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方法文章

从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞

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⸱

DOI：

10.3791/53782

⸱

2016年6月17日

 ,  , 
1Sinclair Centre for Regenerative Medicine, Ottawa Hospital Research Institute, 2University of Ottawa, 3Department of Neonatology and Pediatric Critical Care Medicine, Medical Faculty and University Hospital Carl Gustav Carus, Technische Universität Dresden, 4DFG Research Center and Cluster of Excellence for Regenerative Therapies (CRTD), Technische Universität, Dresden, 5Children's Hospital of Eastern Ontario Research Institute

本文内容

摘要

本方案描述了一种通过酶消化、密度梯度分离、贴壁筛选以及CD146+磁珠分选技术，从大鼠中分离获取原代肺组织驻留型间充质基质细胞的方法。

摘要

间充质基质细胞（MSCs）因其在包括肺部疾病在内的多种疾病中所展现的治疗潜力而日益受到关注。除了利用骨髓和脐带来源的MSCs进行外源性细胞治疗外，人们对组织原位MSCs的修复与再生潜能也愈发重视。此外，这类细胞可能参与正常器官发育过程，并被认为在疾病发生中发挥作用，尤其是具有纤维化特征的疾病。目前研究这些组织原位MSCs的主要障碍在于缺乏明确的标志物用于细胞的分离与鉴定。本文所述的分离技术基于肺组织原位MSCs（L-MSCs）的多个特性。在处死大鼠后，取出肺组织并反复冲洗以去除血液。随后使用手术刀进行机械解离，并加入Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶和Ⅰ型DNase混合酶液消化2–3小时。所得单细胞悬液经洗涤后，叠加于密度梯度介质（密度1.073 g/ml）上。离心后收集界面层细胞，洗涤并接种于经培养处理的培养瓶中。细胞在生理氧浓度5% O₂条件下培养4–7天2，5% CO₂2 条件。为了耗竭成纤维细胞（CD146-) 并确保仅含有L-MSCs群体（CD146+），CD146阳性筛选+ 通过磁珠分选实现细胞分离。总之，该方法可稳定地获得一群原代L-MSCs，用于后续研究 体外 研究与操作。由于该方案的特性，可轻松推广至其他实验动物模型。

引言

间充质基质细胞（MSCs）因其在包括肺部疾病在内的多种疾病中所展现出的治疗潜力而日益受到关注。除了利用骨髓和脐带来源的MSCs进行外源性细胞治疗外，人们对组织驻留型MSCs的修复与再生潜能也愈发重视。在发育过程中，包括肺部的发育，间充质是发育信号的重要来源，而驻留的MSCs很可能是这一过程的核心参与者。此外，越来越多的证据表明，驻留型MSCs在成人疾病（包括癌症）中也发生了功能紊乱。1,2 和纤维化3研究这些组织驻留型MSCs的主要障碍在于缺乏用于分离和鉴定这些细胞的明确标志物。4干细胞抗原-1（Sca-1）在小鼠中被鉴定为多种组织干细胞的标志物，可用于L-MSCs的分离。5，但在其他物种中遗憾地没有已知的直系同源物6研究人员已报道了多种从肺组织或肺液中分离L-MSCs的方法，这些方法包括基于荧光激活细胞分选（FACS）的技术，通过筛选CD31阴性细胞进行分离-/CD45-/CD90+ 细胞7，CD31-/CD45-上皮细胞黏附分子（EpCAM）/Sca-1+ 细胞8多药耐药转运蛋白ATP结合盒G（ABCG2）阳性细胞9 或 Hoechst 33342 染料外排10，通过塑料粘附性11,12 以及从剪碎组织中的迁移13.

