ex vivo 肺转移及其微环境的活体成像

摘要

我们描述了一种相对简单的方法 离体 利用小鼠中的荧光报告系统对肺转移灶内肿瘤细胞与基质间的相互作用进行活体成像。通过转盘共聚焦显微镜技术，可实现至少4小时的活细胞动态观察，并可进一步拓展用于其他肺部炎症性疾病的活体研究。

摘要

转移是导致癌症相关发病率和死亡率的主要原因。转移是一个多步骤的过程，由于其复杂性，调控转移性播散和生长的确切细胞与分子机制仍不明确。活体成像技术可实现对细胞与其微环境之间动态及空间相互作用的可视化观察。实体瘤通常会转移至肺部，然而肺部的解剖位置给活体成像带来了挑战。本实验方案提供了一种相对简单且快速的方法，用于在肺转移灶内对肿瘤细胞与其周围间质之间的动态相互作用进行离体（ex vivo）活体成像。利用该方法，可在数小时内实时观察癌细胞的运动性以及癌细胞与微环境中间质细胞之间的相互作用。通过使用转基因荧光报告小鼠、荧光标记的细胞系、可注射的荧光标记分子和/或抗体，可对肺微环境中的多个组分进行可视化，例如血管和免疫细胞。为成像不同类型的细胞，采用了转盘共聚焦显微镜，该设备支持长时间连续成像，并能快速进行四色图像采集。通过对多个视野位置和焦平面采集的图像生成延时电影，可记录至少4小时的活体转移性细胞与免疫细胞之间的相互作用。该技术还可进一步用于化疗或靶向治疗的效果检测。此外，该方法也可经调整后用于研究其他可能影响肺微环境的肺部相关疾病。

引言

癌症最致命的方面是转移，其导致了90%以上的癌症相关发病率和死亡率¹。转移是一个多步骤过程，由于其复杂性，调控转移性播散和生长的确切细胞与分子机制至今仍不明确。为了发生转移，原发肿瘤中的肿瘤细胞必须从邻近细胞和基底膜脱离，穿过细胞外基质，进入血管或淋巴管，通过血液或淋巴系统迁移，在继发部位穿出血管，并最终存活并形成继发性肿瘤。除了肿瘤细胞自身的特性外，微环境的贡献也至关重要，微环境包括邻近的间质以及癌细胞的正常对应细胞，对转移灶的定植和建立起关键作用²。

研究转移性定植和生长的传统方法通常考察静态状态，即通过切除组织并进行切片以进行组织学分析。这些数据仅能提供这一高度动态过程的瞬时快照。尽管这些研究可获得一些有用信息，但肿瘤细胞与基质细胞在转移形成过程中复杂的相互作用无法通过这些方法得到充分评估。此外，无法深入了解肿瘤细胞或基质细胞的迁移模式，而这些模式对于在远端部位建立克隆至关重要。为了有效研究转移过程，必须对癌细胞与其微环境之间的各种相互作用进行连续且实时的可视化观察。

肺是乳腺癌、结直肠癌、胰腺癌、黑色素瘤和肉瘤等实体瘤发生转移的常见部位³活体成像先前已被用于研究多种原发性肿瘤和转移性肿瘤模型中的细胞间相互作用^4,5小鼠肺部成像方法，包括活体成像、肺组织切片成像以及一种 离体 肺转移实验已有报道^6–9....

方案

所述所有操作必须遵循脊椎动物使用相关的指南和法规，并事先获得当地机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 肺转移灶的建立 离体 活体成像（转基因或尾静脉注射）

注意：肺转移可通过使用基因工程小鼠模型或通过静脉（i.v.）注射癌细胞来建立。

1. 通过将基因工程肿瘤小鼠模型与转基因报告小鼠杂交，生成可用于成像的肺转移灶， 例如，跨乳腺癌小鼠模型，小鼠乳腺肿瘤病毒长末端重复序列-多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT)¹¹ 进入 ACTB-ECFP 小鼠模型¹².
   注意：ACTB-ECFP 模型在 β-肌动蛋白启动子驱动下表达增强型青色荧光蛋白（ECFP），因此所有细胞均在蓝色、CFP 通道中发出荧光。然而，癌细胞最为显著，在显微镜下表现为大量 ECFP 阳性细胞。MMTV-PyMT 小鼠模型会发展出渐进性疾病，其乳腺肿瘤生长伴随癌细胞向周围组织扩散，尤其是向肺部转移。在 FVB/n 背景的 MMTV-PyMT 小鼠中，约在 10–11 周龄时可观察到微转移灶。通常情况下，这些微转移灶在约 14 周龄时进展为大转移灶。¹³.
   或
2. 使用原代细胞或同源细胞系生成实验性转移灶。使用 ....

