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方法文章

小鼠皮肤及引流淋巴结中髓系细胞的分离——基于活体减毒疫苗皮内免疫后 疟原虫 子孢子

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DOI：

10.3791/53796

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2016年5月18日

 ,  ,  , 
1Unité de Biologie et Génétique du Paludisme, Institut Pasteur, 2Unité dImmunobiologie des Cellules Dendritiques, Institut Pasteur

本文内容

摘要

本文介绍了一种从小鼠皮肤及引流淋巴结中分离髓系细胞的实验方案，该方法适用于在皮肤内注射疟原虫（Plasmodium）子孢子后的情况。对所获取细胞进行流式细胞术分析，可可靠地检测皮肤及引流淋巴结对寄生虫引发的炎症反应特征。

摘要

疟疾感染始于疟原虫（Plasmodium）的子孢子阶段通过蚊虫叮咬注入哺乳动物宿主的皮肤。这种高度运动性的寄生虫不仅可到达肝脏，侵入肝细胞并转化为可感染红细胞的形式，还会迁移至皮肤及注射部位近端引流淋巴结，在此可被局部驻留和/或募集的髓系细胞识别并降解。活体成像技术已报道在皮肤中早期募集发出明亮荧光的Lys-GFP阳性白细胞，以及子孢子与引流淋巴结中CD11c+细胞之间的相互作用。本文介绍了一种高效的方法，用于在小鼠模型中经皮内注射免疫剂量子孢子后，回收、鉴定并计数募集至小鼠皮肤及引流淋巴结的髓系细胞亚群。利用多参数流式细胞术进行表型表征，可提供一种可靠的检测手段，用于评估疟原虫（Plasmodium）感染引发的炎症反应中早期动态的细胞变化。

引言

疟疾是世界上最致命的传染病之一，每年导致超过50万人死亡。由疟原虫感染引起 疟原虫，该病的致病因子，首先经历一个红细胞前（PE）阶段。在此阶段，雌性按蚊注入宿主皮肤的子孢子会到达肝脏 通过 进入血液，并在肝细胞内分化为可感染红细胞并引发疾病症状的寄生虫形态。

PE 的各个阶段 疟原虫 是疟疾疫苗的优先靶标。事实上，针对这些阶段的减毒活疫苗，如辐射减毒子孢子（RAS）、基因失活寄生虫（GAP）或药物预防联合子孢子（CPS），已证明能够保护啮齿类动物和人类宿主1-9在啮齿类动物模型中，大多数疫苗研究采用静脉免疫，因其在保护效力方面被视为金标准。然而，随着对皮肤阶段的描述以及皮肤相关引流淋巴结（dLN）在诱导保护作用中重要性的认识，我们对PE阶段的理解已发生改变，并凸显了皮内注射途径的重要性。活体成像 P. berghei 已发现，注入啮齿类动物皮肤的子孢子仅有约25%通过血液到达肝脏。其余约75%分布在近端引流淋巴结（约15%）和皮肤（约50%）中。10,11，其中一小部分可发生转化并在皮肤细胞内存活数周12,13此外，后续研究指出，经皮内免疫后有效保护性免疫的建立主要发生在皮肤引流淋巴结（skin-dLN）中，此处寄生虫特异性的CD8+ T 细胞被激活，且仅在脾脏或肝脏引流淋巴结中轻微激活14,15.

尽管大多数研究集中于表征参与建立保护性免疫应答的效应细胞，但对于注射到皮肤中的减毒活寄生虫的命运，尤其是它们与先天免疫系统的相互作用，目前了解甚少。特别是，鉴定参与寄生虫抗原摄取、加工并将其呈递给CD8+ T细胞的抗原呈递细胞至关重要，因为已知肝脏期（PE）抗原的获取既可发生在皮肤中，也可发生在引流淋巴结（dLN）中。此前的活体成像研究描述了在感染性蚊虫叮咬后，皮肤中迅速出现大量强烈荧光的Lys-GFP阳性细胞16，同时在dLN中观察到子孢子与树突状细胞之间的早期相互作用10,17。最近有报道称，蚊虫在皮肤中接种的子孢子可增强小鼠皮肤中树突状细胞和调节性T细胞的运动能力，而在dLN中观察到抗原呈递细胞数量减少18。