本文所介绍方法的优势是多方面的。通过采用温和的酶消化法和密度梯度14，可获得包含间充质干细胞（MSCs）但排除上皮细胞或内皮细胞的所有密度范围内的细胞。后续的贴壁培养步骤可确保仅有间充质细胞贴壁并继续生长，从而去除白细胞。然而最重要的是，CD146+ 筛选步骤可消除成纤维细胞，因为这些细胞不表达CD146。细胞黏附分子CD146的表达与多向分化潜能呈正相关，因此是剔除间充质细胞群体中成纤维细胞的良好标志物。15-19这一点优于使用CD90作为筛选标志物，因为CD90不仅在间充质干细胞（MSCs）中表达，也在脂成纤维细胞中表达。5,20在本方案中，我们明确选择了磁珠分选方法，因其对细胞更为温和，且整个操作可在无菌条件下完成。与组织块贴壁法相比，该分离方法的另一重要优势在于耗时较短，仅需6–10天，而组织块贴壁法则需一个月或更长时间。初次分离后3至5天，间充质细胞群体即可用于CD146检测。+ 筛选；再经过三到五天后，CD146+ 细胞已准备好用于实验，或可冷冻以备后续使用。缩短培养时间有助于提高细胞质量，因为间充质干细胞（MSCs）在长期培养中会转分化为成纤维细胞。 离体 培养19最后，由于该实验方案的特性，只需选择适当的抗体，即可将此方法应用于其他物种；甚至通过调整消化酶的种类和孵育时间，还可将其拓展至其他器官系统。

下文提供了该分离方法的详细方案，CD146+ 亚群的分离及后续筛选流程的示意图分别见图1A和1B。此外，还包括这些细胞的传代、冻存和复苏操作的详细步骤。

肺细胞分离与标记过程；示意图显示了消化、密度梯度和磁性分离步骤。
图1. 肺间质细胞分离的示意图（A）及后续CD146+细胞筛选（B）。 min = 分钟；EDTA = 乙二胺四乙酸；2nd Ab = 二抗；α-CD146 Ab = 抗CD146一抗；-ve cells = CD146阴性细胞；+ve cells = CD146阳性细胞。 请点击此处查看此图的放大版本。

