一种定量糖组学与蛋白质组学结合的纯化策略

摘要

开发了一种高通量方案，用于血浆中蛋白质组学与糖组学联合纯化及液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）定量分析。N-连接糖基化基序的脱酰胺分析特异性针对去糖基化位点。通过将滤膜辅助的N-糖链分离与糖链肼基标签标记过程中的个体性归一化策略相结合，实现了对N-糖链的准确定量。

摘要

在生物与临床科学领域，人们日益希望整合并关联多种类型的生物分子，以揭示生物学机制、定义通路、改进治疗方案、理解疾病并促进生物标志物的发现。N-连接糖基化是蛋白质上最重要且最稳定的翻译后修饰之一，调控着信号传导、细胞黏附和酶活性等关键细胞功能。在过去十年中，用于纯化和分析N-聚糖的分析技术发展相对缓慢。尽管现有方法准确且有效，但通常需要较高的专业技术水平和资源投入。虽然已开发出一些高通量纯化方案，但其尚未得到广泛应用，且往往依赖于糖肽的富集。Thomas-Oates 等提出的一种有前景的方法——滤膜辅助N-聚糖分离法（FANGS），已在组织样本中进行了定性验证。本文中，我们将FANGS方法改进并应用于血浆样本，并将其与“使用糖链肼标记物进行个体化归一化”策略相结合，以实现通过液相色谱-质谱法进行精确的相对定量分析，并增强电喷雾离子化效率。此外，我们进一步拓展了该方案的功能，实现了对鸡血浆样本的串联、 shotgun 蛋白质组学及糖基化位点分析。我们证明，通过滤膜纯化并以疏水性肼标记物衍生化的N-聚糖，在丰度和类别上与固相萃取（SPE）方法获得的结果相当；而后者被公认为该领域的金标准。重要的是，两种方案之间的变异性在统计学上无显著差异。与糖组学数据同步采集的蛋白质组数据，其检测深度与标准胰蛋白酶消化方法相当。本方案有效减少了肽段脱酰胺反应，从而限制了在糖基化基序处检测到的非特异性脱酰胺现象。这使得可直接进行糖基化位点分析，同时该方案也兼容¹⁸O位点标记。总体而言，我们展示了一种新型的、在线的、高通量、无偏倚、基于滤膜的定量糖组学与蛋白质组学联合分析方案。

引言

在蛋白质组学领域，滤膜辅助样品制备（FASP）因其能够减少起始材料用量、降低样品制备过程中的人为干扰，并最大化样品通量而被广泛应用¹。然而，类似的方法在糖组学领域尚未出现并获得广泛应用。由于糖基化在生物防御中具有关键作用，并且在癌症或疾病中受到调控，因此迫切需要开发高通量、定量的分析流程^2,3。在哺乳动物中，N-糖链由重复的单糖单元（己糖（Hex）、己糖胺（HexNac）、唾液酸（NeuAc）和岩藻糖（Fuc））组成，这些单元修饰在一个核心结构（Hex₃HexNac₂）⁴上，并共价连接至天冬酰胺。尽管考虑异构体时糖结构空间极为庞大（>10¹²），但从组成层面来看其多样性相对有限，分子量通常在1,000–8,000 Da之间⁵。该类糖链的组成均一性以及其强亲水性，为纯化、分离和质谱（MS）分析流程带来了独特的挑战⁶。

传统上，N-聚糖通过肽-N-糖苷酶F（PNGase F）从蛋白质或肽段上消化下来，随后通过凝集素亲和层析⁷进行富集，或通过肼基化微珠捕获⁸，或通过固相萃取（SPE）纯化^9,10。尽管这些方法均非常有效，但它们引入了额外的脱盐步骤，并限制了可同时处理的样品数量。在过去十年中，已提出多种用于糖组学的高通量平台。Kim et al. 报道了一种使用真空驱动的96孔SPE板的半自动化方法¹¹。此外，Mann团队开发了一种亲和滤膜法（N-glyco-FASP），该方法需先用多种凝集素复合物对滤膜进行衍生化¹²。最后，Thomas-Oates团队提出了一种半定量方法——滤膜辅助N-聚糖分离法（FANGS），该方法利用了糖组空间组成范围较窄的特点¹³。该方法依赖于分子量截断滤膜，首先将小分子污染物冲洗至废液，然后对N-聚糖进行消化并洗脱。在此方案中，去糖基化的蛋白质保留在滤膜上，可进一步进行在线FASP处理。

