对整装斑马鱼胚胎纤毛器官中的磷酸化表位进行免疫染色

摘要

本文描述了在整只斑马鱼胚胎中对磷酸化表位进行免疫染色的技术，并进一步在小至初级纤毛的细胞结构中进行双色荧光共聚焦定位。这些固定和成像技术可用于确定特定蛋白质出现或激活的位置及其动力学特征。

摘要

细胞的快速增殖、基因的组织特异性表达以及信号网络的形成是所有脊椎动物早期胚胎发育的特征。发育中胚胎内信号的时间动力学及其空间定位——即使在单个细胞内——有助于鉴定重要的发育相关基因。本文描述了免疫染色技术，这些技术已被证实可用于定义初级纤毛等微小结构中细胞内及整体动物水平信号的动力学。利用激光扫描共聚焦复合显微镜进行样品固定、成像及图像处理的技术流程可在短短36小时内完成。

斑马鱼（Danio rerio）是一种理想的模式生物，适用于希望在与人类疾病相关且成本较低的脊椎动物中开展研究的科研人员。基因敲除或基因沉默的效果必须通过检测目标蛋白产物的实际缺失来加以确认。本方案中所述的技术可用于实现对蛋白缺失的验证。此外，利用可识别经翻译后磷酸化修饰蛋白的抗体，还可解析信号通路的相关信息。因此，保持并优化表位的磷酸化状态对于此类检测至关重要，本实验方案即旨在实现这一目标。

本研究描述了在发育的前72小时内固定胚胎的技术，并在Kupffer's Vesicle（KV）、肾脏和内耳中将多种相关表位与纤毛进行共定位。这些技术操作简便，无需解剖，可在相对较短的时间内完成。将共聚焦图像序列投影为单幅图像，是展示这些数据的有效方法。

引言

此处所述技术源于旨在确定Ca下游靶点的研究²⁺ 早期发育过程中发生的事件（包括受精、原肠胚形成、体节发生以及躯干、眼睛、大脑和器官形成）期间的信号。^1-3 胚胎Ca的最初发现²⁺ 信号传导依赖于天然和工程化Ca的使用²⁺ 指示剂，例如 aequorin⁴ 和 fura-2。⁵ 即使借助现有技术，检测细胞内钙离子（Ca²⁺）的瞬时升高仍然具有挑战性。²⁺ 需要繁琐的分析工具，且无法揭示此类Ca的作用靶点²⁺ 信号。

本实验室研究钙²⁺ 通过Ca介导的信号²⁺/一种依赖钙调蛋白的（多功能）蛋白激酶，称为CaMK-II，该酶在中枢神经系统中含量丰富，最初被鉴定为长时程增强的调节因子。⁶ CaMK-II 并非脑组织特异性蛋白，在整个动物界物种（包括无脊椎动物）的整个生命周期及全身组织中均有广泛表达且高度保守。^7,8 CaMK-II 具有在 Ca²⁺ 水平下降后仍维持自身活性的独特能力²⁺ 由于其在Thr位点具有自磷酸化能力，导致其水平下降²⁸⁷在自磷酸化状态下，CaMK-II 在 Ca²⁺/CaM非依赖性方式，直至去磷酸化。⁶ 因此，磷酸化的CaMK-II（Thr²⁸⁷) 可识别自然且相关条件下发生 Ca²⁺ 已发生海拔升高。

一种针对自磷酸化（P-Thr²⁸⁷）哺乳动物CaMK-II的抗体已被充分表征，最初用于在脑组织中定位活化的CaMK-II。⁹ 斑马鱼（Danio rerio）具有七个CaMK-II基因^10,11，其编码的蛋白质在此区域包含MHRQE[pT²⁸⁷]VECLK序列。^10,11 该序列与用于制备该兔多克隆抗体的磷酸化肽抗原（MHRQE[pT]VDCLK；Upstate/Millipore）非常相似，因此该抗体与斑马鱼CaMK-II发生交叉反应并不完全意外。本实验室已证明，该抗体与斑马鱼CaMK-II的反应程度与自磷酸化水平及Ca²⁺/CaM非依赖性活性成正比。¹² 其他泛特异性CaMK-II抗体也被证实可与斑马鱼CaMK-II发生交叉反应。¹³

