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布洛芬包封于环糊精纳米海绵水凝胶中的传输特性：质子高分辨魔角旋转核磁共振波谱研究

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DOI：

10.3791/53769

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2016年8月15日

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1Department of Chemistry, Materials and Chemical Engineering "G. Natta", Politecnico di Milano, 2Università degli studi e-Campus, 3ICRM, CNR - Consiglio Nazionale delle Ricerche, 4Elettra Sincrotrone Trieste, 5Department of Chemistry, University of Torino

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

采用脉冲场梯度自旋回波（PGSE）核磁共振技术，研究布洛芬在β-环糊精纳米海绵聚合物网络中的运动行为。本文详细描述了材料的合成、纯化、药物负载、核磁共振脉冲序列的实施以及数据分析过程，以计算药物在多个观测时间点的均方位移。

摘要

β-环糊精（β-CD）与乙二胺四乙酸二酐（EDTA）的化学交联生成了被称为环糊精纳米海绵（CDNSEDTA）的支化聚合物。文中描述了两种不同制备方法，其CD-EDTA摩尔比分别为1:4和1:8。相应的交联聚合物与0.27 M的布洛芬钠盐（IP）水溶液接触后，形成了均匀、无色、载药的水凝胶。

采用高分辨率魔角旋转（HR-MAS）核磁共振（NMR）波谱法对体系进行表征。利用脉冲梯度自旋回波（PGSE）NMR波谱法测定不同观测时间 td 下IP在聚合物凝胶内的均方位移（MSD）。进一步处理数据以研究MSD的时间依赖性：MSD = f(td)。所提出的方法可用于表征溶质在水凝胶内部可能经历的不同扩散模式，即正常扩散或反常扩散。本文报道并讨论了完整的实验方案，包括聚合物的制备与纯化、载药水凝胶的制备、NMR样品的准备、通过HR-MAS NMR波谱法测量MSD，以及最终获得MSD时间依赖性的数据处理过程。所展示的实验具有典型意义，相关数据从一种新颖方法的角度进行讨论，该方法可用于表征药物递送潜在应用中聚合物基质内包封客体分子传输特性的表征。

引言

人们对设计和构建能够通过非共价相互作用包埋具有潜在生物化学活性小分子的高分子体系日益关注。这类材料有望应用于将活性成分运输至特定靶点，并在外源性刺激（如pH变化、温度）作用下实现可控释放。 等等。 在此背景下，水凝胶因其能够实现药物的可控释放，已成为纳米医学中多功能且高效的材料1聚合性水凝胶的形成可通过以下方式实现：i）通过氢键等物理性非共价相互作用连接大分子链；ii）通过共价交联使大分子链形成三维网络结构，该结构可在水溶液中发生溶胀；或iii）上述两种方法的结合。2-4.

一种特别多功能的三维可溶胀聚合物，可用于包封有机和无机物质，可通过天然β-环糊精（β-CD）与适当的四羧酸活化衍生物缩合反应制备5-8，从而得到环糊精纳米海绵（CDNS）。CDNS 的合成、表征及其应用是我们课题组长期研究的主题。近年来的研究结果表明，CDNS 具有显著的溶胀性能、对化学物质的吸附/包合作用以及小分子药物的释放能力，在药物活性成分的可控释放9-11 和环境化学12-14 领域具有广泛应用前景。

基于上述前提，需要解决的两个主要问题涉及活性化合物在聚合物凝胶中的高效载药，以及对溶质在凝胶基质中迁移行为的更深入理解15。文献中既包含关于小分子在大分子网络中扩散机制的实验研究，也提出了相关理论16,17。脉冲场梯度自旋回波（PGSE）核磁共振（NMR）波谱法是一种成熟的结构分析方法，广泛用于研究小分子在溶剂中的平移扩散或纯液体的自扩散18。近年来，高分辨率魔角旋转（HR-MAS）NMR 技术的发展使得在异相悬浮液19、凝胶以及可溶胀聚合物20,21中获取高分辨率的NMR数据成为可能。事实上，将HR-MAS NMR波谱法与PGSE脉冲序列相结合的实验方案，为观察客体分子在主体分子环境中的行为提供了独特的机会。因此，可以获得有关药物分子在凝胶基质中受限状态下传输特性的关键数据。由此获得的高质量实验数据有助于更合理地设计纳米结构的主-客体体系。