通过电喷雾电离（ESI）质谱法对糖链进行鉴定和定量，需要离线分离以实现异构体的部分分辨，并需进行衍生化处理以检测低丰度的糖链组分。在归一化过程中使用糖链肼标签标记个体样本，可与反相液相色谱（RPLC）兼容^14,15。4-苯乙基苯肼（P2PGN）疏水性标签可改变糖链的亲水性，使其平均离子化效率提高约四倍¹⁶。尽管其他技术如全甲基化¹⁷或胺基反应性标记化学方法¹⁸也具有类似优势，但在肼基反应中，糖链可在温和条件下以1:1的化学计量比进行反应。通过将经天然（NAT）或¹³C₆稳定同位素标签（SIL）衍生化的样品进行串联分析，可实现相对定量。

以下方法改进了用于血浆应用的FANGS技术，并将其与P2GPN疏水标签结合，以实现准确的相对定量。此外，该方法设计用于对单一样品等分试样进行鸟枪法蛋白质组学、脱酰胺分析和定量糖组学分析，且不会影响各分析的完整性。

方案

1. 蛋白质和糖蛋白的变性与烷基化

1. 对于标准样品制备，取 2.5 μl 浓度为 0.1 μg/μl 的糖蛋白（例如 胎球蛋白或核糖核酸酶 B）溶液，加载至分子量截留值（MWCO）为 30 kDa 或 10 kDa 的滤膜上。
   1. 对于生物血浆样品，使用标准 Bradford¹⁹ 或二辛可宁酸²⁰（BCA）蛋白测定法检测蛋白浓度。如有必要，用 pH 约为 7 的 H₂O 中 100 mM 碳酸氢铵（NH₄HCO₃）（PNGase 消化缓冲液）稀释血浆，使总蛋白浓度在 10–100 mg/ml 范围内。取 2.5 μl 血浆（含 25–250 μg 蛋白）加载至滤膜上。
      注意：本方案仅针对使用乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝采集的血样血浆进行过测试。
2. 向滤膜中的每个样品加入 2 μl 的 1 M 二硫苏糖醇溶液（DTT）。
3. 用 200 μl PNGase 消化缓冲液稀释样品。
4. 盖紧滤膜样品管，轻轻涡旋振荡，注意避免滤膜从固定位置脱落。将样品在 56 °C 下孵育 30 分钟，以使蛋白质和糖蛋白变性。
5. 为烷基化样品，加入 50 μl 1 M 碘乙酰胺，使终浓度约为 200 mM，并在 37 °C 下孵育 60 分钟。
   注意：若无需进行蛋白质组学分析，可跳过步骤 1.5。
6. 通过在 14,000 × g 条件下离心 40 分钟，将变性的糖蛋白浓缩至滤膜上。弃去滤过液。

2. N-连接聚糖的酶解消化

1. 用 100 μl PNGase 消化缓冲液洗涤样品。在 14,000 × g 条件下离心 20 分钟，使糖蛋白浓缩于滤膜上，弃去滤过液。
   1. 重复洗涤和浓缩步骤两次，共进行三次，最终将样品浓缩至滤膜的死体积（约 5 μl）。弃去所有滤过液。
   2. 洗涤完成后弃去收集管。后续所有洗脱液和洗涤液均收集至新的收集管中。
      注意：在 PNGase F 消化步骤中，可使用溶于 H₂¹⁸O 的 PNGase 消化缓冲液，以实现对去糖基化后天冬酰胺位点的稳定同位素标记，这些位点在化学上会发生脱酰胺反应。
2. 将滤膜转移至新的收集管后，加入 2 μl 无甘油的 PNGase F（75,000 单位/ml）。再加入 98 μl PNGase 消化缓冲液，使总体积达到 100 μl，并在滤膜上轻轻吹打混匀。在步骤 2.2.1、2.2.2 或 2.2.3 的条件下进行酶解消化。
   注意：可采用三种不同的蛋白质去糖基化方法。若仅用于糖组学分析（不进行蛋白质组学分析），建议采用步骤 2.2.1 的长时间孵育法。若同时进行糖组学和蛋白质组学研究，步骤 2.2.2 和 2.2.3 可产生高质量肽段，并将非特异性脱酰胺降至最低。
   1. 仅用于糖组学的消化方案（18 小时）：将样品在 37 °C 孵育 18 小时，以酶促方式完全切割所有 N-糖链。
   2. 加标消化方案（SPI）：将样品在 50 °C 孵育 2 小时。迅速取出样品，再加入 2 μl 无甘油的 PNGase F（75,000 单位/ml）。轻轻涡旋 1–2 秒以混匀。继续在 50 °C 孵育 2 小时。
   3. 微波消化方案（MD）：将样品置于浮于水中的微量离心管架上。将样品架漂浮于盛有 1 L 去离子水（DI 水）的 1 L 烧杯中。将烧杯置于微波炉（950 W）转盘中央。以 60% 功率（570 W）微波加热 5 分钟。冷却时取出样品，在室温下静置 2 分钟，然后再次以 60% 功率微波加热 5 分钟。
      注意：微波功率设置需根据微波炉的最大输出功率进行调整。不同型号的微波炉应保持平均功率一致。