该抗体已被用于证明，在斑马鱼库普弗囊泡（Kupffer's Vesicle, KV）中，CaMK-II 优先在具有纤毛的器官一侧的细胞中被激活，而该器官对于建立左右不对称性至关重要¹²。该抗体还被用于证明，在器官定位决定的精确发育阶段，CaMK-II 在 KV 左侧的四个相邻细胞中发生瞬时激活¹²。除了库普弗囊泡（KV）外，自磷酸化的 P-T²⁸⁷ 也定位于其他纤毛组织（包括肾脏、神经丘和内耳）的特定细胞内位点^12,13。在斑马鱼肾脏中，P-T²⁸⁷-CaMK-II 富集于纤毛导管细胞的顶膜边缘以及泄殖腔纤毛内，并影响其组装过程¹³。最后，在发育中的内耳中，P-T²⁸⁷-CaMK-II 在纤毛基部高度富集，并通过 Delta-Notch 信号通路影响细胞分化¹⁴。综上所述，活化 CaMK-II 的检测揭示了细胞内 Ca²⁺ 释放的位点，并阐明了潜在的新型信号通路。

这些发现完全依赖于建立一种灵敏且准确的方法，以定位活化的（T²⁸⁷位磷酸化自磷酸化）CaMK-II。文中描述了固定和免疫染色斑马鱼克氏囊（KV）、肾脏和内耳的方法，同时也阐述了该技术的局限性。这些技术对于任何希望在脊椎动物早期发育过程中，对磷酸化表位或其他任何表位在两个荧光通道中获得高分辨率图像的研究人员都具有重要应用价值。

方案

本方案中的斑马鱼操作程序已获得弗吉尼亚联邦大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 试剂的准备

1. 4% PFA/PBS。在通风橱中称取8 g多聚甲醛（PFA）。仍在通风橱内，将干燥的PFA加入约80 ml蒸馏H₂O中，搅拌并加热至50 °C。持续搅拌，逐滴加入3–10滴新鲜的1N NaOH，直至PFA完全溶解且溶液变澄清。 停止加热，加入100 ml 2倍浓度磷酸盐缓冲液（PBS）。用蒸馏H₂O定容至200 ml 。冷却至室温 ，使用前确认pH为7.4。置于4 °C避光保存，但需在一周内使用完毕。
2. 使用不含任何添加剂的100%甲醇。使用不含任何添加剂的95%乙醇。
3. 配制含Tween的磷酸盐缓冲液（PBT）。在磷酸盐缓冲液（PBS）中加入0.1% Tween-20。将0.5 ml 20% Tween-20储备液加入100 ml 1倍浓度PBS中。室温保存。
4. 配制含Triton-X的磷酸盐缓冲液（PBTx）。在PBS中加入0.1% Triton X-100。将0.5 ml 20% Triton X-100储备液加入 100 ml PBS中。室温保存。
5. 配制10% NGS/PBTx。正常山羊血清（NGS）用于封闭非特异性结合位点。将NGS分装后于-20 °C保存。使用时，取1 ml NGS加入9 ml PBTx中。
6. 配制50%甘油/PBS。将等体积的2倍浓度PBS与100%甘油充分混合。室温保存。

