本方案描述了通过在酶解（内切木聚糖酶）前用2-氨基苯甲酰基标记还原端（RE），然后利用质谱（MS）和核磁共振（NMR）分析产生的寡糖，从而对异木聚糖的还原端及内部区域糖基序列进行结构表征的具体技术。
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本文内容
摘要
摘要
本实验方案描述了用于表征杂合木聚糖还原端（RE）及内部区域糖基序列的特定技术。按照Ratnayake et al.（2014）2所述方法，将脱淀粉的小麦胚乳细胞壁分离为醇不溶性残渣（AIR）1，并依次用水（W-sol Fr）和含1% NaBH4的1 M KOH（KOH-sol Fr）进行连续提取。采用两种不同的方法（见图1中的总结）。第一种方法中，将完整的W-sol AXs用2AB处理，以标记原始的还原端主链糖残基，随后用内切木聚糖酶处理，分别生成带有2AB标记的还原端和内部区域的还原性寡糖混合物。第二种方法中，先用内切木聚糖酶水解KOH-sol Fr，生成寡糖混合物，再用2AB进行标记。从W-sol Fr和KOH-sol Fr中经酶解释放的（已标记或未标记）寡糖随后进行甲基化处理，并结合使用MALDI-TOF-MS、RP-HPLC-ESI-QTOF-MS和ESI-MSn对天然及甲基化后的寡糖进行详细的结构分析。此外，对经内切木聚糖酶消化的KOH-sol AXs还采用核磁共振（NMR）进行表征，以获得有关异头构型的信息。这些技术也可通过使用适当的内切水解酶应用于其他类别的多糖研究。
引言
异源木聚糖是一类多糖，是禾本科植物初生细胞壁以及所有被子植物次生细胞壁中主要的非纤维素多糖3-6。木聚糖骨架上的取代基类型和取代模式因组织类型、发育阶段和物种的不同而有所差异，这些取代基包括糖基类（葡萄糖醛酸（GlcA）、阿拉伯糖（Araf））和非糖基类（O-乙酰基、阿魏酸）残基7。
小麦（Triticum aestivum L.）胚乳细胞壁主要由阿拉伯木聚糖（AXs）（70%）和（1→3）（1→4）-β-D-葡聚糖（20%）组成，纤维素和杂合甘露聚糖含量较少（各占2%）8。木聚糖主链可呈现不同程度的取代状态，主要为未取代、单取代（主要在O-2位，其次为O-3位）以及双取代（O-2和O-3位），取代基为α-L-阿拉伯呋喃糖（Araf ）残基9。双子叶植物（例如拟南芥（Arabidopsis thaliana））10和裸子植物（例如云杉（Picea abies））11来源的杂合木聚糖的还原端（RE）含有一个特征性的四糖糖基序列：-β-D-Xylp-(1→3)-α-L-Rhap-(1→2)-α-D-GalpA-(1→4)-D-Xylp。为了理解杂合木聚糖的生物合成及其功能（生物学和工业应用），完整测定木聚糖主....
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方案
1. 使用2-氨基苯甲酰胺（2AB）标记水溶性阿拉伯木聚糖（W-sol AXs）的还原端糖残基
- 将W-sol AXs与2AB（0.2 M）在1 M NaBH3CN（氰基硼氢化钠）存在下于pH 5.5条件下在65 °C孵育2小时，以将多糖主链的还原端转化为其荧光衍生物。
注意：以下步骤应在通风橱中进行，因为NaBH3CN在接触水时会释放有毒的氰化物气体。- 称取NaBH3CN（62.8 mg），溶于1 ml水中，置于1.5 ml微量离心管中，配制1 M NaBH3CN溶液。将2AB试剂（27.2 mg）溶于1 M NaBH3CN溶液（1 ml）中，在65 °C加热溶解，并用10%乙酸将反应混合物（0.2 M 2AB，1 M NaBH3CN）的pH调节至5.5。
- 在带盖玻璃管中，向W-sol AXs（1 mg）加入200 µl反应混合物（0.2 M 2AB，1 M NaBH3CN），使用涡旋混合器混匀。在通风橱中于65 °C孵育2小时。将悬浮液冷却至室温 ，加入4倍体积的无水乙醇。
- 将悬浮液置于4 °C冰箱中过夜（O/N），以沉淀多糖。
- 离心（1,500 × g，10分钟，室温）去除上清....