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方案

所有实验程序均经渥太华大学动物护理委员会批准（动物伦理协议编号 OHRI-1696）。动物护理均按照机构指南进行。

1. 肺间充质基质细胞的分离

  1. 在50 ml离心管中配制酶混合液：称取30 U中性蛋白酶、2,500 U I型胶原酶和500 U I型DNase。此用量适用于一只成年小鼠或幼鼠的肺组织。在分离当天配制，并于4 ℃保存 °C，直至使用。
  2. 在第13天通过腹腔注射戊巴比妥钠（0.2 ml，65 mg/ml）处死新生大鼠。通过脚趾夹捏反射确认意识丧失。通过打开胸腔（如下所述）确认动物死亡。
  3. 用70%乙醇喷洒动物体表以消毒，然后使用手术剪从膈肌开始沿头侧方向小心剪开肋骨，注意避免损伤肺组织。使用止血钳撑开肋骨，或选择性地切除肋骨以暴露胸腔。
  4. 通过取出心脏使动物失血致死。取出心脏时，用小镊子夹住胸腺和心脏，用手术剪将其剪除。随后立即用纱布吸干血液，直至离断的主动脉和肺动脉不再有血液流出。
  5. 用小镊子夹住气管，用手术剪在头侧切断气管，将肺从胸腔中取出。在轻柔地将肺组织拉出胸腔的同时，沿肋骨切断背侧的结缔组织，以游离肺组织。
  6. 用手术剪沿膈肌剪断肺与主动脉及食管的连接。肺完全游离出胸腔后，用纱布轻轻去除残留的血液。
  7. 用手术剪剪除气管和支气管，并将肺叶小心转移至含有35 ml冷的30%柠檬酸盐-磷酸盐-右旋糖-腺嘌呤（CPDA-1）抗凝剂的50 ml离心管中（每升纯化水中含26.30 g二水合柠檬酸三钠、3.27 g一水合抗坏血酸、2.22 g磷酸二氢钠、31.80 g D-葡萄糖、0.275 g腺嘌呤）2O；使用0.22 μm无菌滤器过滤溶液 µ在磷酸盐缓冲液（PBS）中使用膜滤器（使用前）以去除血液和碎片。
  8. 用30% CPDA-1/PBS冲洗5分钟后，将肺组织转移至含有35 ml无菌磷酸盐缓冲液（PBS）（室温）的新50 ml离心管中，轻轻颠倒混匀以去除柠檬酸盐。随后转移至含有35 ml杜氏磷酸盐缓冲液（含丙酮酸钠和葡萄糖，DPBS++）（室温）的离心管中。每次冲洗步骤约持续5分钟。
    注：DPBS++ 可商业订购，或按如下方法配制21：氯化钙二水合物 132.4 mg，氯化镁六水合物 100 mg，氯化钾（无水）200 mg，磷酸二氢钾（无水）200 mg，氯化钠（无水）8,000 mg，磷酸氢二钠（无水）1,144.5 mg，D-葡萄糖 1000 mg，丙酮酸钠 36 mg，溶于 1 L 纯化 H₂O 中2O，pH 7.3。使用 0.22 μm 滤器无菌过滤该溶液。 µ使用前需经m膜过滤器过滤。
  9. 加入10 ml预热至37℃的DPBS++溶解酶混合物 °C）并轻轻倒置直至溶解。
  10. 将肺组织转移至新的50 ml离心管中，用手术刀在管壁上切碎肺组织，直至充分剪碎。向组织中加入酶混合液（每只成年小鼠/大鼠幼崽肺组织加入10 ml酶混合液），拧紧管盖，于38 °C孵育 °在37 °C水浴中轻轻振荡（可使用恒温混匀仪、摇动水浴箱，或定期手动振荡的水浴箱）。消化时间取决于组织类型：胎儿组织60分钟，幼年/成年组织90–120分钟，纤维化成年组织120–150分钟。
  11. 通过加入200 μL螯合二价阳离子的试剂终止消化反应 µ乙二胺四乙酸（EDTA，0.15 M，pH 7.4）。使用 0.22 微米滤膜对溶液进行无菌过滤 µm 微孔滤膜过滤后使用）。
  12. 加入20 ml含5%胎牛血清（FBS）的PBS，将整个悬液通过100 μm细胞滤网 µ将细胞悬液通过40 μm细胞滤网过滤至新的50 ml离心管中。用10 ml含5% FBS的PBS冲洗离心管和细胞滤网，使总体积达到40 ml。
  13. 在室温下以500 × g离心5分钟。
  14. 移除上清液（沉淀应清晰可见），加入40 ml含5%胎牛血清的磷酸盐缓冲液重悬，重复步骤1.13的离心操作。
  15. 重悬于 4 ml 5% FBS/PBS（室温）中，小心地铺加在 3 ml 密度梯度介质（1.073 g/cm³）上3) 置于15 ml离心管中14为获得良好的界面层，单细胞悬液的分层操作至关重要 >45° 以极低速度旋转。
  16. 900 × g 离心 20 分钟，中等（5/10）加速度，不减速，19 ℃ °C.
  17. 收集位于界面层的细胞，并将其重悬于10 ml无菌PBS中。
  18. 500 × g 条件下离心 5 分钟，21 °C.
  19. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml预热的完全L-MSC培养基中（最低必需培养基Eagle，α改良型（αMEM），每500 ml添加2 mmol L-谷氨酰胺 αMEM，20%（体积/体积）FBS 和 1%（体积/体积）青霉素/链霉素/两性霉素 B
  20. 重复离心步骤 1.18。随后，弃去上清液，并将沉淀重悬于 10 ml 预热的新鲜培养基中。
  21. 使用血细胞计数板或自动细胞计数仪计数细胞，并以较高密度接种，因为此阶段大多数细胞不具有贴壁生长特性。具体接种密度取决于动物种类和年龄。 例如， 成年小鼠肺部的细胞以105 细胞/平方厘米2，而大鼠幼崽肺来源的细胞在接种密度为 1-2 x 104 细胞/平方厘米2. 使用 0.2 ml L-MSC 培养基/cm2.
  22. 在加湿的5% O₂、5% CO₂培养箱中培养肺组织源性间充质基质细胞（L-MSCs）2，5% CO₂2 37℃气氛 °C.
  23. 初次接种后24小时更换培养基，之后每3天更换一次，换液前用PBS洗涤一次。细胞应培养至80-90%融合度，通常需要3-5天，具体时间取决于动物来源。过高的融合度会促进细胞向成纤维细胞分化。

