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方法文章

牙龈免疫细胞网络的分离、表征与功能检测

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DOI：

10.3791/53736

⸱

2016年2月16日

 ,  ,  , 
1Oral Immunity and Inflammation Unit, NIDCR, NIH, 2Manchester Immunology Group, Faculty of Life Sciences, University of Manchester, 3Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research, University of Manchester

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们建立了一种从小鼠牙龈中分离、表型鉴定及功能分析免疫细胞的技术。

摘要

组织中的免疫细胞网络在介导局部免疫和维持组织稳态中发挥关键作用，然而目前对口腔黏膜和牙龈中定居的免疫细胞群体仍知之甚少。我们建立了一种从小鼠牙龈组织中分离和研究免疫细胞的技术，该部位持续暴露于微生物环境，且易受常见炎症性疾病——牙周炎的影响。本方案可对牙龈定居免疫细胞群体进行详细的表型特征分析，即使在稳态条件下亦可实现。此外，该方法能够获得数量充足、活力高的细胞，可用于功能研究，例如细胞因子分泌的评估。 离体 这种对牙龈免疫细胞网络的表型与功能特征的综合分析，将有助于探究口腔免疫及牙周稳态相关的机制，同时也将深化我们对局部免疫病理机制的理解。

引言

牙龈组织包绕着人类和小鼠的牙齿，并持续暴露于复杂的牙菌斑生物膜中1。监视牙龈屏障的免疫细胞网络对于维持组织完整性至关重要，它既能确保与局部共生微生物的稳态平衡，同时又能有效抵御病原体的侵袭2。为了实现稳态，免疫系统会精细地适应牙龈微环境，形成高度特化的免疫细胞网络；然而，目前对牙龈免疫细胞群体的具体组成及其在维持组织免疫中的作用仍知之甚少2。

当牙龈部位的免疫稳态因宿主易感性增加和/或失调的微生物群落存在而遭到破坏时，便会引发一种炎症性疾病——牙周炎34。牙周炎是一种常见的炎症性疾病，可导致牙齿支持结构的丧失，在严重情况下约影响总体人群的10%5。然而，解析牙周炎易感性和进展过程中的关键因素已被证明十分困难6。动物模型在阐明牙周炎发生与进展机制方面发挥了极为重要的作用7。这些模型可用于界定对维持免疫稳态至关重要的关键细胞群体和分子介质，并揭示驱动牙周炎发展的机制。此类研究将彻底改变我们对牙龈局部免疫稳态调控机制的理解，并深化当前对疾病发病机制的认识。

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方案

本方案中描述的所有实验程序均遵循必要的指导原则，并已获得美国国立牙科与颅面研究所/美国国立卫生研究院机构动物照护与使用委员会的批准。

1. 提前准备

  1. 配制完全培养基：RPMI 培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）。
  2. 配制 DNase 培养基：50 mL RPMI 培养基中加入 7.5 µg DNase（现配现用，全程置于冰上）。
  3. 配制胶原酶-DNase 培养基：在 5 mL DNase 培养基中加入 3.2 mg/mL IV 型胶原酶（Collagenase Type IV）（现配现用，全程置于冰上）。
  4. 预冷 FACS 缓冲液：将 0.5% FBS 溶于 PBS 中。
  5. 将离心机预冷至 4 °C。
  6. 将摇床培养箱预热至 37 °C。

2. 牙龈组织块的分离、解剖及细胞分离

  1. 根据ARAC指南，将小鼠置于适当的密闭容器中，通过暴露于CO2进行安乐死。
  2. 打开胸腔和腹腔以暴露心脏和内脏器官。进行灌注时，在下腔静脉处做一切口，并使用带有27 G针头的3 ml注射器经左心室灌注3 ml PBS。
  3. 将小鼠身体和头部固定在垫子上，腹部朝上。
  4. 用剪刀从口角向颈部方向剪开每一侧口唇联合处，分离覆盖下颌和颈部区域的皮肤，暴露皮下组织和肌肉。解剖下唇以暴露下颌骨。
  5. 在下门齿之间剪开，分离下颌骨两侧，并将每侧固定，以便进入口腔。
  6. 观察并解剖腭部，使其与鼻腔分离。
  7. 使用10号刀片进行解剖，取上颌和下颌磨牙区域及其周围牙龈组织（图1）。在第一磨牙前方和第三磨牙后方做垂直切口，并在牙龈边缘（牙齿周围白色组织环）做水平切口。
  8. 将上颌和下颌骨组织块放入含有5 ml胶原酶/脱氧核糖核酸酶（Collagenase/DNase）的50 ml锥形管中（置于冰上保存）。
  9. 在37 °C摇床培养箱中孵育1小时，在孵育最后5分钟时加入50 µl 0.5 M EDTA。
  10. 向含有组织的50 ml管中加入5 ml冷的DNase培养基，轻轻旋转混匀。
  11. 将4块组织转移至培养皿中，加入500 µl DNase培养基覆盖。使用手术刀片，刀刃朝向牙龈和牙间区域，去除每块组织上的牙龈组织。
  12. 将培养皿中的组织和培养基，以及解剖过程中使用的先前DNase培养基，通过70 µm细胞筛网过滤至新的50 ml离心管中。用DNase培养基（3–5 ml）冲洗所有使用过的器械并过滤。
  13. 使用无菌3 ml注射器的推杆，在筛网上研磨组织，同时用冷的DNase培养基（30至35 ml）过滤。
  14. 用冷的DNase培养基冲洗细胞筛网。
  15. 在4 °C下以314 × g离心6分钟。
  16. 弃去上清液，用1 ml完全培养基重悬细胞沉淀。
  17. 使用自动细胞计数仪计数细胞（预期细胞数量应在8 × 105至1.2 × 106之间，细胞活力>80%）。

