我们描述了一种相对简单的方法 离体 利用小鼠中的荧光报告系统对肺转移灶内肿瘤细胞与基质间的相互作用进行活体成像。通过转盘共聚焦显微镜技术，可实现至少4小时的活细胞动态观察，并可进一步拓展用于其他肺部炎症性疾病的活体研究。
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摘要
摘要
转移是导致癌症相关发病率和死亡率的主要原因。转移是一个多步骤的过程，由于其复杂性，调控转移性播散和生长的确切细胞与分子机制仍不明确。活体成像技术可实现对细胞与其微环境之间动态及空间相互作用的可视化观察。实体瘤通常会转移至肺部，然而肺部的解剖位置给活体成像带来了挑战。本实验方案提供了一种相对简单且快速的方法，用于在肺转移灶内对肿瘤细胞与其周围间质之间的动态相互作用进行离体（ex vivo）活体成像。利用该方法，可在数小时内实时观察癌细胞的运动性以及癌细胞与微环境中间质细胞之间的相互作用。通过使用转基因荧光报告小鼠、荧光标记的细胞系、可注射的荧光标记分子和/或抗体，可对肺微环境中的多个组分进行可视化，例如血管和免疫细胞。为成像不同类型的细胞，采用了转盘共聚焦显微镜，该设备支持长时间连续成像，并能快速进行四色图像采集。通过对多个视野位置和焦平面采集的图像生成延时电影，可记录至少4小时的活体转移性细胞与免疫细胞之间的相互作用。该技术还可进一步用于化疗或靶向治疗的效果检测。此外，该方法也可经调整后用于研究其他可能影响肺微环境的肺部相关疾病。
引言
癌症最致命的方面是转移，其导致了90%以上的癌症相关发病率和死亡率1。转移是一个多步骤过程，由于其复杂性，调控转移性播散和生长的确切细胞与分子机制至今仍不明确。为了发生转移，原发肿瘤中的肿瘤细胞必须从邻近细胞和基底膜脱离，穿过细胞外基质，进入血管或淋巴管，通过血液或淋巴系统迁移，在继发部位穿出血管，并最终存活并形成继发性肿瘤。除了肿瘤细胞自身的特性外，微环境的贡献也至关重要，微环境包括邻近的间质以及癌细胞的正常对应细胞，对转移灶的定植和建立起关键作用2。
研究转移性定植和生长的传统方法通常考察静态状态，即通过切除组织并进行切片以进行组织学分析。这些数据仅能提供这一高度动态过程的瞬时快照。尽管这些研究可获得一些有用信息，但肿瘤细胞与基质细胞在转移形成过程中复杂的相互作用无法通过这些方法得到充分评估。此外，无法深入了解肿瘤细胞或基质细胞的迁移模式，而这些模式对于在远端部位建立克隆至关重要。为了有效研究转移过程，必须对癌细胞与其微环境之间的各种相互作用进行连续且实时的可视化观察。
肺是乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤和肉瘤等实体瘤发生转移的常见部位3活体成像先前已被用于研究多种原发性肿瘤和转移性肿瘤模型中的细胞间相互作用4,5小鼠肺部成像方法，包括活体成像、肺组织切片成像以及一种 离体 肺转移实验已有报道6–9利用胸腔负压窗稳定小鼠肺部进行活体成像6该方法用于肺微循环和肺泡腔的延时成像。由于肺的解剖位置特殊，活体成像面临挑战。为暴露肺组织，必须打开胸腔，这会导致胸内负压丧失并引起肺塌陷。该方法仅能观察肺的一小部分区域，技术难度较高，对于研究与血流无关的过程而言是一种不必要的复杂操作。此外，该方法还需消除呼吸运动带来的干扰，可通过在呼吸间隙采集图像或在图像采集后进行运动校正分析来实现。10. 替代方案 离体 肺组织切片成像提供了稳定性和深度，并为肺实质的免疫染色做好准备7然而，漫长的切片过程导致动物处死后与成像实验开始之间存在较长时间的延迟。此外，小鼠肺组织的切片过程会造成大量细胞死亡。8，从而影响成像样本的质量和数量，并可能不必要地改变肿瘤-间质相互作用。为了在活体成像与肺组织切片成像技术之间实现技术上的衔接，同时充分利用这两种技术的优势，一种相对较快且简便的方法是 离体 开发了一种肺部成像技术，该方法通过对手术切除的完整肺叶进行非切片成像实现。利用该技术，可在数小时内实时观察癌细胞的运动行为及其在微环境中的癌细胞与基质细胞之间的相互作用。
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方案
所述所有操作必须遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并事先获得当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。
1. 肺转移灶的建立 离体 活体成像（转基因或尾静脉注射）
注意：肺转移可通过使用基因工程小鼠模型或通过静脉（i.v.）注射癌细胞来建立。
- 通过将基因工程肿瘤小鼠模型与转基因报告小鼠杂交，生成可用于成像的肺转移灶， 例如，跨乳腺癌小鼠模型，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列-多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT)11 进入 ACTB-ECFP 小鼠模型12.