结果

利用转盘共聚焦显微镜、多种小鼠模型系统及可注射试剂，可对转移性微环境进行可视化并随时间追踪。使用 MMTV-PyMT; ACTB-ECFP; c-fms-EGFP 三重转基因小鼠模型，可对不同细胞组分进行荧光标记（图2A，视频1）。在CFP通道中可观察到肺实质的典型结构，因为所有细胞均在β-actin启动子驱动下表达ECFP。较大或多细胞肺转移灶在有序的肺组织结构中清晰可辨，表现为成团的细胞聚集。通过c-fms-EGFP表达可在GFP通道中观察到髓系细胞，该转基因对应于CSFR-1¹²。髓系细胞具有高度动态性，可在成像视野中迁移。与紧邻肺转移灶的髓系细胞相比，肺实质中的c-fms-EGFP阳性细胞数量更多且迁移更活跃。髓系细胞的动态行为及其与肺转移灶的相互作用可被实时连续追踪数小时。

为了研究转移性定植与生长，采用实验性转移模型（图2B，视频2）。将表达GFP的VO-PyM.......

讨论

本文描述了一种详细的方法 离体 小鼠转移模型中肺转移的活体成像。该成像方案可直接可视化肺微环境中肿瘤细胞与基质间的动态及空间相互作用。此方法相对简便快速，可实现至少4小时稳定的肺转移成像。通过这些实验获取的影像视频可用于追踪细胞运动性和细胞间相互作用等动态过程。

介绍了两种肺转移模型的建立方法：基因工程小鼠模型和改造细胞系的应用。MMTV-PyMT 小鼠模型可模拟乳腺癌的发展过程及自发性肺转移。其他可模拟转移性扩散的技术也已建立，例如，将细胞原位移植至乳腺²⁰。通过尾静脉注射 VO-PyMT 细胞系，可模拟乳腺癌转移的定植与生长过程。VO-PyMT 细胞生长所需的时间取决于实验对肺转移阶段的需求。根据注射细胞数量的不同，可在注射 VO-PyMT 细胞后数天至两周内观察到微转移灶。

为了获得最佳的肺部成像效果，在肺部充气过程中必须格外小心。正确的充气操作要求针头插入气管的深度仅为 4–5 mm。若针头插入过深，可能导致肺部部分或单侧充气。此外，在实际充气.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
MMTV-PyMT/FVB 小鼠	Jackson Laboratory	2374	雌性小鼠
ACTB-ECFP/FVB 小鼠	UCSF Werb 实验室		雌性小鼠
c-fms-EGFP/FVB 小鼠	UCSF Werb 实验室		雌性小鼠
FVB 小鼠	Jackson Laboratory	1800	雌性小鼠
GFP+ VO-PyMT 细胞	UCSF Werb 实验室
70,000 kDa 葡聚糖，罗丹明标记	Invitrogen	D1818	用 1 × PBS 稀释至 4 mg/ml，于 -20  °C 保存。每只动物使用 0.4 mg。
10,000 kDa 葡聚糖，Alexa Fluor 647 标记	Invitrogen	D22914	用 1 × PBS 稀释至 4 mg/ml，于 -20  °C 保存。每只动物使用 0.4 mg。
抗小鼠 Gr-1 抗体 Alexa Fluor 647 标记	UCSF 单克隆抗体核心实验室		储存浓度为 1 mg/ml。每只动物使用 7 μg。
麻醉剂			IACUC 批准的麻醉剂，用于麻醉和/或安乐死
1× PBS	UCSF 细胞培养中心
PBS，USP 无菌	Amresco INC	K813-500ML	静脉注射用超纯级
泡沫塑料平台			用作解剖板
精细剪刀（锋利）	Fine Science Tools	14060-11
镊子	Roboz 外科器械商店	RS-5135
热珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-45	使用前开启 30 分钟
空气	UCSF
氧气	UCSF
二氧化碳	UCSF
1 mL 无针头注射器	BD	309659
27 G × 1/2 针头	BD	305109	用于静脉注射
20 G × 1 针头，短斜面	BD	305178
低熔点温度琼脂糖	Lonza	50111	配制 10 ml 溶液：称取 0.2 g 琼脂糖，加入 10 ml 1 × PBS，加热溶解。琼脂糖在室温下会凝固，因此使用前应置于 37 °C 水浴中保温。
不含酚红的 RPMI-1640 培养基	Life Technologies	11835-030
24 孔成像培养板	E&K Scientific	EK-42892
玻璃盖玻片，15 mm	Fisher Scientific	22-031-144
数字 CO2 与温度控制器	Okolab	DGTCO2BX	http://www.oko-lab.com
气候箱	Okolab		http://www.oko-lab.com
Cell Observer 转盘共聚焦显微镜	Zeiss
Zen 软件	Zeiss
倒置显微镜	Carl Zeiss Inc	Zeiss Axiovert 200M
ICCD 相机	Stanford Photonics	XR-Mega-10EX S-30
转盘共聚焦扫描头	Yokogawa Corporation	CSU-10b
Imaris	Bitplane
mManager	Vale 实验室，UCSF		开源软件