在本研究中，我们详细描述了以下步骤的实验方案：i）两种不同配比的环糊精纳米海绵（CDNS）与EDTA聚合物交联产物（图1）的合成与纯化，该材料简称为CDNSEDTA，其环糊精（CD）与交联剂的摩尔比分别为1:4（CDNSEDTA 1:4）和1:8（CDNSEDTA 1:8）；ii）分别制备负载药物的CDNSEDTA 1:4和CDNSEDTA 1:8水凝胶。在此步骤中，我们选用常见的非甾体抗炎药——布洛芬钠盐（IP）作为模型药物分子；iii）利用脉冲梯度自旋回波高分辨魔角旋转核磁共振（PGSE-HRMAS NMR）光谱法，系统研究IP在CDNSEDTA水凝胶中的传输特性。本文提出的方法基于测量药物分子在水凝胶中的均方位移（MSD），并进一步分析MSD随时间的变化关系。

需要强调的是，上述方法侧重于药物在基质中均方位移（MDS）的时间依赖性，与仅基于测定药物扩散系数的传统方法相比，可提供更广泛的信息。我们最近的研究21表明，该方法能够区分限域于CDNS水凝胶中的IP所经历的正常扩散与反常扩散行为。

因此，我们认为，聚合物合成/纯化的逐步描述、载药水凝胶的制备、HR-MAS NMR表征以及MDS数据的数据处理，为致力于表征用于小分子限域与释放的纳米结构体系的科学家提供了一套强大的工具。

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方案

1. CDNSEDTA 聚合物的合成

  1. 使用前将β-环糊精（β-CD）于80 °C烘箱中干燥4小时。使用前将500 ml二甲基亚砜（DMSO）和100 ml三乙胺（Et3N）在分子筛（4 Å）上干燥24小时。
  2. 将25 ml DMSO加入50 ml单颈圆底烧瓶中。在磁力搅拌下，分小份加入5.675 g β-CD（5 mmol），以减少结块的形成。
  3. 约30分钟后，用10 ml刻度移液管向均相溶液中加入6 ml Et3N。在室温下继续搅拌15分钟。将烧瓶浸入室温水浴中。
    注意：β-CD与EDTA的反应为放热反应。因此，将烧瓶浸入水浴中有利于热量交换，避免反应混合物过热。
  4. 在剧烈搅拌下，加入5.124 g（20 mmol，制备CDNSEDTA 1:4）或10.248 g（40 mmol，制备CDNSEDTA 1:8）的EDTA二酸酐。
  5. 反应3小时后，用刮勺将固体物质（CDNSEDTA 1:4或CDNSEDTA 1:8）从烧瓶中取出，并用研钵和研杵粗略研碎。
  6. 在室温下，用丙酮（100 ml × 5次）、0.1 M盐酸（200 ml × 5次）和去离子水（200 ml × 3次）将固体物质洗涤至滤纸上。
  7. 最后，将所有固体物质在室温下空气中干燥48小时，用研钵和研杵精细研磨，然后在45 °C下真空干燥（< 15 mbar）2小时。

figure-protocol-1
图1：CDNSEDTA聚合物的示意图。 示意图显示合成路线。左侧：单体β-环糊精（β-CD）和交联剂EDTA二酸酐的分子结构。箭头上方为整体反应条件。右侧：交联聚合物的示意图。请点击此处查看此图的放大版本。