注意：ACTB-ECFP 模型在 β-肌动蛋白启动子驱动下表达增强型青色荧光蛋白（ECFP），因此所有细胞均在蓝色、CFP 通道中发出荧光。然而，癌细胞最为显著，在显微镜下表现为大量 ECFP 阳性细胞。MMTV-PyMT 小鼠模型会发展出渐进性疾病，其乳腺肿瘤生长伴随癌细胞向周围组织扩散，尤其是向肺部转移。在 FVB/n 背景的 MMTV-PyMT 小鼠中，约在 10–11 周龄时可观察到微转移灶。通常情况下，这些微转移灶在约 14 周龄时进展为大转移灶。13.
或 - 使用原代细胞或同源细胞系生成实验性转移灶。使用 体外 经处理的原代肿瘤细胞或细胞系（例如，转导）后经静脉注射14.
- 简而言之，本方案中，注射表达绿色荧光蛋白（GFP）的（+） MMTV-PyMT 将细胞系导入荧光报告小鼠（ACTB-ECFP）或野生型小鼠。随后，观察这些被称为VO-PyMT的细胞15 使用绿色 GFP 通道。
注意：原始的 VO-PyMT 细胞系由美国田纳西州纳什维尔范德堡骨科研究所建立。VO 是范德堡骨科（Vanderbilt Orthopaedics）的缩写。 - 注射10后6 细胞（在 200 µl），在注射后立即至数小时内观察癌细胞外渗；在注射后1至3周内观察微转移灶，并在注射后3周检测大转移灶15.
注意：注射较少的细胞可延长从注射到转移性生长的时间。
- 简而言之，本方案中，注射表达绿色荧光蛋白（GFP）的（+） MMTV-PyMT 将细胞系导入荧光报告小鼠（ACTB-ECFP）或野生型小鼠。随后，观察这些被称为VO-PyMT的细胞15 使用绿色 GFP 通道。
2. 转基因和/或注射标记物对转移微环境中目标组分的标记
注意：可通过转基因小鼠和/或多种可注射物质实现标记。务必使用不同的荧光颜色来标记不同类型的细胞。
- 利用转基因小鼠标记转移性微环境的组分。将前述的小鼠肿瘤模型（例如，MMTV-PyMT 与 ACTB-ECFP）与另一种转基因小鼠模型杂交，使目标基质细胞通过一种非ECFP的荧光蛋白标记，例如，c-fms-EGFP4,16。
注意：除了可在CFP通道中观察癌细胞外，该方法还可通过GFP通道观察髓系细胞4。
和/或 - 通过向表达荧光报告蛋白的转基因小鼠或（非荧光）野生型小鼠注射标记物，以标记转移性微环境中的不同组分。
注意：可注射多种化合物以标记转移性微环境中的不同组分，例如，此处使用AF647标记的Gr-1抗体标记中性粒细胞及部分单核细胞13，并使用不同分子量的葡聚糖标记肺毛细血管。这些注射剂的制备方法见步骤4。
3. 解剖前材料的准备
- 2% 琼脂糖
- 称取 0.2 g 琼脂糖，加入 10 ml 1 x PBS 中。加热溶液以溶解琼脂糖。琼脂糖在室温下会凝固，因此使用前应将其置于 37 °C 水浴中保温。
- CO2 与温度控制器