3. N-糖链的洗脱

1. 在20 °C条件下，以14,000 × g离心20分钟，洗脱糖链。
2. 向滤膜中加入100 μl PNGase消化缓冲液，在20 °C条件下以14,000 × g离心20分钟，将含有任何残留N-连接糖链的洗涤液收集至与洗脱液相同的收集管中。重复此步骤两次。移除滤膜并转移至新的收集管中。
3. 将糖链样品置于-80 °C冰箱中孵育直至完全冻结（30–60分钟），然后在室温下使用真空浓缩仪彻底干燥（4–6小时）。
   注意：N-糖链可在衍生化前于-20 °C保存长达六个月。

4. 蛋白质FASP消化

注意：如果不需要进行蛋白质组学或脱酰胺位点分析，可以跳过本方案的第4节。

1. 用 400 μl 的 8 M 尿素缓冲液冲洗含有脱酰胺肽的滤膜。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀。在 14,000 × g 条件下离心浓缩 15 分钟。弃去全部滤过液。
   1. 重复步骤 4.1 两次，共进行三次尿素缓冲液洗涤。
2. 用 400 μl 的 2 M 尿素、10 mM CaCl₂ 缓冲液（胰蛋白酶消化缓冲液）冲洗含有脱酰胺肽的滤膜。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀。在 14,000 × g 条件下离心浓缩 15 分钟。弃去全部滤过液。
   1. 重复步骤 4.1 两次，共进行三次胰蛋白酶消化缓冲液洗涤。
   2. 洗涤完成后弃去收集管。后续所有洗脱液和洗涤液均收集至新的收集管中。
3. 根据实验类型，加入 50 μl 猪胰蛋白酶（经修饰），其胰蛋白酶与蛋白（w/w）的比例在发现性蛋白质组学实验中为 1:50，在定量蛋白质组学实验中为 1:5。盖紧收集管，轻轻涡旋混匀。
4. 将样品在 37 °C 下孵育 2 小时。操作需迅速，取出样品后按 1:50 或 1:5 的胰蛋白酶:蛋白比例额外加入 50 μl 胰蛋白酶。轻轻涡旋 1–2 秒以混匀。将样品在 50 °C 下继续孵育 2 小时。
5. 在 14,000 × g 条件下离心 15 分钟，洗脱肽段。
6. 用 400 μl 含 1% 甲酸和 0.001% 两性离子去垢剂 Zwittergent 3-16 的淬灭缓冲液冲洗滤膜上残留的肽段。在 14,000 × g 条件下离心 15 分钟，从滤膜上洗脱肽段。
7. 采用 Bradford¹⁹ 或 BCA 法²⁰测定样品中肽段的浓度。
8. 将肽段样品置于 -80 °C 冰箱中冷冻（30–60 分钟），然后在室温下使用真空浓缩仪完全干燥（4–6 小时）。
   注：干燥后的肽段可在 -20 °C 下保存最多三个月。
9. 在进行液相色谱-质谱联用（LC-MS）分析前，将胰蛋白酶消化所得的肽段用 2% 乙腈、98% H₂O 和 0.1% 甲酸（流动相 A）重悬至所需浓度。2.5 μl 血浆来源的肽段浓度通常为 100–300 ng/μl。