2. 高分辨魔角旋转核磁共振测量

  1. HR-MAS NMR 样品制备
    1. 在氘代水（99.8%）中配制浓度为 0.27 M 的布洛芬钠盐（IP）溶液。
    2. 向 150 µl 上述第 2.1.1 步配制的溶液中加入 20 mg CDNSEDTA 1:4 和 2 mg 无水碳酸钠（Na2CO3），置于 2 ml 玻璃小瓶中。用小刮勺搅拌瓶内内容物以使其均匀混合。此步骤制备的凝胶需静置 2 小时后方可使用。对 CDNSEDTA 1:8 聚合物重复此步骤。
    3. 使用小刮勺将凝胶转移至适用于 HR-MAS NMR 实验的 5 mm NMR 转子中。所用凝胶总量取决于转子的内部体积（推荐用量为 12 μl）。
  2. HR-MAS 1H NMR 实验
    1. 设置以下仪器参数：在 MAS 气动控制单元上设定转子转速为 4 KHz，在变温单元中设定样品温度为 305 K。
    2. 采用常规单脉冲序列，在质子共振频率下采集布洛芬在 CDNSEDTA（1:4）和 CDNSEDTA（1:8）聚合物体系中的 1H HR-MAS NMR 谱图。
      1. 创建新的数据集。点击“AcquPars”选项卡，选择脉冲程序（PULPROG）：zg。
      2. 设置扫描次数（NS = 4）及扫描间延迟时间（D1 = 5 sec）。设定谱宽（SW = 8 ppm）、时域数据点数（TD = 16K）和接收增益（RG = 32）。
      3. 在控制台输入“zg”，屏幕上将显示自由感应衰减（FID）信号。处理数据时，点击“ProcPars”选项卡，设置谱图数据点数（SI = 32K）、指数乘法窗函数（WDW = EM）和线宽展宽（LB = 1）。输入“ft”执行傅里叶变换，使用屏幕上的相位调节功能对谱图进行相位校正，获得高分辨率且峰形分离良好的谱图。

figure-protocol-2
图2：双极脉冲对纵向涡流延迟（BPPLED）脉冲序列。 用于执行PFGSE实验的脉冲序列示意图。90°脉冲的相位循环为：P1: (0)16，P2: (0022)4，P3: (0)4 (2)4 (1)4 (3)4，P4: (0202 2020 1313 3131)，P5: (0)4 (2)4 (1)4 (3)4。180°脉冲为 +x 方向。（修改自参考文献18） 请点击此处查看此图的放大版本。

  1. HR-MAS 1H NMR PGSE 实验
    注意：PGSE 实验采用 BPPLED 脉冲序列18，如图 2所示。这是一种伪二维实验，其间接维中的梯度呈线性递增，从 2% 增加至 100%。信号强度的衰减取决于扩散时间 Δ 和梯度脉冲 δ。在正确运行 PGSE 实验之前，必须对这些参数进行优化。参数优化通过执行若干次一维测量来完成，其中 Δ 保持恒定，而 δ 进行变化。
    1. 参数优化
      1. 创建一个新的数据集——实验编号 1。点击“AcquPars”选项卡。选择脉冲程序 PULPROG：ledbpgp2s1d，即用于扩散优化的一维脉冲序列。
      2. 选择扫描次数（NS = 16）以及扫描间的时间延迟（D1 = 10 秒）。设置谱宽（SW = 8 ppm）、时域（TD = 16K）和接收增益（RG = 32）。
      3. 将 Δ（序列中的 D20）设为一个恒定值，将 δ（p30）设为一个试验值。起始值设为 Δ = 50 毫秒，δ = 3 毫秒（高分辨率仪器允许的最大值）。
      4. 从1H 实验中读取谱频率（SFO1）的值，并使用该值。将 GPZ6 梯度强度设为 2%。重复步骤 2.2.2.3。将此谱用作优化的参考谱。
      5. 在同一数据集中创建实验编号 2。观察所有实验参数。将 GPZ6 梯度强度增加至 95%。重复步骤 2.2.2.3。使用双显示图标将此谱与参考谱进行比较，并观察信号强度的变化。
        注意：一个良好衰减的谱其残余信号强度应约为参考谱的 5%。如果信号强度完全消失，则减小 δ 的值，并从步骤 2.3.1.3 开始重复 2.3.1 节的流程，直到找到合适的 δ 值。
      6. 对全部五个 Δ 值重复 2.3.1 节中的参数优化流程。
        注意：选择五个 Δ 值：50、80、110、140 和 170 毫秒，并将对应的 δ 优化为 3、2.7、2.4、2.1、1.8 毫秒（用于 CDNSEDTA 1:8 中的 IP）以及 δ 优化为 2.7、2.4、2、1.7、1.4 毫秒（用于 CDNSEDTA 1:4 中的 IP）。
    2. 二维扩散数据集的采集
      1. 在同一数据集中创建实验编号 3，所有一维实验参数将被加载。输入“eda”。选择脉冲程序 PULPROG：ledbpgp2s，即二维脉冲序列，并将 parmode 更改为 2D。
      2. 设置 FnMODE=QF。将 F2 维的时域 TD 设为 32，即梯度步数。所有其他参数均已正确设置。输入“DOSY”，梯度斜坡将被生成并存储在一个文件中。斜坡的起始值和终止值（2 - 95）作为输入参数给出。现在开始采集。
  2. 数据处理
    1. 输入“xf2”以执行 F2 维的傅里叶变换。输入“abs2”以对 F2 维进行基线校正。输入“setdiffparm”以调用实验参数（Δ、δ 和梯度列表），用于下一步处理。
    2. 在分析选项卡中点击“T1/T2 弛豫模块”，并使用二维实验的第一张谱图定义拟合峰。定义峰范围并执行拟合，从而获得每个施加梯度步长下的信号强度。
      注意：对于每个 Δ 值，信号强度 I(q, td) 依赖于实验变量：施加的脉冲场梯度（g）、时间变量（δ）和磁旋比（γ），其中 q = (γgδ)，关系如下方程所示：
      figure-protocol-3
      其中分子的均方位移 MSD = z2。
    3. 将信号强度导出至电子表格，并对数据进行线性拟合，以获得每个观测扩散时间 td 对应的 z2 值。
      注意：MSD 值与观测时间 td 的关系如下：figure-protocol-4
    4. 对每个实验 td 值，绘制 z2 与 td 的对数-对数图。指数 α 的值即为线性回归的斜率。关于上述方程物理意义的更详尽讨论，可参见文献 21 及其中引用的参考文献。
      注意：根据指数 α 的取值，扩散模式定义如下：i) 当 α = 1 时为各向同性无限制扩散，ii) 当 0 < α < 1 时为反常亚扩散模式，iii) 当 α > 1 时为反常超扩散模式。