2. CD146+ 肺间充质基质细胞的筛选

  1. 磁珠包被二抗
    1. 以10:1的比例将生物素化二抗包被于磁珠上 µg 二抗/100 µ在无菌条件下，将10 μL磁珠加入无菌的2 mL圆底冻存管中。使用10 µ每0.5 × 10⁶个预期细胞使用1 μL二抗6 细胞，并使用至少100 µl 磁珠和 10 µg 抗体
      注意：不同生产商的磁珠每体积所用抗体比例可能有所不同，请参考所选磁珠生产商的说明书。本实验方案中，请参见表1以了解在方案优化过程中所使用的磁珠和抗体。
    2. 在室温下，以每分钟30转的速度在旋转样品混合器中孵育30分钟。
    3. 将磁珠重悬于1.5 ml无菌的0.1%牛血清白蛋白（BSA）/PBS中，转移至3 ml圆底管（流式细胞术管）。用额外的1.5 ml 0.1% BSA/PBS冲洗冻存管，并将冲洗液转移至该3 ml管中。
    4. 将试管置于合适的磁铁上，静置2分钟，直至所有磁珠吸附至试管后壁且溶液保持澄清。弃去上清液，并用3 ml 0.1% BSA/PBS重复洗涤两次。
    5. 将磁珠重悬于 3 ml 0.1% BSA/PBS 中，4 ℃ 保存 °C，避光保存，5 天内使用。
  2. CD146标记+ 肺组织驻留间充质基质细胞
    1. 用温和的非胰酶溶液在 PBS 冲洗后收获间充质细胞。
      注意：体积取决于培养瓶的大小（0.2 ml/cm²）2 培养基或磷酸盐缓冲液（PBS）
      1. 移除培养基，并用无菌 PBS 洗涤细胞三次。
      2. 加入适量的温和非胰蛋白酶溶液（参见 表1）。在37℃孵育 °在培养箱中孵育至细胞脱落，约10分钟 使用该溶液时 表1.
      3. 通过加入L-MSC培养基灭活酶，随后在500 × g条件下离心5分钟。
    2. 移除上清液，用0.1% BSA/PBS重悬细胞，并使用血细胞计数板或自动细胞计数仪对细胞进行计数。
      注意：0.1% BSA/PBS 的体积取决于培养 flask 的大小：使用 5 或 10 ml 0.1% BSA/PBS。
    3. 重复步骤 2.2.2，将指定数量的细胞重悬于 3 ml 0.1% BSA/PBS 中（用于阻断非特异性结合位点并维持细胞活性）。将细胞置于冰上保存。
    4. 在3 ml圆底试管中加入CD146一抗，并置于冰上保存。
      注意：添加至指定数量细胞中的初级抗体浓度取决于所使用的抗体。有关推荐的抗大鼠 CD146 抗体，请参见 表1.
    5. 将步骤 2.2.3 中的全部细胞体积加入含有初级抗体的离心管中。盖紧管盖，孵育 30 分钟 在4℃、15 rpm的旋转样品混合器上 °C.
    6. 以 500 × g 离心 5 分钟，4 °C °C，移除上清液，将细胞沉淀重悬于 3 ml 0.1% BSA/PBS 中，重复离心步骤。
    7. 将细胞重悬于根据第2.1节说明制备的3 ml含二抗包被磁珠的溶液中，在15 rpm转速下于旋转样品混合器中4℃孵育30分钟 °C.
  3. CD146筛选+ 肺组织源性间充质基质细胞
    1. 将含有标记CD146的试管置于+ 磁铁上的L-MSCs。阳性细胞将被吸附至管壁后侧。保持管子不动且不触碰磁珠，用无菌巴斯德吸管缓慢吸走上层含有阴性细胞的上清液（根据实验设计，可选择收集或弃去）。
    2. 从磁铁上取下试管，用 3 ml 10% BSA/PBS 重悬细胞。重复步骤 2.3.1 中所述的分选程序四次（Σ 5 个筛选步骤。
    3. 重悬 CD146+ 将L-MSCs置于预热的L-MSC培养基中，并放回磁铁上。
    4. 移除上清液，用L-MSC培养基重悬细胞，并接种于适当大小的培养瓶中（0.2 ml/cm²）2）。作为经验法则，应将细胞接种于与磁珠分选前传代时相同规格的培养瓶中。CD146阳性细胞的数量+ L-MSCs 的数量以及因此的铺板密度取决于供体动物的年龄、物种和品系。铺板密度应始终控制在约 5,000 个细胞/cm²。2.
      注意：磁珠不会干扰细胞生长，并会随着细胞增殖逐渐消失。

