介绍了一种从土壤中原位获取的X射线计算机断层扫描数据中获得根系结构可视化与定量信息的方法。
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摘要
摘要
植物根系在根际发生的植物-土壤-微生物相互作用以及与气候变化和作物管理密切相关的过程中发挥着关键作用。在原位环境中获取根系的定量尺寸信息，对于研究根系生长及涉及植物的环境过程具有重要价值。X射线计算机断层扫描（XCT）已被证明是一种有效的工具，可用于 原位 根系扫描与分析。我们的目标是开发一种无需成本且高效的工具，能够基于三维（3D）断层扫描数据，对任意形状的根系进行表面积和体积的近似计算。本研究以草原须芒草（Prairie dropseed）的根系结构为例。Sporobolus heterolepis) 使用XCT对样本进行成像。通过结合使用授权软件和开源软件，从数据中重建了根系并提取了主根结构。随后创建了等值面多边形网格，以便于分析。我们开发了独立应用程序 imeshJ，生成于 MATLAB1，以根据网格计算根系体积和表面积。输出结果包括 imeshJ 表面积（单位：mm2）以及体积（单位：mm3）。该过程结合了从成像到定量根系分析的独特工具组合进行描述。XCT与开源软件的结合被证明是一种强大的组合，可对植物根系样本进行无损成像、根系数据分割，并从三维数据中提取定量信息。这种处理三维数据的方法应可适用于其他材料/样品体系，特别是当各组分之间具有相似的X射线衰减特性且在分割过程中存在困难的情况。
引言
根系作为根际环境的一部分2-5，是植物生物学中一个"不可见"的组成部分，因为土壤使得对根系进行无创成像变得困难6,7。然而，研究根系在土壤环境中的生长及其相互作用，对于理解根/植物生长和养分循环至关重要，而这些过程又进一步影响造林、粮食安全和气候变化。X射线计算机断层扫描（XCT）已被证明是一种在局部环境中对植物根系样本进行无创成像的有效工具8。为了在不同条件下测量根系发育和尺寸变化，并能够比较来自不同数据集/样本的数据，必须从断层扫描数据中提取定量信息。将根系数据与周围土壤数据分割开来，即将根系图像从其周围所有其他结构（例如邻近植物）中分离出来，是进行准确尺寸分析之前的关键步骤。然而，简单的阈值分割方法通常难以适用于根系数据。在土壤中对植物根系成像所面临的挑战包括根系材料X射线衰减特性的变化，以及由于水分和有机质导致根系与土壤的衰减值重叠。这些问题最近已被Mairhofer et al. 在其可视化追踪工具RooTrak中出色地解决7,9。成功分割后的下一步是准确测定根系体积和表面积。体积可通过统计体素数量并乘以体素尺寸的立方来估算，如先前所示7。为了更精确地确定根系表面积和体积，可使用称为“移动立方体”（Marching Cubes）的算法10，将分割后的根系系统等值面表示为三角形网格。开源软件ImageJ11可基于移动立方体算法对根系体积进行近似计算。据我们所知，目前可用于厘米级及以上尺寸根系样本、基于断层扫描数据计算体积/表面积的开源软件数量极为有限12。我们考察过的一款开源软件13专注于根系生长，旨在实现单细胞分辨率下的细胞特征定量体积分析。某些专用于完整根系系统的开源软件14在处理小直径管状根系系统方面表现优异，其基于根系形状近似为管状的假设。然而，部分软件仅适用于二维图像，无法处理三维图像堆栈14。此外，当研究具有粗糙表面和非均匀形状的根系（如树木根系）时，管状形状的假设可能不再成立。另一种方法15创新性地利用二维（2D）旋转图像序列，避免了昂贵CT扫描仪的需求，可测量、记录并显示根系长度。我们测试过的商业软件16-18中，有一款似乎无法处理三维图像堆栈16，第二款是叶面积和根长测量工具17，第三款则基于颜色分析18。基于上述调研，我们认为，开发一种无需成本、能够基于三维断层扫描数据、不受根系形状限制地近似计算其表面积和体积的方法是十分必要的。
在免费提供的 RooTrak 和 ImageJ 基础上，我们开发了一个名为 imeshJ 的程序（见补充代码文件），该程序可处理由分割后的根系数据生成的等值面网格（表面立体光刻文件），并通过对网格三角形索引数据进行简单的几何计算，得出根系的体积和表面积。本文报道了一种方法，该方法结合了XCT成像、数据重建与可视化（软件CT Pro 3D和VG Studio）、在三维数据中将样本根系与土壤进行分割（开源软件ImageJ和RooTrak），以及从三角网格中提取表面积和体积信息（ImageJ和计算机代码imeshJ）。
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方案
