牙龈免疫细胞网络的分离、表征与功能检测

摘要

我们建立了一种从小鼠牙龈中分离、表型鉴定及功能分析免疫细胞的技术。

摘要

组织中的免疫细胞网络在介导局部免疫和维持组织稳态中发挥关键作用，然而目前对口腔黏膜和牙龈中定居的免疫细胞群体仍知之甚少。我们建立了一种从小鼠牙龈组织中分离和研究免疫细胞的技术，该部位持续暴露于微生物环境，且易受常见炎症性疾病——牙周炎的影响。本方案可对牙龈定居免疫细胞群体进行详细的表型特征分析，即使在稳态条件下亦可实现。此外，该方法能够获得数量充足、活力高的细胞，可用于功能研究，例如细胞因子分泌的评估。 离体 这种对牙龈免疫细胞网络的表型与功能特征的综合分析，将有助于探究口腔免疫及牙周稳态相关的机制，同时也将深化我们对局部免疫病理机制的理解。

引言

牙龈组织包绕着人类和小鼠的牙齿，并持续暴露于复杂的牙菌斑生物膜中¹。监视牙龈屏障的免疫细胞网络对于维持组织完整性至关重要，它既能确保与局部共生微生物的稳态平衡，同时又能有效抵御病原体的侵袭²。为了实现稳态，免疫系统会精细地适应牙龈微环境，形成高度特化的免疫细胞网络；然而，目前对牙龈免疫细胞群体的具体组成及其在维持组织免疫中的作用仍知之甚少²。

当牙龈部位的免疫稳态因宿主易感性增加和/或失调的微生物群落存在而遭到破坏时，便会引发一种炎症性疾病——牙周炎³⁴。牙周炎是一种常见的炎症性疾病，可导致牙齿支持结构的丧失，在严重情况下约影响总体人群的10%⁵。然而，解析牙周炎易感性和进展过程中的关键因素已被证明十分困难⁶。动物模型在阐明牙周炎发生与进展机制方面发挥了极为重要的作用⁷。这些模型可用于界定对维持免疫稳态至关重要的关键细胞群体和分子介质，并揭示驱动牙周炎发展的机制。此类研究将彻底改变我们对牙龈局部免疫稳态调控机制的理解，并深化当前对疾病发病机制的认识。

....

方案

本方案中描述的所有实验程序均遵循必要的指导原则，并已获得美国国立牙科与颅面研究所/美国国立卫生研究院机构动物照护与使用委员会的批准。

1. 提前准备

1. 配制完全培养基：RPMI 培养基中添加 2 mM L-谷氨酰胺、100 单位/毫升青霉素、100 µg/mL 链霉素和 10% 胎牛血清（FBS）。
2. 配制 DNase 培养基：50 mL RPMI 培养基中加入 7.5 µg DNase（现配现用，全程置于冰上）。
3. 配制胶原酶-DNase 培养基：在 5 mL DNase 培养基中加入 3.2 mg/mL IV 型胶原酶（Collagenase Type IV）（现配现用，全程置于冰上）。
4. 预冷 FACS 缓冲液：将 0.5% FBS 溶于 PBS 中。
5. 将离心机预冷至 4 °C。
6. 将摇床培养箱预热至 37 °C。

2. 牙龈组织块的分离、解剖及细胞分离

1. 根据ARAC指南，将小鼠置于适当的密闭容器中，通过暴露于CO₂进行安乐死。
2. 打开胸腔和腹腔以暴露心脏和内脏器官。进行灌注时，在下腔静脉处做一切口，并使用带有27 G针头的3 ml注射器经左心室灌注3 ml PBS。
3. 将小鼠身体和头部固定在垫子上，腹部朝上。
4. 用剪刀从口角向颈部....

