用于研究清醒行为状态下猕猴大脑皮层信息处理神经药理学的压力注射系统

摘要

在此，我们展示了在清醒且行为自如的猕猴中进行单细胞记录时，对神经药理学物质进行压力注射的方法。该方法可实现对皮层记录位点附近区域的药理学操控。

摘要

自上而下的调控在前馈皮层信息处理中具有重要的功能意义，涉及多种认知过程，包括注意力对感觉信息处理的调节。然而，目前对参与此类调控的神经递质系统的了解仍然有限。解决这一问题的一种实用方法是，在合适的动物模型中，将单细胞记录与局部且暂时性的神经药理学干预相结合。本文展示了一种将急性单细胞记录与在记录电极附近注射神经药理学试剂相结合的技术。视频展示了压力注射/记录系统的制备过程，包括待注射物质的准备。我们展示了一只恒河猴执行视觉注意任务的过程，以及进行单神经元记录并实施分块式药理学干预的操作步骤。

引言

在大脑皮层和皮层下区域，神经元活动受到多种神经调质的影响，例如乙酰胆碱¹这些对神经元反应的调节作用已有报道 体外 研究²，以及从麻醉动物中获得的电生理记录³ 以及在人体中进行的系统性药理学干预⁴然而，不同神经调质的确切作用以及各类受体亚型的参与机制在很大程度上仍不清楚。为了测量特定神经调质对单个神经元活动的影响，理想的方法是在记录电极附近诱导出尽可能局部的、暂时性的神经调质变化。此外，这些操作应在清醒动物中进行，因为认知功能仅在无麻醉状态下存在。同时，麻醉会与胆碱能和GABA能系统发生相互作用。^5,6 并可能导致神经活动的变化³.

近几十年来，局部药物递送已发展并完善了两种主要方法：离子电渗法和压力注射法。这两种方法均通过由玻璃或钢制成的微电极管递送药物。在离子电渗法中，电流控制药物的释放⁷。此外，电渗作用对喷出分子总量也有显著贡献⁸，其程度与微电极管的尖端直径⁹以及所用物质的浓度⁸相关。离子电渗法是一种能够快速、精确操控小体积神经组织的强大工具。进行离子电渗注射时，通常使用多通道微电极管¹⁰，其中一个通道用作记录装置，其余通道则作为给药电极管。该方法的一个局限性在于只能使用带电分子，这极大地限制了可用药物的种类。

压力注射利用空气压缩或机械压力将物质从微电极中推出。该方法可使用任何可溶性物质，无论带电或不带电，包括大分子。压力注射方法最早由 Reyniers 于 1933 年描述，并在 20 世纪 50 年代进一步完善（参见 Lalley¹¹ 的综述）。20 世纪 80 年代，该方法被进一步优化，可在进行单细胞记录的同时，将纳升级体积的物质（主要是利多卡因¹²）递送至特定脑区¹³。通常通过观察标记物的移动来监测推出体积，例如微电极上部弯月面的位置变化¹³。20 世纪 90 年代，压力注射首次应用于清醒动物，包括细胞外¹⁴和细胞内^15,16注射。基于这些研究积累的综合经验，目前可稳定地结合药理学操控，对不同脑结构进行记录（参见¹⁷对近期压力注射系统的比较）。

对于两种药物递送方法而言，一个长期存在的开放性问题是如何确定注射的精确体积。在清醒、自由活动的恒河猴实验中，这一挑战尤为突出，因为动物在独立的房间内执行实验任务。通过使用软件控制的系统来持续监测注射过程，而非依赖视觉标记，可以缓解这一问题。

本文所述系统是在一种成熟的电生理记录系统（Mini Matrix系统）基础上的扩展，该系统将注射移液管与多个平行排列的记录电极以可定制的布局、在确定的距离上组合在一起。通过使用少量物质，即可在记录电极附近的组织中实现药理学操控，确保快速恢复，并可在动物行为任务所限定的时间窗口内，完成多次注射与对照/恢复的循环。