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结果
内切木聚糖酶消化2AB标记的W-可溶性AXs，产生一系列2AB标记的还原端（RE）寡糖和一系列未标记（无2AB标记）的来自木聚糖链内部区域的寡糖混合物（图1；来自Ratnayake et al.2）。随后采用一系列色谱方法对这一复杂的异构体混合物进行分级分离。最后利用质谱（MS）技术鉴定异构体结构，并通过MSn技术进行序列分析。本文展示的是该方法的一个代表性而非全面性的示例。
2AB 标记的天然 W-sol AXs 衍生的寡糖在 MALDI-TOF-MS 谱图中（图 2A）显示出一系列丰度很高的准分子离子峰，其 m/z 值分别为 701、833 和 965，代表含有 5–7 个戊糖基残基（P5-7）的未标记中性内部区域寡糖序列。在 m/z 745、877 和 1009.......
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讨论
大多数基质相细胞壁多糖的骨架上似乎随机地连接了糖基和非糖基残基，其结构高度可变，具体取决于植物种类、发育阶段和组织类型3。由于多糖是基因的次级产物，其序列并非由模板决定，因此目前尚无类似于核酸和蛋白质测序的单一分析方法可用于多糖测序。特异性识别糖苷键的水解酶的获得为多糖研究提供了有力工具，可将多糖降解为寡糖，随后通过色谱法进行分离；当与化学和物理技术结合使用时，可实现寡糖的完全测序。接下来的挑战在于如何将这些复杂的混合物重新组装成原始的多糖序列——这一难题至今尚未被成功解决。
本文描述了一种可变顺序应用的方法，该方法结合了已建立的酶法、化学和物理技术，用于表征杂合木聚糖还原端（RE）及内部区域的糖基序列。另一种未在此详述但已被证明对寡糖表征非常有用的技术是PACE（多糖碳水化合物凝胶电泳分析），由Dupree19团队开发，若具备相应设备，可轻松整合到本方案中。此外，液相色谱（LC）的变通方法也可能具有实用性，例如串联在线亲水相互作用色谱（HILIC）后接反相色谱（RP），可在单一步骤中实现未标记/已标记寡糖的分离。该方法依赖于在木聚糖链还.......
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披露
我们无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目得到了联邦科学与工业研究组织旗舰合作研究计划的资金支持，该资金通过食品未来旗舰计划提供给高纤维谷物研究团队。AB 还感谢澳大利亚研究理事会（ARC）对植物细胞壁卓越研究中心（CE110001007）提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2-氨基苯甲酰胺 (2AB) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | A89804 | |
| 硼氢化钠 (NaBH4) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 247677 | 危险品，请小心操作 |
| 氰基硼氢化钠 (NaBH3CN) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 156159 | 危险品，请小心操作 |
| 内切-1,4-β-木聚糖酶 M1（源自绿色木霉）(120101a) | Megazyme (www.megazyme.com) | E-XYTR1 | |
| 重水 (D2O) | Sigma-Aldrich (www.sigmaaldrich.com) | 151882 | |
| 冷冻干燥机 (CHRIST-ALPHA 1-4 LD plus) | |||
| 反相 C18 Zorbax Eclipse Plus 色谱柱 | Agilent | (2.1×100 mm；1.8 µm 填料粒径) | |
| MicroFlex MALDI-TOF 质谱仪 （型号：MicroFlex LR） | (Bruker Daltonics, Germany) | ||
| (ESI) -(QTOF) 质谱仪 （型号 # 6520） | (Agilent, Palo Alto, CA ) | ||
| ESI-MSn -离子阱 （型号 # 1100 HCT） | (Agilent, Palo Alto, CA)。 | ||
| Bruker Avance III 600 MHz 核磁共振波谱仪 | Bruker Daltonics, Germany | ||
| Topspin（版本 3.0）-Biospin- 软件 | Bruker | ||
| 气相色谱-质谱联用仪（GC-MS，型号 # 7890B） | Agilent |
参考文献
- Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., Bacic, A. Determining the polysaccharide composition of plant cell walls. Nature Protocols. 7, 1590-1607 (2012).
- Ratnayake, S., Beahan, C. T., Callahan, D. L., Bacic, A. The reducing end sequence of wheat endosperm cell wall arabinoxyla....
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重印与许可
