 保存。
对硝基苯基磷酸二钠盐六水合物	Sigma-Aldrich	P1585
β-甘油磷酸	Sigma-Aldrich	G6376
Bio-Rad 蛋白检测试剂	Bio-Rad	500-0006	具有细胞毒性
丙烯酰胺/双丙烯酰胺 (37.5 : 1) 40%	Bioshop	ACR005	具有细胞毒性
Tris 碱	Bioshop	DEO701
盐酸 (HCl)	LabChem	LC15320-4	需在通风橱中操作。有毒且具刺激性。
十二烷基硫酸钠 (SDS)	Bioshop	SDS001.1	具刺激性。
过硫酸铵	Sigma-Aldrich	A3678
TEMED	Invitrogen	15524-010	有毒且具刺激性。
溴酚蓝	Fisher Scientific	B392-5
β-巯基乙醇	Sigma-Aldrich	M6250	需在通风橱中操作。对神经系统和黏膜有毒，可能对上呼吸道、眼睛及中枢神经系统有毒性。
甘氨酸	Bioshop	GLN001.5
脱氧胆酸钠	Sigma-Aldrich	D6750
氢氧化钠 (NaOH)	Bioshop	SHY700	具刺激性。
硝酸纤维素膜 (0.45 mm)	Bio-Rad	162-0115
冰醋酸	Bioshop	ACE222.4	需在通风橱中操作。有毒、具刺激性且易燃。
丽春红	Sigma-Aldrich	P3504
氯化钾 (KCl)	Sigma-Aldrich	P3911	用于免疫印迹实验中 PBS 的配制。
Na2HPO4	Bioshop	SPD307.5	用于免疫印迹实验中 PBS 的配制。
KH2PO4	Sigma-Aldrich	P0662	用于免疫印迹实验中 PBS 的配制。
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A7906	用于免疫印迹实验中 PBS-T-BSA 的配制。
脱脂奶粉	Carnation
聚山梨酯 20 (Tween)	MP Biomedicals	103168	由于黏度很高，需剪去吸头尖端并缓慢移液。
Anti-IRF-3-P-Ser386	IBL-America	18783	分装后于 -20 oC 保存。避免反复冻融。
Anti-IRF-3-P-Ser396	自制19		分装后于 -80 oC 保存。避免反复冻融。
Phospho-IRF-3 (Ser396) (4D4G)	Cell Signaling Technology	4947s	于 -20 oC 保存。
Anti-IRF-3-P-Ser398	自制15		分装后于 -80 oC 保存。避免反复冻融。
Anti-IRF-3-全长	Actif motif	39033	分装后于 -80 oC 保存。避免反复冻融。
Anti-IRF3-NES	IBL-America	18781	分装后于 -20 oC 保存。
Western Lightning 化学发光试剂 Plus	Perkin-Elmer Life Sciences	NEL104001EA
LAS4000mini CCD 相机装置	GE healthcare
SDS-PAGE 广谱分子量标准品	Bio-Rad	161-0317	分装后于 -20 oC 保存。