方案

动物饲养和所有实验操作均依照德国动物保护法律进行，并经德国下萨克森州布伦瑞克地区政府批准。

注意：由于该实验在活体（in vivo）中进行，必须保持尽可能高的卫生标准。在条件允许的情况下，应在无菌条件下操作。

1. 准备注射/记录系统

1. 对连接微量移液器与注射器的管路进行灭菌。在注射泵与电生理记录系统之间的实验装置中，应使用尽可能短的管路。
2. 使用清洁丝清理记录系统的导管。将清洁丝浸入无菌硅油中，并反复多次穿入各个导管内。
3. 将石英玻璃微量移液器插入记录系统的一个导管中。参见图1A。
4. 将微量移液器固定在记录系统后，将灭菌管路连接到微量移液器的金属针脚上。操作时需小心；尽管微量移液器已在系统中固定，但在连接管路时仍易断裂。应使用两把无菌镊子，对针脚和管路施加均匀的压力。
5. 使用液体超级胶水密封管路与微量移液器的连接处。在向微量移液器填充液体前，至少等待3小时，确保胶水完全固化。
6. 在插入微量移液器之前或之后，将微电极（例如，石英玻璃绝缘的铂钨电极）插入记录系统的其他位置。

2. 准备物质

1. 使用高压灭菌器或其他可靠的灭菌方法对1.5 ml 微量离心管进行灭菌，以备后续储存注射溶液。
2. 称取相应量的氢溴酸东莨菪碱以配制 5 0.1 摩尔溶液的毫升数。溶于无菌生理盐水（0.9% NaCl）中。
3. 在生物安全柜内的无菌条件下，使用孔径足够大的注射器滤器过滤溶液， 例如，0.2 µm。
4. 在通风橱中，将溶液分装成足以进行单次实验的体积， 例如，东莨菪碱，500 µl置于无菌1.5 ml离心管中。使用避光管以保护物质免受光照； alternatively，用铝箔包裹离心管。东莨菪碱溶液于4 °C保存，最多可保存14天。

3. 注射/记录系统的每日准备

注意：当电极和微移液管安装在记录系统中时，应在两次记录之间将其保存在酶溶液（Tergazyme，用去离子水配制的1%溶液）中。每次记录前必须执行以下步骤。

1. 收集待注射物质的试管。若该物质曾冷藏，请先使其升至室温。
2. 将注射/记录系统从酶溶液中取出，并用去离子水冲洗电极和微电极管，彻底清除残留的酶溶液。
3. 拆下记录系统的前盖，以便目视检查微电极管与试管之间的密封情况。
4. 在导管间隙（见图1A）以及电极和微电极管尖端涂抹无菌硅油，以润滑系统，确保其移动顺畅。
5. 使用显微镜检查电极和微电极管的尖端，确保其完好无损。在显微镜下对齐电极与微电极管，使其从导管中伸出的长度一致。将其推入导管，直至刚好不可见为止。此位置定义为电极零位。在软件中将电极和微电极管的深度设置为0。
6. 用无菌生理盐水填充一支无菌注射器，并将针头插入试管中，注意不要刺破试管壁。将微电极管从导管中推出，以便目视控制液体流动。
7. 至少用2 ml无菌生理盐水冲洗试管和微电极管，确保注射器和试管内无残留气泡。操作注射器推杆时勿施加过大压力。确保试管与微电极管连接处密封良好。若发现泄漏，需重新粘接连接处（见步骤1.5），并推迟记录。
8. 用新的无菌注射器抽取待注射溶液，并替换生理盐水注射器的针筒部分，即保留装有生理盐水的注射器针头插在试管内。确保无空气进入系统。最佳操作方法是在移除生理盐水针筒后，先用生理盐水填充针座部分。
9. 用250 µl待注射溶液冲洗系统，以彻底清除管路中的生理盐水。
10. 使用电机控制软件，将电极和微电极管回撤至导管内，深度至少为-500 µm。
11. 将导管环（图1A）下移至导管底部，以保持其相对位置固定。
12. 用乙醇清洁系统底座，特别是将来会接触猴子记录腔的部分。
13. 重新装上记录系统的前盖并拧紧螺丝，关闭系统。