3. 牙龈细胞的刺激与FACS染色

  1. 在含有1 µl/ml布雷菲德菌素A（Brefeldin A）的条件下，用PMA（50 ng/ml）和离子霉素（Ionomycin，2.5 µg/ml）刺激单细胞悬液。
  2. 于37 °C、5% CO2条件下孵育3.5小时。
  3. 离心后用PBS洗涤，并在4 °C下以314 × g离心6分钟。
  4. 根据制造商说明书，使用活率染料对细胞进行染色。
  5. 根据制造商说明书，对细胞表面标记物（CD45、TCRγδ、TCRβ、CD4、CD8、TCRγδ或自选抗体）进行染色。
  6. 用冷FACS缓冲液洗涤细胞，并在4 °C下以314 × g离心5分钟。
  7. 轻轻涡旋震荡以重悬细胞沉淀。
  8. 用2%多聚甲醛在室温下固定细胞20分钟。
  9. 用冷FACS缓冲液洗涤细胞，在4 °C下以314 × g离心5分钟，然后对细胞内细胞因子进行染色。
    1. 用冷的含0.5%皂苷（saponin）的FACS缓冲液填充FACS管，并在4 °C下以314 × g离心5分钟。
    2. 向FACS管中加入300 µl 0.5%皂苷溶液，在4 °C避光孵育15分钟，然后在4 °C下以314 × g离心5分钟。
    3. 根据制造商说明书，对细胞内标记物（IL-17A和IFNγ或自选细胞因子）进行染色。用0.5%皂苷溶液洗涤细胞，并在4 °C下以314 × g离心5分钟。
    4. 再次用FACS缓冲液洗涤，并在4 °C下以314 × g离心5分钟。
    5. 将细胞重悬于300 µl FACS缓冲液中。
  10. 在流式细胞仪上分析结果。

4. 流式细胞术分析

  1. 在前向散射（FSC）和侧向散射（SCC）图上观察待分析细胞，并设门以排除碎片。
  2. 利用前向散射面积（FSC-A）与高度（FSC-H）参数选择单个细胞。
  3. 设门筛选活细胞（由活力染色指示）以及表达造血细胞标志物 CD45+ 的细胞进行后续分析（图 2A 和 图 2C）。
  4. 继续对特定标志物进行分析，如 图 2 和 图 3 所示。

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结果

为说明本方案的应用，我们展示了在患有和不患有牙周炎的小鼠牙龈中（WT 与 LFA-/-，图 2A–C）免疫细胞网络的代表性结果。代表性流式细胞术图显示了牙龈中活的 CD45+ 造血细胞（图 2A、2C）。使用本方案分离和处理免疫细胞可获得足够数量的细胞，用于进行离体（ex vivo）刺激并分析细胞因子分泌模式。此处展示了稳态下（WT）以及因 LFA 缺陷而出现牙周炎的小鼠中总 CD45+ 细胞内 IL-17 和 IFN-γ 的染色情况（图 2B–D）。这些数据揭示了该技术在捕获组织稳态（WT）及局部牙周炎（LFA-/-）背景下细胞因子谱方面的潜力。在易感牙周炎的小鼠中，我们进一步表征了牙龈免疫细胞组成，特别是 T 细胞和固有淋巴细胞（ILC）亚群的组成情况（

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讨论

本技术能够从单只小鼠成功获得大量免疫细胞，不仅适用于表型鉴定，也适用于离体功能研究。ex vivo。此前已有研究团队发表了一种分离和表征小鼠牙龈免疫细胞的方案，并提出了在动物模型中研究牙周炎时应用多色流式细胞术的价值 9。经过大量问题排查，本方案的关键改进在于对整块组织进行解剖，以同时包含牙龈领圈区域和牙间牙龈（图1）。若仅进行牙龈解剖，往往无法获得全层瓣，尤其在牙间区域容易遗漏部分牙龈组织。采用本方法后，所收获的免疫细胞数量显著增加。该技术还可实现对上颌和下颌牙龈组织的最佳分离。