- 检查加湿室内的 ddH2O。必要时补充。将配置板插入温度台板支架（气候室）中。打开 CO2 控制器，并将 CO2 浓度设定为 5%。确保气流速率为 0.4 Nl/min。
- 打开空气和 CO2 阀门。开启温度控制器。确保气候室和盖子的温度均设定为 37 °C。
- 释放 CO2 流量计上的气压。观察 CO2 浓度上升，平衡过程可能需要长达 30 分钟。
- 转盘共聚焦显微镜
注：显微镜系统的详细设置此前已有描述4,17。- 打开激光器（用于 488 nm 激发的氩离子激光器，以及固态 405 nm、561 nm 和 640 nm 激光器）。依次开启显微镜、相机、转盘控制单元、声光可调滤光器（AOTF）、激光控制单元和相机控制器。
- 打开显微镜快门，启动运行显微镜的计算机，并打开控制软件。
- 工具与解剖平台的准备
- 打开热珠灭菌器，并使其升温至 250 °C。用清水和肥皂清洗两对眼科剪刀和镊子。将器械灭菌至少 30 秒。待器械冷却后使用。使用聚苯乙烯培养皿盖作为解剖平台，并在其上覆盖一片实验室吸水纸。
4. 注射液的制备
注意：根据半衰期和所需的反应效果，可在动物处死后立即注射荧光标记的抗体和/或荧光分子，或在处死前数小时至数天进行注射。
- 为了成像 Gr1 阳性中性粒细胞和单核细胞，在生物安全柜中将 7 µl 储存液 AF647 标记的 Gr-1 抗体（1 mg/ml）加入 100 µl 无菌 PBS 中，用注射器混匀。在注射器上安装 27 G ½ 针头。
- 为了成像肺毛细血管，另准备第二和第三支注射器，分别装入 100 µl 的 70 kD 罗丹明标记葡聚糖（4 mg/ml）或 10 kD AF647 标记葡聚糖（4 mg/ml）。在这些注射器上安装 27 G ½ 针头。
- 在肺组织切除前 5 小时，通过静脉注射 AF647 标记的抗体溶液。
- 在肺组织切除前立即通过静脉注射一种或两种葡聚糖溶液。
5. 肺组织的制备 离体 活体成像
注意：请尽量无菌且谨慎操作，以避免对肺部免疫细胞造成不必要的干扰。
- 按照IACUC批准的动物实验方案，向小鼠腹腔（i.p.）注射过量麻醉剂以实施安乐死。 例如，2.5% Avertin 1 ml。等待小鼠呼吸停止且对有害刺激（后肢足垫捏压）完全无反应。
注意：应避免采用颈椎脱位和二氧化碳安乐死，因为这些方法可能对肺细胞活力产生不利影响。 - 将小鼠固定在解剖板上，并用70%乙醇对小鼠进行消毒。
- 使用手术剪首先在皮肤上做一条横向的上腹部切口，随后在腹膜上做类似的切口。将解剖板保持垂直位置，剪断降主动脉，使血液积聚在腹腔内，而非胸腔内。
- 在膈肌上剪开一个小口以释放负压。沿第10和第12肋骨剪开，切除膈肌，以获得对肺部的可视通路。
- 使用手术剪沿胸骨上方剪开皮肤至气管处，但保持肋骨完整。将皮肤与肋骨分离。仔细剥离气管周围结缔组织以暴露气管，注意避免损伤气管本身（图1A).
