为了研究T细胞免疫突触中丝状肌动蛋白的流动速度和方向性，将活细胞超分辨率成像与全内反射荧光技术相结合，并利用时空图像相关光谱法进行定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
丝状肌动蛋白（filamentous-actin）在大多数细胞过程中发挥关键作用，包括细胞运动性，以及在免疫细胞中形成一种重要的细胞间相互作用——免疫突触。人们还推测F-actin在调控细胞膜上的分子分布方面具有作用，包括膜下囊泡动力学和蛋白质聚集。尽管常规光学显微镜技术可实现广义的、受衍射极限限制的观察，但许多细胞和分子事件（如分子聚集和分子流动）发生在远低于常规光学显微镜分辨能力的尺度上。通过将全内反射荧光显微技术与超分辨率成像方法——结构照明显微术（structured illumination microscopy）相结合，研究人员记录了T细胞免疫突触处F-actin的二维分子流动。随后应用了时空图像相关光谱分析法（spatio-temporal image correlation spectroscopy, STICS），该方法可生成可量化的结果，以速度直方图和矢量图的形式反映分子流动的方向性和强度。本实验方案描述了结合超分辨率成像与STICS技术，在亚衍射分辨率水平上生成分子流动矢量的方法。该技术已被用于证实：在T细胞形成免疫突触后，其周边区域存在对称性的、向后且向心的肌动蛋白流动。
引言
本实验的目标是对活体T细胞中丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）的分子流动进行成像和表征，突破衍射极限，以确定在免疫突触（IS）形成过程中F-肌动蛋白流动的方向和强度。该技术将采用结构照明显微镜（SIM），在全内反射荧光（TIRF）模式下进行，对Jurkat T细胞在涂有抗CD3和抗CD28抗体的活化盖玻片上形成人工突触的过程进行成像。免疫突触形成于T细胞与其靶细胞——抗原呈递细胞（APC）之间，由T细胞受体（TCR）激活所触发1,2。由于这是适应性免疫系统决定是否对感染产生免疫应答的第一步，因此对刺激信号响应异常可能导致多种疾病。T细胞与APC之间相互作用的重要性已有充分文献记载，但在初始TCR信号内化后，成熟免疫突触所发挥的作用仍尚未完全阐明。
由于细胞骨架被认为有助于与 TCR 激活相关的两个过程（质膜上分子的移动以及依赖肌动蛋白细胞骨架的信号分子调控3,4 ），了解细胞骨架在空间和时间上的重组方式将有助于阐明免疫突触形成过程中分子重排的各个步骤。F-actin 的向后流动被认为可将 TCR 簇驱赶至免疫突触的中心，这种转位被认为对信号终止和再循环至关重要，有助于维持 T 细胞激活的精细平衡5。
尽管标准荧光显微镜是一种灵活的工具，可为包括细胞间相互作用在内的多种生物学事件提供洞察，但其分辨率受限于系统对距离小于衍射极限的多个荧光团进行准确分辨的能力W....
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方案
注意：第1阶段和第2阶段在成像当天之前完成；确保成像当天或之前使用的所有培养基和添加剂均已平衡。平衡方法是将培养基和添加剂置于设定为5% CO2的培养箱中，升温至37 °C。所有细胞培养操作和盖玻片接种步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。
1. 细胞转染
- 在实验前24小时，使用编码F-actin-GFP荧光融合蛋白的质粒转染待成像的T细胞。注意：为确保细胞处于最佳健康状态并处于对数生长期，应在转染前24小时（即成像前48小时）对细胞进行传代。
- 将5 mL RPMI培养基补充液（RPMI 1640，含10% FBS和1%青霉素-链霉素（可选））加入6孔板的一个孔中，放入培养箱内平衡。
- 将37 °C、5% CO2条件下培养的2 × 107个T细胞用离心管在327 × g下离心5分钟，收集细胞沉淀，并用等体积预热的电穿孔缓冲液洗涤。注意：电穿孔缓冲液为低血清培养基，含有缓冲体系和添加剂（见耗材清单）。
- 再次在327 × g下离心5分钟后，将细胞重悬于500 µL电穿孔缓冲液中，缓慢加入电穿孔杯中，再加入5 µg用于标记F-actin的质粒（溶于PCR级dH2O中）。
- 轻轻敲击电穿孔杯的外壁，确保缓冲液中无气泡残留，以防电击时产生电弧，并使细胞在缓冲液中均匀分布。 <....