4. 注射系统的验证

注意：尽管公司已对系统进行校准，但仍建议使用实验设置中所用的材料（如试管、注射器等）验证喷出的体积。

1. 按照步骤3所述准备系统，使电极和微移液管伸出导管外。建议深度至少为7,000 µm，以避免因微移液管和电极外表面粘附而导致测量体积损失。
2. 将记录系统放置于实验过程中将要使用的位置，并将注射器插入微注射泵中。使用橡皮筋和可调节夹具固定注射器（参见 图1A将泵的可移动部分滑动，直至其牢固地卡在注射器柱塞后方。
3. 使用软件控制的电机单元，推出足以精确测量的液体体积， 例如，1,000 nl。建议采用单步操作将全部体积快速排出，以避免毛细作用对微移液管表面造成影响。在验证过程中，过低的流速（1 nl/s）也可能导致此类效应。
4. 将微量移液器下方容器中收集的全部液体体积收集起来，或小心地直接从微量移液器尖端收集排出的液滴。使用移液器或通过精密天平称重来估算排出的液体体积。
5. 重复该步骤多次以确认测量结果。

5. 急性记录

1. 设置记录系统的 X-Y 位置。这定义了引导管到达慢性植入记录室中硬脑膜的位置。确保引导管完全回缩（引导管 Z 位置为 0）。
2. 将记录系统移至指定位置，并将注射器放入微量注射泵中。使用橡皮筋和可调节夹具固定注射器（见图1A）。滑动泵的可移动部分，使其牢固地抵住注射器的推杆。若在引导管尖端可见液滴，请使用无菌棉签小心将其去除。
3. 根据实验室的操作规程准备动物进行记录（例如指南参见¹⁸）。
4. 将记录系统牢固地安装在猴子的记录室上。
5. 手动缓慢降低引导管进入记录室，直至接触硬脑膜，然后使用电机控制软件驱动电极。
6. 由于无法测量微移液管的阻抗，应首先驱动电极，并在不同深度定期检查其阻抗。在成功穿透硬脑膜且未损伤电极后，再推进微移液管。
7. 将电极和微移液管驱动至目标电极深度，即预期可找到感兴趣脑区的深度。缓慢推进电极，直至足够接近以记录单个神经元的活动，表现为记录信号具有良好的信噪比。重要的是，应将记录电极与微移液管置于相同深度，以确保两者之间的距离最短。
   1. 如条件允许，应使电极和微移液管在整个记录过程中保持在此深度。然而，若仅能通过移动电极来维持记录细胞的信号质量，则需同时驱动电极和微移液管，以保持二者之间的相对距离不变。

6. 空间注意任务

1. 在一系列试验中，于屏幕上呈现两个运动的点阵图案，其中一个位于记录神经元的感受野内，另一个位于感受野外，同时呈现一个位于中央的注视点，动物需在整个试验过程中将中央凹对准该注视点^19,20。
   注意：猴子经过训练，需对提示的点阵图案（目标事件）中的运动方向变化作出反应，同时忽略另一个点阵图案的任何方向变化；每次成功完成试验后，猴子会获得一滴液体作为奖励^19,20。作为感觉控制条件，猴子需报告注视点的亮度变化，同时忽略两个运动的点阵图案（任务的详细描述见图2）。

7. 记录过程中的药理学操作

注意：在猴子执行任务的同时，以分块方式注入物质。共定义三个连续的区块：对照组，作为基线；注射组，在此期间喷射物质；恢复组，在此期间被注射物质作用的细胞恢复至基线水平。