- 在暴露的气管上，平行于软骨环，尽可能靠近喉部，剪开一个直径约1 mm的小开口（图1B注意不要完全切断气管。
- 取一支20 G针头，轻轻将针头插入气管4-5 mm，无需施加对抗力（图1D）。针头的末端应透过气管可见（图1C）。使用镊子将气管中的针头固定。或者，也可用缝线围绕气管打结，以固定针头位置。
注意：插入过深可能会损伤气管隆突，或仅使一侧肺充气。 - 用注射器吸取 400 µl 的 37 °C 2%低熔点琼脂糖（直接取自恒温水浴）。确保解剖板竖直放置，通过针头将温热的琼脂糖缓慢注入肺部，使用约~400 µl 以扩张肺部。
注意：观察肺部在肋骨内的膨胀情况。切勿过度充气，以免肺部破裂。 - 肺部充气至大约占据胸腔的2/3后，取下注射器，同时保持针头留在气管内，以防止琼脂糖泄漏。
- 倒入约 50 ml 的 20 °C 用 PBS 覆盖膨胀的肺组织，使肺内的琼脂糖凝固定型。缓慢拔出针头，并用镊子夹闭气管，防止未凝固的琼脂糖泄漏。
- 通过胸骨切开术暴露肺脏，随后切除肺组织。切除肺脏时，夹住气管并完全剪断气管。轻轻上提气管，边牵拉肺组织出胸腔，边剪除周围结缔组织和食管，直至将肺脏完全从鼠体分离。图1E).
- 将肺组织浸入温热的RPMI-1640培养基中以洗去多余血液，并使用剪刀和镊子在肺门处剪断各肺叶的主支气管，轻柔分离肺叶图1F).
- 将脑叶平面向下放置，以最大化成像表面，置于24孔成像板的一个孔中（图1G）。加入 100 µl 的 37 °C 在肺叶上方加入RPMI-1640培养基。将数个15 mm圆形显微镜盖玻片置于肺叶上方，以防止其漂浮。
- 将预热的 PBS 加入周围孔中，以防止 RPMI-1640 培养基蒸发。将 24 孔板放入已平衡的气候室中，并将肺叶维持在 37 °C 与空气和5% CO2将气候室安装在共聚焦显微镜的载物台上。
注意：其他气体混合物（例如，5% O₂）2，5% CO₂2 在 N2 在低氧条件下研究细胞行为的方法也可予以考虑。
图 1. 用于活体成像的肺组织制备方案。 （A）小鼠制备完成后暴露气管。 （B）在暴露的气管上沿软骨环方向做一小切口。 （C）将20 G针头插入气管内4-5 mm。 （D）向肺内灌注400 µl 2%低熔点琼脂糖。 （E）将膨胀的肺组织从小鼠体内分离。 （F）充气后分离肺叶。 （G）将肺叶置于24孔成像板的孔中。 请点击此处查看该图的放大版本。
6. 图像的采集与分析
注意：可使用多种由不同软件支持的转盘共聚焦显微镜获取图像。在本方案中，图像采集采用 µManager 与自制转盘共聚焦显微镜，或 Zen 与商用转盘共聚焦显微镜，而图像序列的编辑与分析则使用 Imaris。
- 使用 µManager 获取图像。关于使用 µManager 软件获取图像的详细逐步操作方案已有先前文献描述18。
或 - 使用图像分析软件（如 Zen）获取图像（见图 S1）。
- 点击“定位”选项卡，在“光路”工具中选择物镜（10x 或 20x）（图 S1A，红色框）。随后点击“眼睛 – DAPI”以通过目镜观察 CFP 通道（图 S1A，蓝色框）。手动使用显微镜定位样品。当组织位于视野中心后，点击“全部关闭”。
- 点击“采集”选项卡，设置图像采集的所有参数。
- 在“通道”工具中，点击“+”按钮（图 S1B，红色框）。弹出菜单后，在“染料数据库”中搜索样品中存在的染料（图 S1B）。选择染料后点击“添加”。
注意：程序将自动优化所有滤光片设置。如需删除染料，先选中该染料，然后点击垃圾桶按钮（图 S1B，黄色框）。 - 在“采集模式”菜单中，将“Bin”设置为 5x5。在通道菜单中双击 ECFP 以选中该通道。将激光功率降低至 20%，以避免在设置采集参数过程中样品发生漂白。