我们的目标是更精确地鉴定和定量在皮内注射免疫剂量的子孢子（RAS19）后，被招募至皮肤及相应引流淋巴结（dLN）的白细胞亚群，以及与寄生虫相互作用的细胞亚群。在此背景下，我们从这两种组织中分离了髓系细胞（CD45+CD11b+），并通过多参数流式细胞术对感兴趣的亚群进行了表征。与前期报道的Leishmania major皮肤感染早期免疫反应一致20，宿主对子孢子注射的主要免疫应答表现为：首先招募嗜中性粒细胞（CD45+CD11b+Ly6G+Ly6Cint），随后招募炎性单核细胞（CD45+CD11b+Ly6G-Ly6C+），这些细胞亚群的鉴定依据是其表面标志物Ly6G和Ly6C表达水平的差异。

本文介绍了一种从小鼠皮肤和引流淋巴结（dLN）中分离髓系细胞的实验方案，该方法基于在皮肤内注射从感染疟蚊唾液腺中提取的RAS免疫剂量。可重复的皮内注射及组织处理是定量分析感染组织中浸润细胞群体表型变化的关键步骤。下述方法提供了一种可靠的检测手段，用于评估皮肤和引流淋巴结对疟原虫（Plasmodium）寄生虫的炎症反应，并可推广应用于多种实验体系。

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方案

所有实验程序均经巴斯德研究所委员会及当地动物实验伦理委员会（法国巴黎IDF-巴黎1伦理委员会，协议编号：2012-0015）批准，并依照适用的指南和法规进行。 

1. 材料与试剂

  1. 使用雌性斯氏按蚊（Anopheles stephensi Sda500品系），在羽化后3-5天内让其吸食感染小鼠的血液，并按先前所述方法饲养21。
  2. 使用表达绿色荧光蛋白（Green Fluorescent Protein, GFP）基因的伯氏疟原虫ANKA克隆（Plasmodium berghei ANKA），该基因在组成型热休克蛋白70（Heat Shock Protein 70, HSP70）启动子的调控下表达，可在疟原虫整个生命周期中产生强烈的荧光信号22。
  3. 使用7周龄的雌性C57BL/6JRj小鼠。
    注：本实验方案中使用的所有试剂均列于材料/设备表中。

2. 从蚊子唾液腺中分离辐射减毒子孢子

  1. 在感染性血餐后的18至25天之间，按照先前所述方法，将蚊子收集并置于冰上的15 ml离心管中进行低温麻醉21。通过倒置离心管小心地将蚊子转移至培养皿中。保持昆虫处于冰上，并对蚊子施加12 krad剂量的γ射线或X射线照射。
  2. 按照先前所述方法，从经照射的蚊子唾液腺中分离减毒子孢子21。在冰上用少量（约15 μl）1×杜氏磷酸盐缓冲液（DPBS）收集感染的唾液腺，并轻轻研磨以释放子孢子。
    注意：由于在小体积中注射高浓度寄生虫悬液至关重要，因此必须从大量预先筛选出的高感染率蚊子（以其强烈的绿色荧光表达为依据）中收集足够数量的唾液腺。
  3. 将子孢子悬液通过连接在低吸附性1.5 ml微量离心管上的35 µm细胞筛帽过滤，以去除团块和蚊子碎片。
  4. 按照先前所述方法21计数所分离的子孢子总数，并用冰冷的1× DPBS调整寄生虫悬液浓度，使其达到83,000个子孢子/μl。在继续后续步骤时，将寄生虫保持在冰上保存。
  5. 收集未感染蚊子的等量唾液腺作为阴性对照，并按照步骤2.2和2.3所述处理样本。按上述说明稀释样本，使悬液中的唾液腺提取物浓度相近。
    注意：子孢子可在冰上保存最多2小时，但理想情况下应在研磨唾液腺后1小时内完成注射。