注意：X射线断层扫描仪的操作需要接受过通用辐射培训以及仪器专用的辐射安全培训。应遵守与实验人员所在实验室相关的所有相应规程。
1. 根系成像
注意：此步骤描述了对一个保留在原始土壤中的草本标本进行成像的过程，该标本置于圆柱形塑料容器中（一种直径为40 mm、高度为210 mm、壁厚约2 mm的塑料管）。
- 将盆栽植物放置在仪器的样品操作器上，调整至所需目标放大倍数的距离。对于直径为2英寸的容器中的植物，样品到光源的距离应约为3英寸（7 cm）。
- 调整X射线扫描设置，以在探测器图像中获得最佳的灰度对比度。注意：这些设置可在所用仪器的控制软件中找到。
- 设置X射线功率参数；本示例中使用了85 kV和190 μA。
- 设置曝光时间；此处采用相对较长的1秒曝光时间，以获得更好的信噪比。
- 设置投影数量及每投影的帧数；建议每投影4帧，总共3,142个投影，以获得良好的数据统计效果。
- 通过选择"Shading correction"选项卡并点击"Create"，使用上述测量条件运行阴影校正。
注意：阴影校正用于补偿成像设备像素在受到恒定X射线通量照射时响应的差异。该过程会在X射线束开启和关闭状态下，采集无样品（样品从光路中移除）的空白图像。此校正将应用于所有采集的图像。 - 选择"Minimize ring artefacts"选项（也称为"shuttling mode"）；在采集投影图像时，样品将以角度步进方式旋转。这会导致数据采集速度较慢，但有助于消除环状伪影。
- 点击采集选项卡下的"Acquire"按钮开始扫描（使用上述设置时，图像采集大约需要4小时）。
2. 数据重建
注意：本节描述了如何从原始图像（CT 扫描的放射图像）重建三维体数据。
- 将原始数据加载到程序中。
- 比较第一张和最后一张图像（由于最后一张图像是在样品旋转360o后采集的，因此它们应几乎完全相同），以确保在数据采集过程中样品未发生移动或扫描设置未发生变化。
- 通过选择"旋转中心"选项卡并点击"开始"来计算旋转中心（COR）；使用"自动" COR查找选项，设置精度为"高精度"，并选择"双层"（上层和下层）切片用于COR计算。
- 选择需要重建的样品体积：选择"体积"选项卡，并使用缩略图编辑体积选择窗口。
- 点击"开始"执行重建，生成包含3D数据的体积文件。
3. 数据处理 / 分割
注意：本节介绍如何对重建的数据进行预处理，以便在 RooTrak 程序中进一步处理，用于追踪根系在土壤中分支生长的过程，并将根系从周围任何材料中分离出来，生成仅包含根系本身的二值图像序列。
- 在 ImageJ 中处理体数据，以准备可用于 RooTrak 的图像堆栈：
- 将体数据文件加载到 ImageJ 中。
- 通过调整亮度和对比度设置（点击 Image/Adjust/Brightness/Contrast），优化根系与土壤之间的图像对比度。当图像中感兴趣区域清晰可见且可明确区分时，即认为设置已优化。
- 将图像堆栈保存为 jpeg、bmp 或 png 格式。
- 在 RooTrak 中处理以分割根系：
- 将图像堆栈加载到 RooTrak 中（转到 "Tools" 选项卡，然后点击 "Tracker"）。
- 在根系内部设置种子点：在体数据的顶视图切片中，于每个相关根系部分内部点击若干点。
- 将追踪参数 "Smoothness" 和 "Similarity" 分别设置为 0.3 和 0.8。
- 运行追踪功能。该功能将从顶部图像切片开始，一直追踪到底部切片。
- 在查看体数据后，根据可用数据范围选择切片数量；本例中，追踪在 200 个切片处停止，相当于深度 6.2 mm，此时根系边界变得模糊不清（被追踪的根系图像开始与土壤图像融合）。
注意：生成的图像堆栈将自动保存至输出目录所在位置。
4. 体积与表面分析
注意：此步骤描述了如何从 RooTrak 生成的图像堆栈中创建等值面网格。
- 在 ImageJ 中将 RooTrak 生成的图像堆栈转换为二值图像格式。选择 "Process"，然后选择 "Binary"，再选择 "Make Binary"。
- 使用开源 ImageJ 插件 BoneJ 创建三角网格；在 ImageJ 中选择 "Plugins"，然后选择 "BoneJ"，再选择 "Isosurface"。
- 将 "Resampling" 和 "Threshold" 分别设置为 6 和 120（默认设置）。勾选 "Show surface"，然后点击 "OK" 按钮。
- 在 "3D viewer" 中点击 File 选项卡，然后选择 "Export surfaces"，并以 "STL (binary)" 格式保存。