5. 衍生化 N带有疏水性肼基标签的连接糖链

1. 将干燥的重链（SIL）或轻链（NAT）P2GPN 试剂溶于 1 ml 的 75:25 甲醇:乙酸（衍生化溶液）中，终浓度为 0.25 mg/ml。试剂完全溶解可能需要长达 10 分钟。需充分涡旋震荡以确保完全溶解。
   注意：若本衍生化方案用于标准 N-聚糖（而非纯化后的聚糖），P2GPN 与聚糖的摩尔比应约为（且不低于）17:1。
2. 用 200 μl（50 μg）的 SIL 或 NAT P2GPN 试剂标记干燥的 N-聚糖。反复吹打以重悬干燥的聚糖。涡旋震荡样品后，在台式离心机上离心约 5 秒。
3. 在 56 °C 下反应 3 小时。
4. 立即从孵育器中取出聚糖样品并转移至真空浓缩仪。在 55 °C 下彻底干燥（3–5 小时）。
   注意：此步骤可终止衍生化反应；样品必须完全干燥，以防止后续步骤中发生交叉反应。
   注意：标记后干燥的样品可在 -20 °C 下保存最多六个月。
5. 在进行 LC-MS 分析前，将标记后的 N-聚糖重悬于 25–50 μl 的 H₂O 中。反复吹打以确保 N-聚糖完全溶解。
   注意：重悬体积取决于起始糖蛋白浓度，可根据起始蛋白浓度进行估算。然而，不同样品类型的适宜体积可能有所差异，应根据具体情况单独优化。
6. 以 14,000 × g 离心 5 分钟。小心移除上清液，注意移液枪头勿接触离心管底部。
   注意：过量的标记试剂可能肉眼不可见，但可通过离心去除。
7. 如需进行相对定量，可将一对 NAT 与 SIL 样品按 1:1 比例混合，用于串联分析。

6. 超高压液相色谱与质谱分析

注意：Easy nLC-1000 和 Q Exactive High Field 的液相色谱（LC）和质谱（MS）条件分别为蛋白质组学分析和糖链分析在本实验室进行了优化²¹。这些条件可适配于其他超高压或纳米级液相色谱系统以及其他高分辨能力的质谱仪，但可能需要进行轻微调整。进行糖链鉴定和脱酰胺分析必须使用高分辨能力的质谱技术^22,23。

注意：如果使用了合适的反相色谱或亲水相互作用商品化捕获柱和色谱柱，则可以跳过步骤 6.1-6.3。

1. 根据 Meiring 等²⁴ 的方法，在 100 μM 内径毛细管中合成筛板，用作捕获柱。
2. 在压力作用下，使用 2.6 μM、100 Å、C₁₈ 填料填充捕获柱，并截取 5 cm 长度。
3. 在压力作用下，使用 2.6 μM、100 Å、C₁₈ 填料填充 75 μM 内径的喷雾柱，并截取 30 cm 长度。
4. 为蛋白质组学（6.4.1）和糖组学（6.4.2）工作流程分别准备两种不同的液相色谱-质谱（LC-MS）方法。
   注意：蛋白质和糖类样品可在同一捕获柱/分析柱系统上以任意顺序进行分析。
   1. 进行蛋白质分析时，将约 400 ng 蛋白质溶于流动相 A（MPA）并上样至色谱柱。按照 表 1 所示条件，以 300 nl/min 流速运行，进行 1 μl 的前置柱平衡（500 bar）和 5 μl 的分析柱平衡（500 bar）。在 表 2 提供的质谱条件下对蛋白质进行电离。
   2. 进行糖类分析时，将 5 μl 重悬的、经 P2GPN 标记的 NAT/SIL 等摩尔样品上样至色谱柱。按照 表 3 所示条件，以 300 nl/min 流速运行，进行 2 μl 的前置柱平衡（500 bar）和 5 μl 的分析柱平衡（500 bar）。在 表 4 提供的质谱条件下对糖类进行电离。

时间	%MPA	%MPB
0	100	0
5	98	2
105	80	20
135	68	32
136	5	95
151	5	95
152	100	0
167	100	0

表1. 蛋白质组学分析的液相色谱条件。 采用流动相B（MPB，98%乙腈，2% H₂O，0.1%甲酸）进行梯度洗脱，用于洗脱肽段，以进行鸟枪法蛋白质组学、数据依赖采集模式的质谱实验。