该方案的关键步骤包括对牙龈区域进行保守性分离以及保持高效的分离速度。具体而言，应分离包含牙齿周围最小量组织（牙龈）的组织块，避免包含颊侧组织。组织块应快速分离，且组织和细胞需始终保持在冰上，以确保细胞活性最佳。

在 troubleshooting 时需要注意，细胞产量低可能与胶原酶孵育时间不足、胶原酶浓度不当和/或从组织块中分离牙龈组织不充分有关。在此方面，使用放大镜（2X-...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

作者的部分经费来自NIDCR的院内研究项目（N.M.M），并获得了威康信托基金会阶梯奖学金（Wellcome Trust Stepping Stones Fellowship，项目编号097820/Z/11/B，授予J.E.K）以及曼彻斯特炎症研究协作中心资助（授予J.E.K）的支持。作者感谢Teresa Wild对稿件的审阅。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
精细剪刀精细科学工具14058-11
3号手术刀柄精细科学工具10003-12
10号手术刀片精细科学工具10010-00无菌
碎屑镊Integra Miltex6-304
带普通斜面针头 BD Medical30510927 G，12.7 mm 长度
Monoject 注射器Covidien8881513934鲁尔锁扣式尖端，3 ml
PBS，pH 7.4Life Technologies10010-049不含钙和镁
RPMI 1640Lonza12-167F不含L-谷氨酰胺
牛胰DNase ISigma-AldrichDN25-1G
IV型胶原酶Gibco (by Life technologies)17104-019
胎牛血清Gemini Bio-products100-106
庆大霉素 50 mg/mlQuality biological120-098-661EA
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）Gibco (by Life technologies)15140-122
L-谷氨酰胺Gibco (by Life technologies)25030-081
0.5 M EDTA，pH 8.0Quality biological351-027-721EA
50 ml 离心管Corning352070聚丙烯材质，无菌
70 μM 细胞筛Corning352350
培养皿Corning351029无菌
5 ml FACS 管Corning352052无菌
BD GolgiPlugBD Biosciences555029含布雷菲德菌素A溶液
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）Sigma-AldrichP8139
钙离子霉素钙盐Sigma-Aldrich13909
皂苷（来自皂荚树皮）Sigma-AldrichS4521
LIVE/DEAD 可固定Aqua死细胞染色试剂盒Life TechnologiesL34957
抗小鼠CD45 Alexa Fluor 700eBioscience56-0451-82
抗小鼠CD4 eFluor 450eBioscience48-0042-82
抗小鼠TCR β链 APC eFluor 780eBioscience47-5961-82
抗小鼠γδ TCR FITCeBioscience11-5711-82
抗小鼠IL-17A APCeBioscience12-7311-82
抗小鼠IFN-γ PEeBioscience11-5931-82
抗小鼠NK1.1 PE-Cy7eBioscience25-5941-82
抗小鼠CD90.2 APC eFluor 780eBioscience47-0902-82
抗小鼠CD3e FITCeBioscience11-0031-82
抗小鼠CD19 FITCeBioscience11-0193-82
抗小鼠CD11b FITCeBioscience11-0112-82
抗小鼠CD11c FITCeBioscience11-0114-82
抗小鼠TCR β链 FITCeBioscience11-5961-82
抗小鼠Ly-6G FITCeBioscience11-5931-82
抗小鼠Ly-6C FITCBD Pharmingen553104

参考文献

  1. Aas, J. A., Paster, B. J., Stokes, L. N., Olsen, I., Dewhirst, F. E. Defining The Normal Bacterial Flora Of The Oral Cavity. J Clin Microbiol. 43, 5721-5732 (2005).
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  4. Hajishengallis, G. Immunomicrobial Pathogenesis Of Periodontitis: Keystones, Pathobionts, And Host Response. Trends Immunol. 35, 3-11 (2014).
  5. Eke, P. I., et al. Prevalence Of Periodontitis In Adults In The United States: 2009 And 2010. J Dent Res. 91, 914-920 (2012).
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  10. Moutsopoulos, N. M., et al. Defective Neutrophil Recruitment In Leukocyte Adhesion Deficiency Type I Disease Causes Local IL-17-Driven Inflammatory Bone Loss. Sci Transl Med. 6, 229-240 (2014).
  11. Gaffen, S. L., Jain, R., Garg, A. V., Cua, D. J. The IL-23-IL-17 Immune Axis: From Mechanisms To Therapeutic Testing. Nat Rev Immunol. 14, 585-600 (2014).

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