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结果
显微镜设置
成功完成所有步骤后，研究人员将实现T细胞突触中F-肌动蛋白流动的结构光照明显微成像（视频1），并利用时空图像相关光谱法对这种分子流动进行了定量分析（图411）。在记录图像之前，应确保样品在九幅原始图像中的照明均匀，并在样品处观察到以莫尔条纹形式呈现的结构照明（图5）；这两者均表明盖玻片在载物台上放置平整，且TIRF-SIM系统已正确对准。
实验过程中应保持激光功率较低（≤10%），以确保细胞尽可能保持健康状态。如果荧光表达水平较低，即使在优化电穿孔步骤后仍不理想，可增加每个原始图像帧的曝光时间（超过所述的50毫秒）和/或提高转换增益设置。由于TIRF-SIM需要9个原始帧（每个重建图像需要9种不同照明方向，每种方向对应一个原始帧），.......
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讨论
该技术将使研究人员能够对表达荧光的细胞中以往无法分辨的细节进行成像和定量分析。我们的结果表明，在T细胞免疫突触（IS）中，F-actin从细胞周边向细胞中心呈对称性流动。这些发现与此前基于一维线轮廓图解数据的研究结果一致13，并进一步将分析能力扩展至二维及超分辨率数据。
当前技术是从走时成像发展而来，后者仅限于通过单条一维直线随时间绘制荧光强度波动。相比之下，本技术能够对整个细胞的分子流动进行定量分析，并提取流动的方向性和速度信息。尽管散斑成像也已展示了二维环境中肌动蛋白的动力学行为14，但散斑成像技术可能受限于标记密度难以优化，且只能可视化肌动蛋白的一个亚群。
要获得这些结果，最重要的步骤是优化研究人员所用特定细胞的转染效率，以及对SIM显微镜的光学系统和光栅图案进行校准。选择正确的子区域大小取决于样本特性，这一点至关重要：若设置过小，相关性分析将丢失快速移动的荧光信号；而若子区域过大，则可能导致超分辨率方法所获取的额外数据中的细微差异丢失。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
D.M.O. 感谢欧洲研究理事会资助编号 337187 以及玛丽·居里职业整合资助编号 334303。P.W.W. 感谢加拿大自然科学与工程研究理事会发现资助项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材： | |||
| Jurkat E6.1 细胞 | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8孔盖玻片 | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP 载体 | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| 抗CD3抗体 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| 抗CD28抗体 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| 镜油 | |||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备： | |||
| Gene Pulsar Xcell 系统 | BioRad | 165-2660 | |
| 电转杯（0.4 cm） | BioRad | 165-2088 | |
| 离心机（5810R） | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| 离心机（Heraeus） | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6孔板 | Corning | 3516 | |
| 载物台培养箱 | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM 显微镜 | Nikon | 联系公司 | |
| Nikon Analyse 软件 | Nikon | 联系公司 | |
| 培养箱（190D） | LEEC | 联系公司 |
参考文献
- Monks, C., Freiberg, B., Kupfer, H., Sciaky, N., Kupfer, A. Three-dimensional segregation of supramolecular activation clusters in T cells. Nature. 395, 82-86 (1998).
- Lanzavecchia, A. Antigen-specific interaction between T and B cells. Nature. 314, 537-539 (1985). <....
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重印与许可