2. 胚胎固定

1. 育种。 获取野生型（AB 和 WIK）或转基因（例如，β-actin:CAAX-GFP）胚胎通过自然交配获得。如需要，可按照所述方法向胚胎注射表达载体或吗啉代寡核苷酸。^15,16
2. 培养胚胎。 收集胚胎，并在含有0.003% 1-苯基-2-硫脲（PTU）的条件下于28.5 °C孵育，以抑制色素形成，具体方法如前所述。¹⁷
3. 固定。 当胚胎发育至所需阶段时，¹⁸, 使用MESAB麻醉胚胎，尽可能去除系统用水，加入新鲜的4% PFA/PBS固定3 - 4小时 室温下 注意：有时少于 20 小时 受精后（hpf）固定，去壳前固定。在20 hpf之后的时段，先在解剖显微镜下用两对精细尖头镊子去壳，再进行固定。
4. 更换溶液。 使用宽孔移液管按所述方法转移胚胎。¹⁷ 在1.5 ml带盖微量离心管中更换溶液时，仅需让胚胎依靠重力自然沉降，无需离心。
5. 后固定剂 孵育3-4小时后，移除PFA/PBS，加入100%甲醇并置于-20 °C保存至少48小时。注意：为获得最佳P-CaMK-II免疫反应性，甲醇总保存时间应不超过一周。

3. 胚胎整体免疫染色

1. 将每种实验条件下的至少10个胚胎放入带盖的1.5 ml离心管中，并做好标记。
2. 让胚胎自然沉降。吸除并弃去甲醇，随后用逐步降低浓度的乙醇溶液进行梯度复水，具体操作见下一步。每步洗涤均在摇床上轻柔振荡5分钟。
3. 依次使用以下5种溶液进行梯度复水：66%乙醇/33% PBTx、33%乙醇/66% PBTx、100% PBTx、100% PBTx（此为PBTx第一次重复）、100% PBTx（此为PBTx第二次重复）。
4. 吸除最后一次PBTx洗涤液。加入0.5 ml含10% NGS的PBTx溶液，在室温下轻轻振荡孵育至少1小时，然后吸除并弃去溶液。
5. 将一抗用10% NGS/PBTx溶液稀释后配制。若进行共免疫染色，应先使用亲和力更高的抗体。本研究中使用小鼠抗乙酰化微管蛋白单克隆抗体，按1:500比例稀释。例如，若有10个样本，将6 μl原液抗体与3 ml 10% NGS/PBTx混合，然后将0.3 ml该混合液分别加入各管中。
6. 向每管中加入0.2–0.5 ml稀释后的一抗溶液，确保完全浸没所有胚胎。在室温下避光、轻柔振荡孵育过夜 （O/N）。
7. 次日早晨，在弱光条件下吸除并弃去一抗溶液。加入0.5 ml含2% NGS的PBTx溶液以洗去多余一抗。轻柔振荡5分钟，吸除并弃去溶液，重复此步骤两次。
8. 调暗室内顶灯，将相应荧光标记的二抗用10% NGS/PBTx稀释，确保每种条件至少含有0.5 ml。针对小鼠抗乙酰化微管蛋白一抗，使用绿色荧光标记的山羊抗小鼠IgG抗体，按1:500比例稀释。
9. 在室温下避光、轻柔振荡孵育二抗4小时。此后所有操作均需在弱光下进行，并将样品置于暗盒中或用铝箔包裹以避光孵育。
10. 孵育结束后，在弱光下吸除并弃去二抗溶液。加入0.5 ml含2% NGS的PBTx溶液洗涤。轻柔振荡5分钟，吸除并弃去溶液，重复此步骤两次。
11. 若进行共免疫染色，第二种一抗应来源于与第一种一抗不同的物种。本研究中使用兔抗磷酸化CaMK-II抗体，随后使用红色荧光标记的山羊抗兔IgG二抗进行检测。
12. 将兔抗磷酸化CaMK-II抗体按1:20比例稀释。对每管胚胎样品，先将其悬浮于0.3 ml 10% NGS/PBTx中，再加入15 μl原液抗体。
13. 确保胚胎完全浸没且环境光线昏暗。在室温下避光、轻柔振荡孵育过夜 （O/N）。
14. 次日早晨在弱光下吸除并弃去抗体溶液。加入0.5 ml含2% NGS的PBTx溶液。轻柔振荡5分钟，吸除并弃去溶液，重复此步骤两次。
15. 保持顶灯昏暗，将相应荧光标记的二抗用10% NGS/PBTx稀释至足够量，确保每种条件至少含有0.5 ml。本研究中将红色荧光标记的山羊抗兔IgG二抗（红色通道）按1:500比例稀释。
16. 在室温下避光、轻柔振荡孵育第二种二抗4小时。
17. 本次孵育结束后，在弱光下吸除并弃去二抗溶液。加入0.5 ml PBTx溶液洗涤。轻柔振荡5分钟，吸除并弃去溶液，重复此步骤两次。根据成像需求，将样品保存于PBTx或50%甘油/PBS中。