MS1 参数
质荷比范围 (Th)	375-1500
分辨率	120,000
AGC	1 × 106
最大离子化时间	30
S-透镜射频水平	55
毛细管温度 (°C)	300
喷雾电压	1.75
MS2 参数
采集模式	Top20
分辨率	15,000
AGC	1 × 105
最大离子化时间	30
填充比例下限	2%
隔离窗口 (Th)	1.4
电荷态排除	+1
归一化碰撞能量	27
排除时间 (s)	20

表2：蛋白质组学分析的质谱条件。 提供了在轨道阱仪器中使用高能碰撞解离（HCD）模式进行电喷雾电离、一级质谱（MS¹）采集和二级质谱（MS²）采集的参数。

时间	%MPA	%MPB
0	95	5
1	70	30
41	60	40
46	37	63
47	10	90
55	10	90
56	95	5
66	95	5

表3：糖链分析的液相色谱条件。 采用梯度洗脱分离经酰肼标记的N-糖链，用于质谱分析。

MS1 参数
质荷比范围 (Th)	600-1900
分辨率	60,000
AGC	5 × 105
最大离子化时间	64
S-透镜 RF 水平	65
毛细管温度 (°C)	325
喷雾电压	1.75
MS2 参数
采集模式	Top12
分辨率	15,000
AGC	5 × 104
最大离子化时间	100
填充比例下限	1%
隔离窗口 (Th)	1.4
固定第一质量	125
分步归一化碰撞能量	10/20/30
排除时间 (秒)	15

表4：酰肼基标记的 N-聚糖分析的质谱条件。 提供了在轨道阱质谱仪中采用高能碰撞解离（HCD）模式进行电喷雾离子化、MS¹ 扫描和 MS² 扫描的参数。

7. 蛋白质组学与脱酰胺分析

1. 使用标准生物信息学搜索工具鉴定蛋白质/多肽。
   注意：以下分析方案使用 UniprotKB 中的 Swiss-Prot/TrEMBL 数据库，并通过 Proteome Discoverer 1.4 软件中的 SEQUEST 进行搜索，但该方案可直接适用于任何具有图形用户界面（GUI）的蛋白质搜索与评分引擎。以下所有命令均可通过软件界面中的下拉菜单访问。
   1. 根据 Apweiler et al.²⁵ 的描述，从基因组数据或现有的蛋白质组数据库创建或下载适用于目标生物体的蛋白质序列数据库。
      注意：常见的蛋白质组数据库包括 Swiss-Prot、TrEMBL 和 NCBI，也可基于实验室内部数据构建。
   2. 在软件中选择一种数据库搜索引擎，并根据所获得数据的质量和期望的搜索严格程度设置参数，具体可参考 Perkins et al. 对 MASCOT²⁶ 或 Eng et al. 对 SEQUEST²⁷ 的描述。
      1. 对于高质谱精度数据，在软件中设置如下搜索参数：最多允许 2 次漏切、前体离子质量容差为 5 ppm、碎片离子质量容差为 0.02 Da（以优化脱酰胺化检测的准确性²²），并包含以下胰蛋白酶肽段修饰：“carbamidomethyl (C)”作为固定修饰，“deamidation (N/Q)”和“oxidation (M)”作为动态修饰。若使用¹⁸O 消化标记，需额外添加“deamidation ¹⁸O(1)”作为动态修饰。
      2. 使用选定的搜索引擎，将原始肽段数据与蛋白质数据库（7.1.1）进行比对。
         注意：质量容差应与所用仪器的性能相匹配，不应任意设为过低值。
         注意：软件会自动调用特定搜索引擎的算法完成搜索过程。Percolator 算法（MASCOT）、SEQUEST 或其他算法组合被用于从肽段识别蛋白质并对匹配结果进行打分；更多可用工具的信息可参见 Gonzalez-Galarza et al.^28,29 的综述。根据所用软件的不同，用户可能需要自行选择其他搜索参数。
   3. 导出已鉴定的肽段，用于人工审校和进一步分析。
2. 人工审校含有天冬酰胺脱酰胺化修饰的肽段列表，这些天冬酰胺位于 N-连接糖基化基序（N-X-(S/T)，其中 X ≠ P）中。将这些位点与文献报道的已知糖基化基序进行交叉验证，并将结果分为两组（已验证和理论预测）。
3. 采用谱图计数法³⁰，通过比较脱酰胺化与非脱酰胺化形式的丰度，计算特定糖基化位点的占据百分比。