1. 在注射阻断过程中，定期注入预定量的物质 例如，每分钟2 nl，速率为2 nl/s。本示例使用盐酸东莨菪碱。注射过程通过软件控制，软件提供多种选项。例如，使用步进功能设定注射体积，并根据记录软件的时钟，每隔一分钟按一次注射按钮。
   注意：注射阻断的确切持续时间取决于物质种类和实验条件， 例如，东莨菪碱以每分钟2 nl的剂量注射10分钟（总量20 nl）。在注射过程中，不建议推进电极和微移液管。
2. 记录注射物质的时间和试验次数，电极和微移液管的插入深度，以及喷射物质的量。
3. 在注射阶段之后进行恢复阶段，在此阶段不注射任何物质。恢复阶段的持续时间取决于具体物质，需通过预实验确定。持续监测并保持所选单个神经元记录质量，直至恢复阶段结束。
4. 根据猴子的记录质量和动机情况，重复这三个区块，直至无法继续为止。

8. 录制后处理步骤

1. 数据记录完成后，将电极和微移液管缩回导管内，然后手动撤回导管。将记录系统从猴子的记录室中取出。将注射器从注射泵上卸下，并将整个系统转移至准备区域进行清洁。
2. 按照实验室的标准操作程序处理动物（包括清洁记录室¹⁸），并将其送回饲养设施。
3. 先用3%过氧化氢冲洗导管外表面，再用去离子水冲洗。将电极和微移液管推出导管，依次用过氧化氢和去离子水冲洗。
4. 将注射器筒更换为装有无菌生理盐水的注射器筒，保持针头连接在导管上。用1–2 mL生理盐水冲洗导管和微移液管。冲洗后取下注射器筒，将其充满空气，再重新插入针头，通过轻轻推动空气从内部干燥导管和微移液管。
5. 将导管、延长电极和微移液管浸入酶溶液中保存，以防止干燥，并确保有机物质的降解。

结果

图2展示了猴子在注射过程中执行的空间注意力任务。猴子被训练为将注意力集中于记录神经元感受野内的刺激（注意内）、感受野外的刺激（注意外）或注视点（注意注视）。这些条件使得能够在不同注意力状态下比较神经元活动。

图3展示了一项使用东莨菪碱（一种毒蕈碱型胆碱能受体拮抗剂）的实验中，一个示例神经元的刺激前-后时间直方图。该图显示了当动物注意位于神经元感受野内的、沿该细胞偏好方向运动的图形时，注射东莨菪碱期间相较于未注射时神经元反应的抑制情况。前两个峰代表神经元对空间线索在其感受野内出现和消失的响应。随后是屏幕上在线索出现500 ms后呈现的运动图形所引发的反应。灰色阴影区域表示用于计算每次试验平均放电率的分析时间段。绿色区域突出显示了注射东莨菪碱对细胞放电率的抑制作用。深绿色区域显示了在分析时间段内的抑制效应。

图4A 显示了东莨菪碱对样本神经元在三种注意条件下的平均放电率的影响。在两种空间注意条件（注意位于记录神经元感受野内或外）以及感觉条件（注意位于注视点）下，该神经元的放电率在注射区块第一次注射后不久即下降，并在恢复区块延迟后回升至注射前水平。

图4B 显示了另一个样本神经元的对照记录，其中使用与东莨菪碱注射相同的方案注入了生理盐水（0.9% NaCl）。在注射期间，与对照阶段相比，该神经元的放电频率未观察到变化。

图1. 记录过程中用于药理学操作的装置设置。（A）显示了微注射泵和配备电极与微移液器的电生理记录系统。图中放大显示了导管间隙，硅油被注入其中以润滑电极和微移液器。（B）展示了一个示例微移液器（上方）和记录电极（下方）。为进行尺寸比较，在其下方放置了一枚欧元硬币（直径：16 mm）。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 用于引导空间注意的任务设计。 训练猴子检测线索提示的点阵图案中运动方向的变化。线索位置要么位于神经元感受野之内（attend-in），如图所示，要么位于其外（attend-out）。作为感觉控制条件，训练猴子检测注视点的亮度变化（attend-fix）。请点击此处查看此图的放大版本。