4. 共聚焦成像与图像处理

1. 安装胚胎以进行成像。将 1 - 5 个胚胎置于载玻片上。在盖玻片主片与载玻片之间，使用盖玻片碎片在腔体两侧构建一个腔室。通常使用四个 #1 盖玻片堆叠作为间隔垫片，无需封固。
   注意：无需使用封片介质。
2. 使用 100X 油浸物镜，通过透射光将单个胚胎调至焦点。关闭透射光，开启共聚焦显微镜。确保相应的激光器（绿色和/或红色）已开启，并启用远程聚焦附件。
3. 启动共聚焦成像程序。在 "采集栏"中选择正确的物镜。在 "XY 基础"栏中，点击 1,024 按钮，将图像尺寸设置为 1,024。
4. 在 "激光与探测器"栏中，点击红色 488 框和绿色 568 框，以开启每个通道的激光器和探测器。将针孔设置为中等，并在每个通道的 "增益"栏中调节增益以实现可视化。
5. 在 "采集设置"栏中，点击 "实时"以开始采集图像。在 "视图设置"栏中，取消勾选 "强制整数缩放"选项，以便在 "实时"窗口中居中显示。
6. 在 "采集设置"栏的 "Z"选项卡下，逐层扫描图像。在选定要包含在图像中的光学切片数量后，移动至 z 平面的某个 "中心"位置。
7. 在 "Z"选项卡下，点击标有 "参考"的小红框，这将使 RFA 在选定的 "中心"位置归零。在标为 "步进尺寸"的框中，选择层厚（理想范围为 0.25 µm 至 2.0 µm）。注意 "文件大小"框，尽量将文件大小控制在 1GB 以内。
   注意：通常获取 40 层以内的 0.5 - 1.0 μm 光学切片，但切片数量可根据实验经验确定。
8. 为确定图像的最顶端，点击 "顶部"旁的圆形按钮，并逐层扫描 z 层。然后点击 "底部"旁的圆形按钮，计算机会将图像返回至以中心为基准的层。再次逐层扫描，以确定图像的最底端。
9. 再次点击 "实时"按钮，位于 "采集设置"框中，以停止激光采集。在此面板中，点击标有“平均”和“Z 叠加”的红色框，这些框将变为绿色。
10. 在 "采集设置"框中，点击 "单次"以采集完整的图像序列。您可监控其在两个通道及整个 z 叠加过程中的扫描进度。
11. 为保存图像，点击体积窗口，然后点击 "另存为"并命名文件。将文件保存为 ".ids" 格式。若要在 z 叠加仍打开时对文件进行体积渲染，请选择“数据”下拉菜单并点击 "体积渲染"。将渲染后的文件保存为 tiff 格式。此即本出版物中展示的投影图像。