3. 冻存细胞

  1. 使用以下冻存液：60% 戊淀粉溶液（10% 戊淀粉溶于 0.9% NaCl）、20% 胎牛血清（FBS）、12.5% CPDA-1、2.5% NaCl（0.9%）、5% 二甲基亚砜（DMSO）22。
    注意：如果无法获得全部成分，可使用含 5% DMSO、30% FBS 和 65% αMEM 的溶液作为良好替代方案。
  2. 将细胞重悬至浓度为 0.5 × 106 个细胞/ml，分装至冻存管中，每管 1 ml，并在 -80 °C 冻存容器中过夜冷冻。
  3. 次日转移至液氮储存罐中。

4. 细胞解冻

  1. 在37℃下解冻一管细胞 °37°C 水浴 5 分钟。
  2. 将细胞重悬于10 ml预热的培养基中，在500 × g条件下离心5分钟，21 °C.
  3. 移除上清液，将细胞沉淀重悬于10 ml培养基中。以每平方厘米5,000个细胞的密度，将细胞接种至带有透气盖的细胞培养处理过的培养瓶中。2 在 0.2 ml/cm² 培养基中（例如， 15 ml 用于 75 cm² 培养瓶2 培养瓶
  4. 在5% O₂条件下培养细胞2，5% CO₂2 待细胞生长至80–90%汇合时进行收获或用于实验。过度汇合将诱导细胞分化。当以5,000个细胞/cm²接种时2L-MSCs 在培养 3-4 天后将达到 80-90% 的融合度。

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结果

间充质干细胞（MSCs）最可靠的两个物理特性——密度和贴壁性——在本实验方案的第一部分被用于获取含有肺间充质基质细胞（L-MSCs）的肺间质细胞组分。尽管密度梯度界面层中除肺间质细胞外还包含单核细胞和巨噬细胞，但经过后续的贴壁培养以及3-5天的培养，可确保仅保留肺间质细胞。事实上，该细胞群体表达典型的MSC表面标志物CD73、CD90和CD146，且对CD34、CD45、主要组织相容性复合物II类分子（MHCII）-RT1B、CD11b和CD79a呈阴性，表明该细胞群体中已无白细胞残留（图2A）。值得注意的是，在CD146+亚群中，有44.4%-65.7%的细胞同时表达CD73+和CD90+（数据未显示）。此外，该细胞群体具有较高的集落形成单位（CFU）效率，约为30%，显著高于通常报道的骨髓MSCs或其他类型MSCs的CFU效率，并能向三种典型的MSC谱系分化（图2C）（图2B）。