- 在“实验管理器”部分勾选“拼图”（Tiles）选项，拼图工具将出现在“多维采集”工具组中（图 S1C）。点击“高级设置”按钮以查看相机的实时图像。在“位置”部分点击“添加”按钮，向实验中添加 4 至 6 个位置。如需删除某一位置，先选中该位置，然后点击垃圾桶按钮。
- 在“采集参数”工具组中，打开“聚焦策略”工具，并从下拉列表中选择“绝对固定 Z 位置”。
- 在“实验管理器”部分勾选“Z 层扫描”（Z-Stack）选项，Z 层扫描工具将出现在“多维采集”工具组中（图 S1D）。在“位置”部分双击其中一个位置并点击“实时”（Live）。手动设置成像区域的第一和最后一个 Z 位置，将间隔设为 4 µm。
注意：程序将根据所选范围和间隔自动确定切片数量。理想情况下，5–7 个切片足以实现充分可视化并加快图像采集速度。 - 在“实验管理器”部分勾选“时间序列”（Time Series）选项。在“多维采集”工具组中出现的“时间序列”工具中，设置所需的“持续时间”和“时间间隔”（图 S1E）。
- 在“采集模式”菜单中，将“Bin”设置为 2x2。在通道菜单中双击某一荧光染料以选中该通道，并将激光功率提高至 100%。点击“实时”（Live）并调整“曝光时间”。对每个荧光染料重复此操作。
- 勾选“启用自动保存”选项。选择保存文件夹并输入文件名。所有采集的图像将自动保存至该文件夹。
- 在“实验管理器”部分点击“开始实验”以启动图像采集。
- 图像采集完成后，在 Imaris 软件中整合原始数据。将图像转换为 .ims 文件并进行相应调整。有关使用 Imaris 进行文件转换、调整及保存视频的详细逐步操作方案已有先前文献描述18。
- 保存视频时，将“帧率”设置为每秒 5 帧（fps）。
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结果
利用转盘共聚焦显微镜、多种小鼠模型系统及可注射试剂，可对转移性微环境进行可视化并随时间追踪。使用 MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP 三重转基因小鼠模型，可对不同细胞组分进行荧光标记（图2A，视频1）。在CFP通道中可观察到肺实质的典型结构，因为所有细胞均在β-actin启动子驱动下表达ECFP。较大或多细胞肺转移灶在有序的肺组织结构中清晰可辨，表现为成团的细胞聚集。通过c-fms-EGFP表达可在GFP通道中观察到髓系细胞，该转基因对应于CSFR-112。髓系细胞具有高度动态性，可在成像视野中迁移。与紧邻肺转移灶的髓系细胞相比，肺实质中的c-fms-EGFP阳性细胞数量更多且迁移更活跃。髓系细胞的动态行为及其与肺转移灶的相互作用可被实时连续追踪数小时。
为了研究转移性定植与生长，采用实验性转移模型（图2B，视频2）。将表达GFP的VO-PyM...
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讨论
本文描述了一种详细的方法 离体 小鼠转移模型中肺转移的活体成像。该成像方案可直接可视化肺微环境中肿瘤细胞与基质间的动态及空间相互作用。此方法相对简便快速，可实现至少4小时稳定的肺转移成像。通过这些实验获取的影像视频可用于追踪细胞运动性和细胞间相互作用等动态过程。
介绍了两种肺转移模型的建立方法：基因工程小鼠模型和改造细胞系的应用。MMTV-PyMT 小鼠模型可模拟乳腺癌的发展过程及自发性肺转移。其他可模拟转移性扩散的技术也已建立，例如，将细胞原位移植至乳腺20。通过尾静脉注射 VO-PyMT 细胞系，可模拟乳腺癌转移的定植与生长过程。VO-PyMT 细胞生长所需的时间取决于实验对肺转移阶段的需求。根据注射细胞数量的不同，可在注射 VO-PyMT 细胞后数天至两周内观察到微转移灶。
为了获得最佳的肺部成像效果，在肺部充气过程中必须格外小心。正确的充气操作要求针头插入气管的深度仅为 4–5 mm。若针头插入过深，可能导致肺部部分或单侧充气。此外，在实际充气...