结果

可视化磷酸化表位的最佳条件

与通过mRNA原位杂交定位基因表达的方法相比，描述斑马鱼胚胎中蛋白质表位免疫定位的技术相对较少 原位 杂交。用于定位斑马鱼胚胎纤毛细胞中蛋白质表位的固定剂包括4% PFA/PBS和Dent's固定剂，后者是甲醇与DMSO的混合物。¹⁹ 整体样本中RNA的定位 原位 杂交（WISH）通常使用多聚甲醛（PFA）固定后，保存在100%甲醇中。^20,21 我们的研究发现，当甲醇处理时间控制在2至7天时，WISH固定剂组合在使用P-CaMK-II抗体进行免疫定位方面显著优于其他任何固定剂。与单独使用Dent固定剂、4% PFA/PBS或甲醇相比，该PFA/甲醇组合所产生的信号强度也明显更强，具体效果取决于胚胎的发育时期及组织位置。

讨论

本实验室开发了PFA/甲醇法，主要目的是优化斑马鱼发育过程中磷酸化T²⁸⁷-CaMK-II表位的免疫定位。该方法成功实现了P-CaMK-II在多个纤毛器官形成过程中的定位，包括斑马鱼的Kupffer's vesicle（KV）¹²、内耳¹⁴和肾脏¹³。尤其是在KV阶段，该技术的应用十分必要。该方法的成功可能归因于以下几个因素的综合作用：a）自发荧光的最小化，b）磷酸化CaMK-II表位的保存，以及c）抗体对表位可及性的增强。

该方法的一个主要局限在于甲醇中的储存时间。虽然P-CaMK-II在-20°C的甲醇中保存两天后免疫反应性达到最高，但在甲醇中储存一周后，该表位的反应性即会丧失。目前尚不清楚此时是磷酸基团发生了水解，还是进一步的变性导致免疫反应性下降。甲醇/EGTA在-20°C下传统上被用作快速固定剂，以在早期胚胎发育过程中保存富含微管蛋白的结构。²² 然而，单独使用甲醇并不适合保存形态结构，甚至也不适合保存肌动蛋白细胞骨架等结构，因此必须先使用PFA进行固定。

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材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
1-苯基-2-硫脲（PTU）	Sigma	P-7629	0.12% 储存液。在系统水中按1:40稀释
Alexa488 抗小鼠 IgG	Life Technologies	A11001	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
Alexa488 抗兔 IgG	Life Technologies	A11008	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
Alexa488 鬼笔环肽	Life Technologies	A12379	优先结合F-肌动蛋白
Alexa568 抗小鼠 IgG	Life Technologies	A11004	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
Alexa568 抗兔 IgG	Life Technologies	A11011	山羊多克隆抗体，使用比例为1:500
抗乙酰化α-微管蛋白	Sigma	T7451	小鼠单克隆抗体，使用比例为1:500
抗磷酸化-T287 CaMK-II	EMD Millipore	06-881	兔多克隆抗体，使用比例为1:20
总CaMK-II抗体	BD Biosciences	611292	小鼠单克隆抗体，使用比例为1:20
乙醇	Fisher	S96857	实验级，95%变性乙醇
镊子	Fine Science Tools	11252-20	Dumont #5
玻璃盖玻片	VWR	16004-330	#1 厚度
玻璃显微镜载玻片	Fisher	12-550-15	标准玻璃载玻片
甲醇	Fisher	A411	储存于冷冻柜中
微量离心管	VWR	20170-038	带盖管，非无菌
正常山羊血清	Life Technologies	16210-064	分装为1 ml管，储存于冷冻柜中
多聚甲醛	Sigma	P-6148	试剂级，结晶状
磷酸盐缓冲液（PBS）	Quality Biological	119-069-131	10x储存液或实验室配制
吐温X-100	Sigma	BP-151	水中配制成10%溶液，室温储存
吐温-20	Life Technologies	85113	水中配制成10%溶液，室温储存
复式显微镜	Nikon	E-600	安装在无振动台面上
C1 Plus双激光扫描共聚焦显微镜	Nikon	C1 Plus	由EZ-C1程序运行，但升级版本使用"Elements"