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讨论

原代肺间充质干细胞（L-MSCs）的分离与培养为深入理解其细胞水平上的功能、与其他细胞群体的相互作用，以及其在肺发育、健康与疾病中的作用提供了重要契机。这一点尤为重要，因为目前尚缺乏针对这些细胞的特异性单一标志物，使得对它们的研究几乎难以开展。 原位与所有原代细胞群体一样，需要注意的是，这些细胞在培养中保存的时间越长，其特性越有可能发生变化19 （综述见于24)。为了使L-MSCs尽可能保持在其自然状态，必须在5% O₂条件下进行培养，这一点至关重要。2，5% CO₂2，在37 °C的加湿培养箱中。在呼吸生理学中，通常认为根据道尔顿分压定律，环境空气中的氧分压（21% O₂）2）为160 mmHg，在肺泡腔内降至约101 mmHg25-27在成熟的肺中，肺泡-动脉血氧分压差（PaO₂）2 梯度约为3-4 mmHg，但在肺部疾病或肺发育不成熟的情况下，由于肺泡-动脉距离增加，该梯度可能显著升高25,28在体内，间充质微环境通常暴露于2-8%的氧浓度...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

JJPC 获得加拿大卫生研究院（CIHR）博士后奖学金的支持。MAM 获得德国国家学术基金会（Studienstiftung des Deutschen Volkes）的优秀奖学金，并得到欧洲新生儿护理基金会（EFCNI）资助项目的支持。BT 获得加拿大卫生研究院（CIHR）、加拿大肺脏协会、干细胞网络以及安大略东部儿童医院研究所的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
中性蛋白酶沃辛顿生物化学公司LS02104在分离当天配制，并于4℃保存 °C，直至使用
胶原酶 I沃辛顿生化公司LS004196在分离当天配制，并于4℃保存 °C，直至使用
DNA酶ISigma-AldrichD5025在分离当天配制，并于4℃保存 °C，直至使用
戊巴比妥钠（Euthanyl）Bimeda-MTC Animal Health Inc，爱尔兰都柏林-对于体重在20-30克之间的大鼠幼崽，使用0.2毫升；体型较大的动物可能需要更多。
杜尔贝科’s PBS + 丙酮酸钠 + 葡萄糖Life Technologies14287-072使用这种D-PBS至关重要，因为其中含有的钙和镁可促进酶解消化过程
Ficoll-Paque PREMIUM（1.073 g/cm³）3)GE Healthcare17-5446-52密度梯度介质。为了获得良好的界面层，单细胞悬液的铺层操作必须在 >45° 以极低速度离心，随后在19 °C.
αMEMSigma-AldrichM804237℃预热 °使用前将水浴箱预热至 C
200 mM L-谷氨酰胺Life Technologies25030-164
100x 抗生素-抗真菌剂Life Technologies15240-062青霉素/链霉素/制霉菌素
M-280 DynabeadsLife Technologies11205D磁珠
生物素标记的多克隆兔抗小鼠IgGDako，安捷伦科技E0464与下述抗大鼠CD146抗体相匹配的生物素标记二抗
DynaMag5 磁铁Life Technologies12303D推荐用于Dynabeads的磁铁。注意：应根据制造商建议选择磁铁’根据所选磁珠的使用说明进行操作。
TrypLE express Life Technologies12605-028温和的非胰蛋白酶替代试剂，使用 1 ml TrypLE express/25 cm²2 表面积。消化后，10 ml L-MSC培养基足以灭活3 ml TrypLE
抗大鼠CD146抗体Lifespan Biosciences Inc.C3584112.5 μ升每0.5 × 106 细胞
戊淀粉（戊淀粉溶液）百时美施贵宝加拿大公司-可通过当地献血服务机构或血液科获取。或者，可将PSI 20%戊淀粉溶液（Preservation Solutions，PST001）用0.9% NaCl按1:1比例稀释后使用。
Mr. Frosty 冻存盒赛默飞世尔科技5100-0001提高L-MSCs在-80℃过夜冻存时的存活率 °C

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CD146 MSC
从大鼠肺组织中分离CD146+ 驻留型肺间充质基质细胞
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