小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离——基于活体减毒疫苗皮内免疫后 疟原虫 子孢子

摘要

本文介绍了一种从小鼠皮肤及引流淋巴结中分离髓系细胞的实验方案，该方法适用于在皮肤内注射疟原虫（Plasmodium）子孢子后的情况。对所获取细胞进行流式细胞术分析，可可靠地检测皮肤及引流淋巴结对寄生虫引发的炎症反应特征。

摘要

疟疾感染始于疟原虫（Plasmodium）的子孢子阶段通过蚊虫叮咬注入哺乳动物宿主的皮肤。这种高度运动性的寄生虫不仅可到达肝脏，侵入肝细胞并转化为可感染红细胞的形式，还会迁移至皮肤及注射部位近端引流淋巴结，在此可被局部驻留和/或募集的髓系细胞识别并降解。活体成像技术已报道在皮肤中早期募集发出明亮荧光的Lys-GFP阳性白细胞，以及子孢子与引流淋巴结中CD11c⁺细胞之间的相互作用。本文介绍了一种高效的方法，用于在小鼠模型中经皮内注射免疫剂量子孢子后，回收、鉴定并计数募集至小鼠皮肤及引流淋巴结的髓系细胞亚群。利用多参数流式细胞术进行表型表征，可提供一种可靠的检测手段，用于评估疟原虫（Plasmodium）感染引发的炎症反应中早期动态的细胞变化。

引言

疟疾是世界上最致命的传染病之一，每年导致超过50万人死亡。由疟原虫感染引起 疟原虫，该病的致病因子，首先经历一个红细胞前（PE）阶段。在此阶段，雌性按蚊注入宿主皮肤的子孢子会到达肝脏 通过 进入血液，并在肝细胞内分化为可感染红细胞并引发疾病症状的寄生虫形态。

PE 的各个阶段 疟原虫 是疟疾疫苗的优先靶标。事实上，针对这些阶段的减毒活疫苗，如辐射减毒子孢子（RAS）、基因失活寄生虫（GAP）或药物预防联合子孢子（CPS），已证明能够保护啮齿类动物和人类宿主^1-9在啮齿类动物模型中，大多数疫苗研究采用静脉免疫，因其在保护效力方面被视为金标准。然而，随着对皮肤阶段的描述以及皮肤相关引流淋巴结（dLN）在诱导保护作用中重要性的认识，我们对PE阶段的理解已发生改变，并凸显了皮内注射途径的重要性。活体成像 P. berghei 已发现，注入啮齿类动物皮肤的子孢子仅有约25%通过血液到达肝脏。其余约75%分布在近端引流淋巴结（约15%）和皮肤（约50%）中。^10,11，其中一小部分可发生转化并在皮肤细胞内存活数周^12,13此外，后续研究指出，经皮内免疫后有效保护性免疫的建立主要发生在皮肤引流淋巴结（skin-dLN）中，此处寄生虫特异性的CD8⁺ T 细胞被激活，且仅在脾脏或肝脏引流淋巴结中轻微激活^14,15....

方案

所有实验程序均经巴斯德研究所委员会及当地动物实验伦理委员会（法国巴黎IDF-巴黎1伦理委员会，协议编号：2012-0015）批准，并依照适用的指南和法规进行。 

1. 材料与试剂

1. 使用雌性斯氏按蚊（Anopheles stephensi Sda500品系），在羽化后3-5天内让其吸食感染小鼠的血液，并按先前所述方法饲养²¹。
2. 使用表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）基因的伯氏疟原虫ANKA克隆（Plasmodium berghei ANKA），该基因在组成型热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70, HSP70）启动子的调控下表达，可在疟原虫整个生命周期中产生强烈的荧光信号²²。
3. 使用7周龄的雌性C57BL/6JRj小鼠。
   注：本实验方案中使用的所有试剂均列于材料/设备表中。

2. 从蚊子唾液腺中分离辐射减毒子孢子

1. 在感染性血餐后的18至25天之间，按照先前所述方法，将蚊子收集并置于冰上的15 ml离心管中进行低温麻醉²¹。通过倒置离心管小心地将蚊子转移至培养皿中。保持昆虫处于冰上，并对蚊子施加12 krad剂量的γ射线或X射线照射。
....