图3. 拮抗剂东莨菪碱对神经元放电率的影响。 展示了一个示例神经元在“注意内”条件（注意力位于记录神经元感受野内）下，注射组和对照组的刺激周围时间直方图。横轴表示线索出现后的时间（毫秒），纵轴表示放电率（单位：spikes/sec）。灰色区域表示用于计算单次试验平均放电率的分析时段（刺激开始后300–800 ms）。绿色阴影区域显示了两种条件下放电率的抑制情况，深绿色部分突出显示分析时段内的抑制效应。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 东莨菪碱与生理盐水对神经元放电率的影响。（A）拮抗剂东莨菪碱注射。显示了来自图3的示例细胞在实验过程中，针对三种注意条件下的偏好刺激，其多次试验平均的放电率。横轴表示试验开始时间（单位：分钟），纵轴表示神经元的放电率（单位：每秒脉冲数）。符号（ 注意-进入， 注意-注视， 注意-退出）代表每次成功试验中分析时段内的神经元放电率，水平线（实线：注意-进入，虚线：注意-注视，点划线：注意-退出）表示三个不同实验阶段（对照、注射、恢复）的平均放电率。灰色阴影区域表示注射阶段，从第一次注射开始，至最后一次注射后1分钟结束。在注射阶段，每隔1分钟注入2 nL浓度为0.1摩尔的东莨菪碱，注射速率为2 nL/s。（B）生理盐水注射。显示了在对照实验过程中，示例细胞针对三种注意条件下的偏好刺激的放电率。灰色阴影区域表示生理盐水注射阶段。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

本文详细阐述了如何进行可靠且精确的注射以及高质量的单细胞记录，结合使用 "现成的" 压力注射系统。尽管该药物递送方法此前已在行为灵长类动物中使用（详见综述）¹⁷），本文所介绍的系统具有以下优势，概述如下。

如图4A所示，本文所述系统能够在记录位点附近进行或不进行药物注射的情况下，稳定地测量单个神经元的活动。如图4B所示，注射对照物质（生理盐水）并未引起放电率的变化。该对照实验表明，注射操作本身对记录神经元的放电特性无显著影响。

神经元、记录电极与微移液管之间的空间构型在这些实验中至关重要。尽管在记录过程中无法精确测量它们在组织内的相对位置，但我们可考虑并控制可能的变异来源。首先，在体积注射过程中，目标神经元可能因受力而偏离记录电极，从而影响所记录信号的稳定性。因此，谨慎的做法是在注射前后比较神经元的放电频率，以验证信号的稳定性。其次，记录系统的导管装置结构决定了电极与微移液管之间的距离例如，本实验所用的同心三通道系统中为305 µm）。由于该系统可精确控制电极和微移液管在组织中的插入深度，因此可在记录前通过仔细校准两者相对深度（步骤3.5），并在记录过程中保持相同深度，从而将二者间距最小化。

潜在的局限性
除了制造商的内部质量控制外，该系统还需在实验室条件下进行验证，因为不同品牌的试管、注射器等可能被使用，并可能导致排出体积的差异。尽管该系统可用于注射极小体积，如本实验所示，但这些体积低于常规实验室环境中因实际测量限制而可验证的最小体积。然而，可通过使用较大的注射体积来推断软件设定体积与硬件实际排出体积之间的关系。如果使用透明管，还可通过测量可视标记的位移，对注射过程进行额外的目视检查。

将微移液管插入系统比插入电极更具挑战性，因为微移液管的直径略大，且材质更为脆弱。此外，将导管连接到微移液管针头的过程也较为困难，因为该操作极易导致微移液管上部断裂。然而，一旦成功装载，微移液管的使用寿命可达数月，即使每日使用亦如此。

在实际操作中，我们在记录后对系统进行清洗时，尚未遇到注射系统发生堵塞的情况。然而，目前尚无法进行"在线"检测，因此存在物理性堵塞（例如微吸管尖端附着组织）导致物质无法注入的风险。因此，建议对数据进行保守分析，例如仅将实验中对照阶段与注射阶段放电率出现显著变化的细胞纳入后续分析。