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披露
作者声明无利益冲突。所有动物实验均依照加州大学旧金山分校（UCSF）IACUC批准的方案进行。
致谢
感谢 Nguyen H. Nguyen 提供的技术帮助，以及 Audrey O’Neill 在使用蔡司 Cell Observer 转盘共聚焦显微镜方面的支持。本工作得到了美国国防部博士后奖学金（W81XWH-11-01-0139）和魏茨曼科学研究所-国家女性科学家博士后奖励计划（授予 V.P.）的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| MMTV-PyMT/FVB 小鼠 | Jackson Laboratory | 2374 | 雌性小鼠 |
| ACTB-ECFP/FVB 小鼠 | UCSF Werb 实验室 | 雌性小鼠 | |
| c-fms-EGFP/FVB 小鼠 | UCSF Werb 实验室 | 雌性小鼠 | |
| FVB 小鼠 | Jackson Laboratory | 1800 | 雌性小鼠 |
| GFP+ VO-PyMT 细胞 | UCSF Werb 实验室 | ||
| 70,000 kDa 葡聚糖，罗丹明标记 | Invitrogen | D1818 | 用 1 × PBS 稀释至 4 mg/ml，于 -20 °C 保存。每只动物使用 0.4 mg。 |
| 10,000 kDa 葡聚糖，Alexa Fluor 647 标记 | Invitrogen | D22914 | 用 1 × PBS 稀释至 4 mg/ml，于 -20 °C 保存。每只动物使用 0.4 mg。 |
| 抗小鼠 Gr-1 抗体 Alexa Fluor 647 标记 | UCSF 单克隆抗体核心实验室 | 储存浓度为 1 mg/ml。每只动物使用 7 μg。 | |
| 麻醉剂 | IACUC 批准的麻醉剂，用于麻醉和/或安乐死 | ||
| 1× PBS | UCSF 细胞培养中心 | ||
| PBS，USP 无菌 | Amresco INC | K813-500ML | 静脉注射用超纯级 |
| 泡沫塑料平台 | 用作解剖板 | ||
| 精细剪刀（锋利） | Fine Science Tools | 14060-11 | |
| 镊子 | Roboz 外科器械商店 | RS-5135 | |
| 热珠灭菌器 | Fine Science Tools | 18000-45 | 使用前开启 30 分钟 |
| 空气 | UCSF | ||
| 氧气 | UCSF | ||
| 二氧化碳 | UCSF | ||
| 1 mL 无针头注射器 | BD | 309659 | |
| 27 G × 1/2 针头 | BD | 305109 | 用于静脉注射 |
| 20 G × 1 针头，短斜面 | BD | 305178 | |
| 低熔点温度琼脂糖 | Lonza | 50111 | 配制 10 ml 溶液：称取 0.2 g 琼脂糖，加入 10 ml 1 × PBS，加热溶解。琼脂糖在室温下会凝固，因此使用前应置于 37 °C 水浴中保温。 |
| 不含酚红的 RPMI-1640 培养基 | Life Technologies | 11835-030 | |
| 24 孔成像培养板 | E&K Scientific | EK-42892 | |
| 玻璃盖玻片，15 mm | Fisher Scientific | 22-031-144 | |
| 数字 CO2 与温度控制器 | Okolab | DGTCO2BX | http://www.oko-lab.com |
| 气候箱 | Okolab | http://www.oko-lab.com | |
| Cell Observer 转盘共聚焦显微镜 | Zeiss | ||
| Zen 软件 | Zeiss | ||
| 倒置显微镜 | Carl Zeiss Inc | Zeiss Axiovert 200M | |
| ICCD 相机 | Stanford Photonics | XR-Mega-10EX S-30 | |
| 转盘共聚焦扫描头 | Yokogawa Corporation | CSU-10b | |
| Imaris | Bitplane | ||
| mManager | Vale 实验室，UCSF | 开源软件 |
参考文献
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