8. 糖链相对定量

注意：以下鉴定和定量分析使用 XCalibur 软件完成。然而，任何能够分析原始数据并自动积分色谱峰的软件均可替代使用。

1. 根据己糖、脱氧己糖、己糖胺、唾液酸及其他单糖在生物学上可能的组合，生成一个理论上的聚糖组成列表。为此，Walker et al.¹⁵ 已发表人类聚糖数据库，可直接使用。对于理论数据库，必须对组合空间施加物种特异性的生物学限制，相关规则由 Kronewitter et al.³¹ 描述。
2. 根据每种组成的原子质量，计算其聚糖的单一同位素质量（M），适用于质子化电荷态 +1 至 +3。将单一同位素质量进行修正，加入 NAT（254.14191 g/mol）或 SIL（260.162042 g/mol）P2GPN 标记的质量。
3. 在 XCalibur 的路线图视图中打开“Processing Setup”程序。按照 Walker et al.¹⁵ 补充材料中所述，使用第 8.2 步生成的理论单一同位素质量列表，精确设置处理方法，该列表包含 [M+H]¹⁺、[M+2H]²⁺ 和 [M+3H]³⁺ 物种的质量。
   注意：为了在精确质量之外进一步确认聚糖身份，对于 NAT/SIL 双重标记运行，需检查 NAT 与 SIL N-聚糖对是否共洗脱且保留时间相同。定性上，应通过 MS² 谱图交叉验证鉴定结果，谱图中必须包含属于氧鎓离子系列³² 的峰。
4. 将积分后的提取离子色谱图（XIC）面积导出至 Excel，按照 Walker et al.¹⁵ 补充材料中的方法，准确获取 SIL 和 NAT 的丰度。
5. 在 Excel 中，在新列的单元格中编程，根据 Walker et al.¹⁵ 发表的公式，通过调整 SIL 丰度来校正分子量重叠：
   ,
   其中 A 为单一同位素峰，理论同位素重叠 可针对每种组成独立计算。
6. 在第二列中，对单元格进行编程，使用 Walker et al.¹⁵ 描述的总归一化聚糖因子（TGNF）公式，对每个谱图的 NAT 和 SIL 通道进行归一化：
   ,
   其中 N 为高于定量限的 N-聚糖数量。
7. 在新列中，对单元格进行编程，计算 SIL 与 NAT 聚糖的比值（或反之），以得出两个样品间浓度的倍数变化。

结果

图 1：FANGS-P2GPN 疏水标记偶联方法（方法 A）用于蛋白质组学与糖组学联合分析的示意图。 图中突出显示了仅进行糖组学分析与串联糖组学和蛋白质组学分析（含糖基化位点鉴定）之间不同的步骤。请点击此处查看该图的放大版本。

通过使用混合的鸡蛋血浆样本，验证了基于过滤的P2GPN疏水标记方法（方法A）在蛋白质组学和糖组学联用中的鉴定、定量及分子量偏差表现（图1）。对于仅进行糖组学实验的情况，比较了方法A与碳柱固相萃取法（金标准，方法B）所提取的N-糖链的丰度差异（图2）。两种方法在糖链丰度上无显著差异。通过量化同一种方法提取的糖链的SIL:NAT比值，进一步评估了方法内变异性。两种方法的log₂分布均呈以零为中心的正态分布，且无显著差异（图3A-B）。两种方案的分子量范围完全重叠，表明该过滤装置并未基于分子量范围或亲水性对N-糖链产生选择性偏倚（图4）。

图 2： 采用方法A或方法B从2.5 μl鸡血浆中提取的NAT与SIL N-聚糖等摩尔混合物（N = 4）。 样品按照第6节推荐的参数进行UPLC-MS分析。每个聚糖在NAT/SIL各通道中的丰度通过积分提取离子色谱图下的面积（MMA = 3 ppm）、校正分子量重叠效应，并根据TGNF进行调整后计算得出。这些比值及其标准误差如图所示。方法B与方法A的N-聚糖丰度之间无显著差异（p >0.05）。请点击此处查看该图的放大版本。

图 3：比较了（A）方法 A（N = 133）与（B）方法 B（N = 123）策略的组内变异性。对来自相同提取方案的 N-糖链 NAT 和 SIL 等摩尔混合物，进行了三次技术重复分析。log₂ 分布以零为中心，且两种工作流程之间的分布无显著差异。请点击此处查看该图的放大版本。