尽管微电极和移液管的直径很小，但仍会移位脑组织并可能造成局部组织损伤。通过手动将导管尖端定位在硬脑膜上方，可将此类损伤降至最低。随后电极穿透硬脑膜，其完整性可通过在线测量阻抗来推断。之后插入微移液管。采用此方法时，建议定期清除硬脑膜上方的组织，以进一步降低电极或移液管断裂的风险。

与替代方法的比较
与其它压力注射系统相比，此处使用的系统具有明显优势。其中一个显著优点是微移液管的直径（约100 µm），仅为其他现有探针的一半大小。¹⁷ 因此可最大限度减少神经组织损伤。与以往设计不同，当前系统采用空间上分离的记录电极和微移液管。尽管其他系统可实现电极与移液管之间更小的距离，但本文所述系统允许电极和移液管独立调节深度，从而可在一次记录过程中灵活调整其相对距离。重要的是，由于注射系统是已有成熟记录装置的延伸，因此无需在记录质量上做出任何妥协。虽然本方案仅使用一根微移液管并注射一种物质，但在同一实验流程中可实现多种物质的注射。为实现这一点，可将多根微移液管分别插入独立的导管中，并连接至安装在各自注射泵上的注射器。最后，系统操作简便，实验过程中仅需一个计算机程序即可控制电极和微移液管的推进，以及压力注射的执行。

与离子电渗法相比，压力注射有其相对的优缺点。例如，压力注射需要向组织内注入比离子电渗法更大的体积，从而增加了神经元移位的风险。本实验所采用的注射体积在纳升级（nL）范围内，我们很少观察到记录细胞信号质量出现明显变化。该系统也允许注入更大体积的液体，这可能对行为学操作具有潜在用途，但可能会影响神经元记录的稳定性。压力注射相较于离子电渗法的一个明显优势在于可使用的物质种类更广泛，因为无需依赖带电物质。然而，实验组与对照组物质（如生理盐水）之间的pH值应进行检测和比较（e.g.，生理盐水）。

人们可能会提出疑问，为何要使用历史悠久的压力注射方法，而不是采用光遗传学等较新的技术来调控神经活动。尽管光遗传学在啮齿类动物中已得到良好应用，但在恒河猴中尚未实现可靠的应用。特别是，目前尚无法利用该技术对特定神经递质类型的细胞进行局部操控。从长远来看，我们认为，将药理学操控的优势与光遗传学操控的优势相结合，在揭示认知功能的神经基础方面具有巨大潜力。

本文展示了如何通过压力注射在清醒、行为自如的恒河猴大脑中对局部限定区域进行药理学操控。我们希望这一方法能够激励其他科学家进一步研究神经调节作用对神经元活动动态的贡献。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
(-)-东莨菪碱盐酸盐	Sigma-Aldrich	55-16-3	分子量 339.81 g/mol
0.9% 氯化钠溶液	B. Braun Melsungen AG	3079870	5ml
Terg-a-zyme	Sigma-Aldrich	Z273287	酶类清洗剂
过氧化氢	Roth		使用去离子水配制的3%溶液
乙醇	Chemie-Vertieb Hannover	104642	70%
去离子水
Injekt 40 Duo	B. Braun Melsungen AG	9166432V	注射器和针头
Eppendorf Safe-Lock 避光微量离心管	Eppendorf	0030 120.191	1.5ml
石英玻璃微量移液管	Thomas Recording
记录电极	Thomas Recording		石英/铂钨纤维电极；阻抗值 1–2 MΩ  和 0.3–0.5 MΩ
PharmedBPT-Schlauch	Saint-Gobain Performance Plastics	3702003	规格：0.25 × 2.05 mm（内径：0.9 mm）
Loctite 401	Henkel	233641	瞬干胶
硅油	Thomas Recording	M-1000
Minisart RC15	Sartorius	17761----------R	注射式滤器
多通道微量注射系统	Thomas Recording		多通道微电极操纵器 “System Eckhorn”，配备微电极、微量移液管及高精度多通道微量注射泵
McLab	定制		实验室内部软件，用于控制刺激呈现