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结果

我们首先将该方法应用于溶于水溶液中的IP药物分子，以验证该方法的可行性。代表性结果的完整描述可参见文献21。本文则重点讨论方法学层面以及数据采集与数据分析的具体操作。根据第2.4节，图3以半对数坐标显示了归一化的实验信号衰减I(q, td)/I(0, td)随q2的变化关系。在表1中列出了每个扩散时间Δ所观测到的均方位移（MSD）值。z2与td的双对数图（图3）得到一条R2= 0.999的直线（根据第2.4节）。对于溶于D2O溶液中的IP分子，在0.27 M浓度下获得的标度指数α = 1，表明其在液体溶液中呈现高斯运动。仅在此情况下，可据此计算出自扩散系数D= 4.1×10-10 m2sec-1

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讨论

我们提出一种实验方法，用于确定小分子药物在两种典型CDNSEDTA水凝胶配方中的扩散模式。高分辨率魔角旋转脉冲梯度自旋回波核磁共振（HR-MAS PGSE NMR）技术可用于测定小分子在特定扩散时间（几毫秒至秒级）内的均方位移，从而监测微米尺度的距离变化。在所观察的时间范围（50–170毫秒）内，每个研究体系仅表现出一种类型的运动。然而需要强调的是，在更长的观测时间内，可观察到不同扩散模式之间的转变22。因此，本文报告的结果受限于实验所用设备的硬件条件及我们现有仪器所决定的时间尺度。

针对本工作的每个步骤——聚合物合成、水凝胶负载、HR-MAS NMR 数据采集与处理，我们在此列出三个主要问题及相应的解决方案。

纯化
根据步骤1.6所述方法对材料进行纯化，可有效去除反应产物中可能残留的DMSO、Et3N以及未反应的EDTA。特别是，使用0.1 M HCl水溶液洗涤可完全去除Et3N。仅用丙酮洗涤材料则无法有效实现此目...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者们衷心感谢 PRIN 2010-2011 NANOMED 项目（编号 2010 FPTBSH）和 PRIN 2010-2011 PROxy 项目（编号 2010PFLRJR_005）提供的资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
高分辨率魔角旋转探头BRUKERN/A用于半固体样品核磁共振测量的探头
核磁共振波谱仪BRUKERDRX 500适用于液体和半固体状态的傅里叶变换核磁共振波谱仪
β-环糊精（β-CD）Alfa-AesarJ63161试剂
乙二胺四乙酸二酸酐（EDTA 二酸酐）Sigma-Aldrich332046试剂
二甲基亚砜（DMSO）Alfa-AesarD0798溶剂
三乙胺Sigma-Aldrich471283碱（试剂）
布洛芬（IP）钠盐Sigma-AldrichI1892抗炎药物
Excel 2010MicrosoftN/A用于数据分析的电子表格软件
Origin 8 SR0OriginLab Co.用于数据分析的电子表格软件

参考文献

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