图4：比较了每种策略所获得糖链的分子量范围。两种实验流程得到的糖链覆盖相同的分子量范围。N-糖链在一种方案中的检测结果与另一种方案相比，仅略高于检测限（丰度为1 × 10⁵），并不反映系统性偏差。请点击此处查看该图的放大版本。

通过分子量滤膜保留去糖基化的蛋白质，可实现在线全蛋白质组分析及糖基化位点鉴定。将多种联合纯化糖链和蛋白质的方案与传统的未去糖基化FASP制备方法进行了比较（表5）。我们常规采用的18小时滤膜法PNGase F消化，随后进行FASP胰蛋白酶消化（标准方案），会导致较高水平的非特异性脱酰胺反应，可能干扰糖基化位点的鉴定。因此，探索了两种替代方法：一种是采用较高温度（50 °C）下缩短孵育时间并加入PNGase F脉冲式添加步骤（SPI方案），另一种是微波辅助消化方案（MD方案），以尽量减少非特异性脱酰胺反应。新消化方法中观察到的糖链在组成和丰度上与标准的18小时、37 °C滤膜法PNGase F消化相比无显著差异（图5）。结合短暂的胰蛋白酶孵育，非特异性脱酰胺显著降低，糖基化位点的假阳性率<5%（表5）。

		蛋白质					肽段					脱酰胺肽段					糖基化位点					糖蛋白
		+		-			+		-			+		-			+		-			+		-
FASP				249					3083					795					5					5
18小时		217		304			6013		5086			1029		733			257		24			112		18
MD		270		266			5190		5125			465		455			254		8			102		7
SPI		281		288			4729		4482			602		573			232		10			145		8

表5： 对标准胰蛋白酶消化与在线FANGS-P2GPN标记方法获得的蛋白质组学数据进行了比较。 实验分别在有（+）和无（-）PNGase F的条件下进行，以确定非特异性脱酰胺的背景水平，并评估糖基化位点假阳性率。蛋白质鉴定的假发现率（FDR）设定为1%；肽段筛选基于Proteome Discoverer 1.4软件中的“高”肽段置信度（q <0.01）；糖基化位点的鉴定依据为包含保守糖基化基序（N-X-S/T）中天冬酰胺脱酰胺的独特序列；糖蛋白则定义为至少含有一个已鉴定糖基化位点的已鉴定蛋白质。

图 5：开发了缩短的糖链处理方案，以尽量减少样品中的脱氨反应，并与18小时FANGS PNGase F消化法进行比较。MD（2.2.3）和SPI（2.2.2）方案在丰度上的平均差异分别为10%和5%。在鉴定出的48种糖链中，90%的糖链变化幅度小于1.5倍。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

高通量定量方法的开发对于实现常规糖链分析至关重要。尽管糖组学在疾病研究、临床应用和药物开发中具有重要意义，但在过去三十年中，其分析技术仍局限于少数研究团队。FANGS-P2GPN 糖组学与蛋白质组学纯化及标记方法可在同一样本分装中完成相同的分析，从而降低试剂成本并减少所需样品量（在人类和小鼠研究中尤为重要）。此外，尽可能减少样品制备过程中的变异性极为关键，因为每增加一个操作步骤都会引入误差，可能掩盖病例-对照研究中重要但丰度较低的变化。将 FANGS 与疏水性肼类标记技术结合，可使蛋白质和糖链样本在同一反相液相色谱（RPLC）柱上进行分析，增强糖链的离子化效率，实现相对定量，并可对血浆样本进行定量分析。

对于 N-糖链分析，使用建议量的PNGase F以实现完全去糖基化至关重要。尽管糖链位于蛋白质溶剂可及区域，但蛋白质变性处理及过量酶的使用有助于确保切割反应高效且彻底。为了准确量化糖链，必须在衍生化后将其完全干燥，以终止反应并防止NAT与SIL物种混合时发生交叉反应。最后，当将实验流程扩展至糖基化位点分析时，各步骤的时间控制至关重要，以最大限度减少非特异性脱酰胺反应。所提供的用于糖组学与蛋白质组学联合分析的改进方案，若按要求操作，可稳定获得可靠结果。