- 打开 imeshJ，选择 STL 文件并输入以微米为单位的体素尺寸。点击 "Calculate Surface Area" 以获取样本总根表面积（单位为 mm2）。类似地，点击 "Calculate Volume" 以获得样本总根体积（单位为 mm3）。
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结果
从住宅区采集的样本包含原生草种草原落芒草（Sporobolus heterolepis）的两根茎秆及其周围的原始土壤，被置于一个小型管状容器中，如图1所示。重建后的数据体素尺寸约为31 µm × 31 µm × 31 µm。利用开源图像处理程序ImageJ 1.611，从选定方向（俯视图）生成图像序列堆栈。在该程序中还对体积数据进行了亮度增强，以提高根系与土壤之间灰度值的对比度。从重建的数据中可以明显看出，根系与土壤中的某些组分（极有可能是有机质）具有非常相近的X射线衰减系数，导致图像中灰度对比度极低甚至无法分辨（图2）。
RooTrak 是用于分割的开源程序，由诺丁汉大学整合植物生物学中心开发。7它专为追踪根系在土壤中分支生长而设计，可将根系从周围基质中分离出来，生成一系列二值图像。研究表明，RooTrak在根系数据分割方...
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讨论
X射线计算机断层扫描技术与多种开源程序的结合，被证明是一种强大的组合，可用于对植物根系样本进行无损成像、根系数据分割，并从三维数据中提取定量信息（如表面积和体积）。我们对特征进行可视化和测量的能力始终受限于扫描分辨率以及RooTrak软件的局限性。然而，本研究中的扫描分辨率足以捕捉样本的大部分特征，且RooTrak能够成功分割出根系的大部分区域。本研究所采用的RooTrak版本无法追踪向上延伸的根段（本研究样本中向上分枝并不显著）；程序的新版本已解决了这一问题9。
正如引言中所提示的，文献调研表明，亟需一种无需成本的软件方案，用于从厘米级及以上尺寸样本的三维断层扫描数据中计算根系体积和表面积。本文所报道方法的重要意义在于，当根系完成分割后，该方法可直接利用广泛使用的ImageJ软件生成的三维数据格式进行分析。分析的核心是从由三角网格近似表示的根系图像中计算其体积和表面积。ImageJ以.stl格式生成的三角网格，通过构成表面近似的三角形索引来表示。imeshJ从二进制文件格式中提取这些索引，并能够根据索引计算表面积（其值等于连接点[1,2]和...
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披露
我们无任何披露事项。
致谢
本工作在环境分子科学实验室完成，该实验室是由美国能源部生物与环境研究办公室资助的国家级科学用户设施，位于太平洋西北国家实验室。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| X-Tek/Metris XTH 320/225 kV | Nikon Metrology | X射线断层扫描仪 | |
| Inspect X | Nikon Metrology | 仪器控制软件 | |
| CT Pro 3D | Nikon Metrology | 重建软件，版本 XT 2.2 | |
| VG Studio MAX | Visual Graphics GmbH | 三维体数据可视化软件，版本 2.1.5 | |
| ImageJ | 开源 | 图像处理与分析软件，版本 1.6 | |
| RooTrak | 开源 | 根系分割软件，版本 0.3.1-b1 beta | |
| imeshJ | EMSL | 作者开发的MATLAB脚本 | |
| 小须芒草样品 | 采自居民区地面的样品 |
参考文献
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- McKenzie, B. M. The Rhizosphere: An Ecological Perspective. Eur. J. Soil Sci. 59 (2), 416-417 (2008).
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- Gregory, P. J. Roots rhizosphere and soil: the route to a better understanding of soil science? Eur. J. Soil Sci. 57 (1), 2-12 (2006).
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重印与许可