结果

我们最近证明，在小鼠皮肤中注射免疫剂量的P. berghei子孢子后，会相继招募多形核中性粒细胞，随后是炎性单核细胞，这些细胞出现在皮肤和引流淋巴结（dLN）中¹⁹。上述《实验方案》部分详细描述了在耳部真皮多次注射大量子孢子后，从这两种组织中成功分离活髓系细胞的操作流程（图1和2）。在注射后的前24小时内，分别分离并处理dLN（图3）和皮肤注射部位（图4），并按照图5所示流程进行多参数流式细胞术分析细胞浸润情况。总体而言，该技术使我们能够分别从皮肤和dLN中平均分离出约10⁴个CD45⁺CD11b⁺细胞和2.10⁴个CD11b⁺活单细胞。非碎片活单细胞的存活率在皮肤样本中为40–70%，在dLN样本中为70–90%。如图6所.......

讨论

从使用全孢子体疟疾疫苗对人类进行大规模疫苗接种的角度来看，需要克服的主要挑战之一是开发优化的寄生虫给药途径和方法，以确保成功免疫并获得保护效果^24,25。在人类中，活体减毒寄生虫（LAP）介导的保护效力评估已通过自然蚊虫叮咬²，以及皮内、皮下^25,26和静脉免疫²⁷等方式开展。正如在啮齿类动物²⁸和非人灵长类动物²⁵中所报道的，与上述途径相比，静脉注射LAP可诱导更强的保护性免疫反应。然而，使用注射器和针头的非静脉给药途径仍更适用于人类大规模疫苗接种，目前正致力于优化这些途径的保护效果。

最近在小鼠中进行的研究表明，尤其是采用皮内注射途径（ID）时，将少量（约1 µl）子孢子悬液分多点（4个位点）注射，相较于将寄生虫稀释于较大体积（50 µl）中进行单次接种，可显著提高寄生虫的感染能力²⁴。在我们的实验系统（C57BL/6小鼠 - P. berghei）中，通过在耳部真皮多点注射高浓度的寄生虫悬液（0.6 µl中.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮：Imalgene® 1,000	Merial	-	50 mg/kg：注射子孢子前 125 mg/kg：处死前
赛拉嗪：Rompun® 2%	拜耳	-	5 mg/kg：注射子孢子前 12.5 mg/kg：处死前
NanoFil 注射器 + 35 号针头	世界精密仪器公司	-	-
Omnican® 50 支胰岛素注射器，0.5 ml/50 I.U.	B. Braun Medical	9151125	-
MultiwellTM 6孔细胞培养板 – 平底	BD Falcon	353046	-
70 µm细胞滤筛	BD Falcon	352350	-
2 ml 注射器	Terumo	SS-02S	-
BLUE MAX™ 15 ml 聚丙烯锥形管	BD Falcon	352097	-
BLUE MAX™ 50 ml 聚丙烯锥形管	BD Falcon	352098	-
5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带 35 µm 细胞滤筛帽	BD Falcon	352235	-
DPBS 1x CaCl2- 和 MgCl2-无-	Life Technologies	14190-094	-
DMEM 1x + GlutaMAXTM	Life Technologies	31966-021	-
产气荚膜梭菌胶原酶，IV型，0.5–5.0 FALGPA单位/毫克固体	Sigma-Aldrich	C5138	400 U/ml
牛胰脱氧核糖核酸酶 I，IV 型	Sigma-Aldrich	D5025	50 µg/ml
EDTA 二钠盐	Sigma-Aldrich	E-5134	10 mM 或 2.5 mM
FBS	Biowest	S1810-500	-
HEPES缓冲液（1 M）	Gibco	15630-056	25 mM
0.4% 台盼蓝染色液	Life Technologies	15250-061	稀释 1:10
抗小鼠 CD16/CD32（2.4G2 克隆）	BD 生物科学	553142	10 µg/ml 终浓度（1:50）
DAPI FluoroPureTM 等级	Life Technologies	D21490	1 µg/ml 终浓度
抗小鼠 CD45（30-F11 克隆）	BD 生物科学	559864	稀释比例 1:200
抗小鼠 CD11b（M1/70 克隆）	BD 生物科学	557657	稀释比例 1:400
抗小鼠 CD8α （5H10 克隆）	Life Technologies	MCD0830	稀释比例 1:100
7周龄雌性C57BL/6JRj小鼠	Janvier Laboratories	-	-