从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

摘要

本方案描述了一种通过酶消化、密度梯度分离、贴壁筛选以及CD146⁺磁珠分选技术，从大鼠中分离获取原代肺组织驻留型间充质基质细胞的方法。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）因其在包括肺部疾病在内的多种疾病中所展现的治疗潜力而日益受到关注。除了利用骨髓和脐带来源的MSCs进行外源性细胞治疗外，人们对组织原位MSCs的修复与再生潜能也愈发重视。此外，这类细胞可能参与正常器官发育过程，并被认为在疾病发生中发挥作用，尤其是具有纤维化特征的疾病。目前研究这些组织原位MSCs的主要障碍在于缺乏明确的标志物用于细胞的分离与鉴定。本文所述的分离技术基于肺组织原位MSCs（L-MSCs）的多个特性。在处死大鼠后，取出肺组织并反复冲洗以去除血液。随后使用手术刀进行机械解离，并加入Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶和Ⅰ型DNase混合酶液消化2–3小时。所得单细胞悬液经洗涤后，叠加于密度梯度介质（密度1.073 g/ml）上。离心后收集界面层细胞，洗涤并接种于经培养处理的培养瓶中。细胞在生理氧浓度5% O₂条件下培养4–7天₂，5% CO₂₂ 条件。为了耗竭成纤维细胞（CD146^-) 并确保仅含有L-MSCs群体（CD146⁺），CD146阳性筛选⁺ 通过磁珠分选实现细胞分离。总之，该方法可稳定地获得一群原代L-MSCs，用于后续研究 体外 研究与操作。由于该方案的特性，可轻松推广至其他实验动物模型。

引言

间充质基质细胞（MSCs）因其在包括肺部疾病在内的多种疾病中所展现出的治疗潜力而日益受到关注。除了利用骨髓和脐带来源的MSCs进行外源性细胞治疗外，人们对组织驻留型MSCs的修复与再生潜能也愈发重视。在发育过程中，包括肺部的发育，间充质是发育信号的重要来源，而驻留的MSCs很可能是这一过程的核心参与者。此外，越来越多的证据表明，驻留型MSCs在成人疾病（包括癌症）中也发生了功能紊乱。^1,2 和纤维化³研究这些组织驻留型MSCs的主要障碍在于缺乏用于分离和鉴定这些细胞的明确标志物。⁴干细胞抗原-1（Sca-1）在小鼠中被鉴定为多种组织干细胞的标志物，可用于L-MSCs的分离。⁵，但在其他物种中遗憾地没有已知的直系同源物⁶研究人员已报道了多种从肺组织或肺液中分离L-MSCs的方法，这些方法包括基于荧光激活细胞分选（FACS）的技术，通过筛选CD31阴性细胞进行分离^-/CD45^-/CD90⁺ 细胞⁷，CD31^-/CD45^-上皮细胞黏附分子（EpCAM）/Sca-1+ 细胞⁸多药耐药转运蛋白ATP结合盒G（ABCG2）阳性细胞⁹ 或 Hoechst 33342 染料外排¹⁰，通过塑料粘附性^11,12 以及从剪碎组织....

方案

所有实验程序均经渥太华大学动物护理委员会批准（动物伦理协议编号 OHRI-1696）。动物护理均按照机构指南进行。

1. 肺间充质基质细胞的分离

1. 在50 ml离心管中配制酶混合液：称取30 U中性蛋白酶、2,500 U I型胶原酶和500 U I型DNase。此用量适用于一只成年小鼠或幼鼠的肺组织。在分离当天配制，并于4 ℃保存 °C，直至使用。
2. 在第13天通过腹腔注射戊巴比妥钠（0.2 ml，65 mg/ml）处死新生大鼠。通过脚趾夹捏反射确认意识丧失。通过打开胸腔（如下所述）确认动物死亡。
3. 用70%乙醇喷洒动物体表以消毒，然后使用手术剪从膈肌开始沿头侧方向小心剪开肋骨，注意避免损伤肺组织。使用止血钳撑开肋骨，或选择性地切除肋骨以暴露胸腔。
4. 通过取出心脏使动物失血致死。取出心脏时，用小镊子夹住胸腺和心脏，用手术剪将其剪除。随后立即用纱布吸干血液，直至离断的主动脉和肺动脉不再有血液流出。
5. 用小镊子夹住气管，用手术剪在头侧切断气管，将肺从胸腔中取出。在轻柔地将肺组织拉出胸腔的同时，沿肋骨切断背侧的结缔组织，以游离肺组织。
6. 用手术剪沿膈肌剪断肺与主动脉及食管的连接。肺完全游离出胸腔后，用纱布轻轻去除残留的血液。
7. 用手术剪剪除气管和支气管，并将肺叶小心转移至含有35 ml冷的30%柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤（CPDA-1）抗....