结果

为说明本方案的应用，我们展示了在患有和不患有牙周炎的小鼠牙龈中（WT 与 LFA^-/-，图 2A–C）免疫细胞网络的代表性结果。代表性流式细胞术图显示了牙龈中活的 CD45⁺ 造血细胞（图 2A、2C）。使用本方案分离和处理免疫细胞可获得足够数量的细胞，用于进行离体（ex vivo）刺激并分析细胞因子分泌模式。此处展示了稳态下（WT）以及因 LFA 缺陷而出现牙周炎的小鼠中总 CD45⁺ 细胞内 IL-17 和 IFN-γ 的染色情况（图 2B–D）。这些数据揭示了该技术在捕获组织稳态（WT）及局部牙周炎（LFA^-/-）背景下细胞因子谱方面的潜力。在易感牙周炎的小鼠中，我们进一步表征了牙龈免疫细胞组成，特别是 T 细胞和固有淋巴细胞（ILC）亚群的组成情况（

讨论

本技术能够从单只小鼠成功获得大量免疫细胞，不仅适用于表型鉴定，也适用于离体功能研究。ex vivo。此前已有研究团队发表了一种分离和表征小鼠牙龈免疫细胞的方案，并提出了在动物模型中研究牙周炎时应用多色流式细胞术的价值 ⁹。经过大量问题排查，本方案的关键改进在于对整块组织进行解剖，以同时包含牙龈领圈区域和牙间牙龈（图1）。若仅进行牙龈解剖，往往无法获得全层瓣，尤其在牙间区域容易遗漏部分牙龈组织。采用本方法后，所收获的免疫细胞数量显著增加。该技术还可实现对上颌和下颌牙龈组织的最佳分离。

该方案的关键步骤包括对牙龈区域进行保守性分离以及保持高效的分离速度。具体而言，应分离包含牙齿周围最小量组织（牙龈）的组织块，避免包含颊侧组织。组织块应快速分离，且组织和细胞需始终保持在冰上，以确保细胞活性最佳。

在 troubleshooting 时需要注意，细胞产量低可能与胶原酶孵育时间不足、胶原酶浓度不当和/或从组织块中分离牙龈组织不充分有关。在此方面，使用放大镜（2X-.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
精细剪刀	精细科学工具	14058-11
3号手术刀柄	精细科学工具	10003-12
10号手术刀片	精细科学工具	10010-00	无菌
碎屑镊	Integra Miltex	6-304
带普通斜面针头	BD Medical	305109	27 G，12.7 mm 长度
Monoject 注射器	Covidien	8881513934	鲁尔锁扣式尖端，3 ml
PBS，pH 7.4	Life Technologies	10010-049	不含钙和镁
RPMI 1640	Lonza	12-167F	不含L-谷氨酰胺
牛胰DNase I	Sigma-Aldrich	DN25-1G
IV型胶原酶	Gibco (by Life technologies)	17104-019
胎牛血清	Gemini Bio-products	100-106
庆大霉素 50 mg/ml	Quality biological	120-098-661EA
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）	Gibco (by Life technologies)	15140-122
L-谷氨酰胺	Gibco (by Life technologies)	25030-081
0.5 M EDTA，pH 8.0	Quality biological	351-027-721EA
50 ml 离心管	Corning	352070	聚丙烯材质，无菌
70 μM 细胞筛	Corning	352350
培养皿	Corning	351029	无菌
5 ml FACS 管	Corning	352052	无菌
BD GolgiPlug	BD Biosciences	555029	含布雷菲德菌素A溶液
佛波醇-12-十四烷酰-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
钙离子霉素钙盐	Sigma-Aldrich	13909
皂苷（来自皂荚树皮）	Sigma-Aldrich	S4521
LIVE/DEAD 可固定Aqua死细胞染色试剂盒	Life Technologies	L34957
抗小鼠CD45 Alexa Fluor 700	eBioscience	56-0451-82
抗小鼠CD4 eFluor 450	eBioscience	48-0042-82
抗小鼠TCR β链 APC eFluor 780	eBioscience	47-5961-82
抗小鼠γδ TCR FITC	eBioscience	11-5711-82
抗小鼠IL-17A APC	eBioscience	12-7311-82
抗小鼠IFN-γ PE	eBioscience	11-5931-82
抗小鼠NK1.1 PE-Cy7	eBioscience	25-5941-82
抗小鼠CD90.2 APC eFluor 780	eBioscience	47-0902-82
抗小鼠CD3e FITC	eBioscience	11-0031-82
抗小鼠CD19 FITC	eBioscience	11-0193-82
抗小鼠CD11b FITC	eBioscience	11-0112-82
抗小鼠CD11c FITC	eBioscience	11-0114-82
抗小鼠TCR β链 FITC	eBioscience	11-5961-82
抗小鼠Ly-6G FITC	eBioscience	11-5931-82
抗小鼠Ly-6C FITC	BD Pharmingen	553104