该工作流程与金标准固相萃取（SPE）方法相比，可实现对血浆中 N-糖链的准确相对定量。在分子量、亲水性及组成结构方面，所提取的糖链类型无明显偏差。尽管我们尚未探索 O-连接糖链的定性分析，但我们预计在 N-连接糖链经PNGase F消化后，FANGS方法可兼容加入β-消除步骤。然而，该过程在质谱分析前需对试剂进行彻底清除，操作步骤将需大幅调整，且肽段分析会受到显著影响。在蛋白质组学方面，该方法可达到与传统FASP方法相当的蛋白质组覆盖深度。重要的是，该方法实现了 N-糖链脱酰胺的极低假发现率。虽然该方法在PNGase消化步骤中兼容天冬酰胺（Asn）的¹⁸O标记^22,23，但较低的糖基化位点假发现率表明该标记可能并非必需，从而进一步降低了成本与操作复杂性。

该方法未对蛋白质组中的糖蛋白进行富集，这既有优点也有缺点。某些低丰度的糖蛋白可能在分析中无法被检测到。然而，可以在不同生物样本之间比较每个蛋白质上糖基化位点的占据情况。此外，消除了由凝集素亲和纯化或化学富集所引入的误差和偏差。总之，将FANGS与使用糖链肼标签标记时的个体化归一化策略相结合，形成了一种简化的、可定量的、高通量的糖组和蛋白质组串联分析方法，在临床病例-对照研究中具有广阔的应用前景。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
乙酸（50%）	Sigma Aldrich	45754
乙腈，HPLC级	Burdick & Jackson	AH015-4
碳酸氢铵	Sigma Aldrich	A6141
Bradford试剂	Sigma Aldrich	B6916	替代方案：双辛可宁酸试剂盒（Sigma Aldrich BCA1）
氯化钙	Sigma Aldrich	C1016
离心机	Eppendorf	5804 R	其他可达到14,000 × g的离心机亦适用
DL-二硫苏糖醇，1 M 溶液	Sigma Aldrich	646563
Easy-nLC 1000	Thermo Scientific	LC120	其他纳米级或超高压液相色谱系统可获得类似数据，例如：1. Dionex UltiMateÒ 3000 LC（Thermo Scientific）；2. Acquity UPLC（Waters）
浮力试管架	TedPella	20831-20
胎球蛋白（Fetuin）	New England Biolabs	P6042S
Fisher Scientific Isotemp标准实验室烘箱	Fisher Scientific	11-690-625F	其他可达到56 °C的培养箱亦适用
甲酸	Sigma Aldrich	56302
GE微波炉	General Electric	57B5 E82904	任何具备可调功率设置的微波炉均可使用
INLIGHT糖链标记试剂盒	Cambridge Isotope Laboratories	GTK-1000	INLIGHT试剂盒提供P2GPN试剂的NAT和SIL两种版本
碘乙酰胺	Sigma Aldrich	A3221
Kinetix 2.6 mM，100 Å，C18 填料固定相	Phenomenex	Bulk Media	替代方案：任何C18 固定相，5 mM
Mascot Daemon软件与服务器	Matrix Science		替代方案：Proteome Discoverer软件（Thermo Scientific）
甲醇，HPLC级	Burdick & Jackson	AH230-4
PicoFrit自装填色谱柱：360 μm外径，75 μm内径，15 μm喷嘴，无涂层，每盒5根，50 cm	New Objective	1 5 PF360-75-15-N-5
PNGase F（无甘油），75,000 单位/mL	New England BioLabs	P0705L
Q Exactive HF杂交四极杆-Orbitrap质谱仪	Thermo Scientific		其他高质谱精度（5 ppm）质谱仪亦可提供类似数据
RNase B	New England Biolabs	P7817S
猪胰蛋白酶	Sigma Aldrich	T6567-5X
尿素	Sigma Aldrich	51456
真空浓缩仪Savant SPD131DDA SpeedVac浓缩仪	Thermo Scientific	SPD131DDA	其他真空浓缩仪亦适用
Vivacon 500 30 kDa滤膜	Sartorius Stedim Biotech	VN01H22	替代方案：Amicon Ultra 0.5离心滤膜装置，Ultracel-10 kDa膜（Millipore UFC501096）
水，HPLC级	Burdick & Jackson	AH365-4
水，18O	Cambridge Isotope Laboratories	OLM-240-97-1	在PNGase F消化步骤中添加18O为可选操作，对于置信度达95%的去酰胺化研究可能并非必需
Xcalibur 2.0	Thermo Scientific	XCALIBUR20
Zwittergent测试试剂盒	Merck Millipore	693030