结果

间充质干细胞（MSCs）最可靠的两个物理特性——密度和贴壁性——在本实验方案的第一部分被用于获取含有肺间充质基质细胞（L-MSCs）的肺间质细胞组分。尽管密度梯度界面层中除肺间质细胞外还包含单核细胞和巨噬细胞，但经过后续的贴壁培养以及3-5天的培养，可确保仅保留肺间质细胞。事实上，该细胞群体表达典型的MSC表面标志物CD73、CD90和CD146，且对CD34、CD45、主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）-RT1B、CD11b和CD79a呈阴性，表明该细胞群体中已无白细胞残留（图2A）。值得注意的是，在CD146⁺亚群中，有44.4%-65.7%的细胞同时表达CD73⁺和CD90⁺（数据未显示）。此外，该细胞群体具有较高的集落形成单位（CFU）效率，约为30%，显著高于通常报道的骨髓MSCs或其他类型MSCs的CFU效率，并能向三种典型的MSC谱系分化（图2C）（图2B）。

讨论

原代肺间充质干细胞（L-MSCs）的分离与培养为深入理解其细胞水平上的功能、与其他细胞群体的相互作用，以及其在肺发育、健康与疾病中的作用提供了重要契机。这一点尤为重要，因为目前尚缺乏针对这些细胞的特异性单一标志物，使得对它们的研究几乎难以开展。 原位与所有原代细胞群体一样，需要注意的是，这些细胞在培养中保存的时间越长，其特性越有可能发生变化¹⁹ （综述见于²⁴)。为了使L-MSCs尽可能保持在其自然状态，必须在5% O₂条件下进行培养，这一点至关重要。₂，5% CO₂₂，在37 °C的加湿培养箱中。在呼吸生理学中，通常认为根据道尔顿分压定律，环境空气中的氧分压（21% O₂）₂）为160 mmHg，在肺泡腔内降至约101 mmHg^25-27在成熟的肺中，肺泡-动脉血氧分压差（PaO₂）₂ 梯度约为3-4 mmHg，但在肺部疾病或肺发育不成熟的情况下，由于肺泡-动脉距离增加，该梯度可能显著升高^25,28在体内，间充质微环境通常暴露于2-8%的氧浓度.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
中性蛋白酶	沃辛顿生物化学公司	LS02104	在分离当天配制，并于4℃保存 °C，直至使用
胶原酶 I	沃辛顿生化公司	LS004196	在分离当天配制，并于4℃保存 °C，直至使用
DNA酶I	Sigma-Aldrich	D5025	在分离当天配制，并于4℃保存 °C，直至使用
戊巴比妥钠（Euthanyl）	Bimeda-MTC Animal Health Inc，爱尔兰都柏林	-	对于体重在20-30克之间的大鼠幼崽，使用0.2毫升；体型较大的动物可能需要更多。
杜尔贝科’s PBS + 丙酮酸钠 + 葡萄糖	Life Technologies	14287-072	使用这种D-PBS至关重要，因为其中含有的钙和镁可促进酶解消化过程
Ficoll-Paque PREMIUM（1.073 g/cm³）3)	GE Healthcare	17-5446-52	密度梯度介质。为了获得良好的界面层，单细胞悬液的铺层操作必须在 >45° 以极低速度离心，随后在19 °C.
αMEM	Sigma-Aldrich	M8042	37℃预热 °使用前将水浴箱预热至 C
200 mM L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030-164
100x 抗生素-抗真菌剂	Life Technologies	15240-062	青霉素/链霉素/制霉菌素
M-280 Dynabeads	Life Technologies	11205D	磁珠
生物素标记的多克隆兔抗小鼠IgG	Dako，安捷伦科技	E0464	与下述抗大鼠CD146抗体相匹配的生物素标记二抗
DynaMag5 磁铁	Life Technologies	12303D	推荐用于Dynabeads的磁铁。注意：应根据制造商建议选择磁铁’根据所选磁珠的使用说明进行操作。
TrypLE express	Life Technologies	12605-028	温和的非胰蛋白酶替代试剂，使用 1 ml TrypLE express/25 cm²2 表面积。消化后，10 ml L-MSC培养基足以灭活3 ml TrypLE
抗大鼠CD146抗体	Lifespan Biosciences Inc.	C35841	12.5 μ升每0.5 × 106 细胞
戊淀粉（戊淀粉溶液）	百时美施贵宝加拿大公司	-	可通过当地献血服务机构或血液科获取。或者，可将PSI 20%戊淀粉溶液（Preservation Solutions，PST001）用0.9% NaCl按1:1比例稀释后使用。
Mr. Frosty 冻存盒	赛默飞世尔科技	5100-0001	提高L-MSCs在-80℃过夜冻存时的存活率 °C