3. 将子孢子注射至耳部真皮层

  1. 通过腹腔注射氯胺酮（50 mg/kg）/赛拉嗪（5 mg/kg）混合物使动物麻醉。等待5-8分钟，直至小鼠进入无意识状态，并在眼睛上涂抹眼用软膏以防止角膜干燥。通过轻轻夹捏两只后足脚趾来评估麻醉深度。
    注意：该剂量麻醉作用持续时间少于20分钟，因此后续步骤必须迅速完成。
  2. 在体视显微镜下，用预先放置的透明胶带固定小鼠耳廓腹侧以稳定耳部（图1A）。轻柔按压耳朵，避免损伤血管系统。
  3. 用10 μl注射器配35号斜面针头吸取0.6 µl重悬的寄生虫10。
  4. 将子孢子悬液分4个注射位点注入（每点0.15 µl），将针头小心插入耳部背侧（图1A），位于表皮下方，针尖斜面朝上，注意避开所有血管。拔针前让针头在真皮层停留数秒，以防止注入物回流。操作结束后，每个注射位点应可见典型丘疹（图1B 和1C）。
  5. 注射后，小心将耳朵从胶带上取下。
  6. 按照步骤3.2–3.4，对对侧耳朵注射相同剂量的寄生虫。
  7. 另注射2只小鼠，分别注入0.6 µl 1×DPBS或0.6 µl 1×DPBS加未感染蚊子的唾液腺提取物，以评估仅由注射引起的炎症反应以及蚊源物质在真皮层的沉积情况。
  8.  将小鼠放回笼中前，密切观察其从麻醉状态恢复的情况。
    注意：皮肤中子孢子的正确沉积可通过荧光显微镜进行监测（图2A 和2B），小鼠制备方法如前所述23。

4. 皮肤及引流淋巴结解剖 

  1. 制备标准培养基（SM）如下：杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）+ 25 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES），添加 400 U/ml 胶原酶和 50 μg/ml 脱氧核糖核酸酶（DNase）。
  2. 在冰上准备两块6孔平底组织培养板，每孔分别加入4.5 ml SM + 70 μm细胞筛网用于dLN样本（平板A），每孔加入4.5 ml SM用于皮肤样本（平板B）。
  3. 在子孢子接种后的预定时间点，通过腹腔注射氯胺酮（125 mg/kg）和赛拉嗪（12.5 mg/kg）混合物对小鼠进行深度麻醉，随后实施颈椎脱位。确保小鼠呈现临床死亡体征，并立即开始解剖。
    注意：可在注射后的不同时间点检测髓系细胞募集的动力学变化即 2 小时、4 小时和 24 小时，如前所述14).
  4. 用70%乙醇对接种的耳部及相应的颈部区域进行消毒，以降低污染的可能性。
  5. 使用无菌剪刀和镊子，无菌分离近端耳部引流淋巴结（dLN），避免收集周围脂肪组织。在颈静脉-颈动脉沟处做第一道切口，并清除手术区域的毛发。用两把镊子撑开切口，以暴露呈灰白色、与周围组织颜色不同的dLN。
  6. 用镊子小心夹住dLN顶部的结缔组织，以利于将其去除。将镊子置于淋巴组织下方，取出dLN图 3A 和 3B将dLN置于含有4.5 ml SM和70 μm细胞筛网的孔中（A板）。
  7. 使用无菌的锋利剪刀和镊子采集整个接种过的玉米穗（图 4A）。用两把镊子夹住切开的末端并将其撑开，以分离耳部的背侧和腹侧图4B-4E）。将它们放入含有4.5 ml SM的孔中（平板B），确保两份组织完全浸没在培养基中。
    注意：为了提高实验的可靠性并增加目的细胞的数量，每个样本 pooling 同一只小鼠的 2 只注射耳或 2 个引流淋巴结（dLNs）。
  8. 同时收集并处理接种了1×DPBS或唾液腺提取物的小鼠的耳组织和dLNs。另取2份来自未处理小鼠的耳组织和淋巴结样本，用于阴性对照和单染补偿对照。

5. 从淋巴结中分离细胞

  1. 将淋巴结（A板）在37 °C、5% CO2条件下轻柔振荡孵育15分钟。每孔加入终浓度为10 mM的乙二胺四乙酸（EDTA），以中和胶原酶和DNase的活性。后续步骤均在冰上操作。
  2. 使用5 ml注射器活塞的顶端，以环形按压方式在滤筛上研磨淋巴结，直至仅剩白色结缔组织。
  3. 用500 μl 1× DPBS + 2% 胎牛血清（FBS）+ 2 mM EDTA冲洗细胞滤筛两次，将全部液体转移至15 ml离心管中。
  4. 用500 μl 1× DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA将孔板冲洗两次，并将冲洗液全部转移至15 ml离心管中。保持离心管置于冰上。

6. 耳部皮肤细胞的分离

  1. 将耳小叶（B板）在37 °C、5% CO2条件下，于轻柔振荡中孵育1小时。
    注意：孵育20分钟后，用剪刀将耳小叶剪成小块，以促进组织消化，并将样品放回孵育箱继续孵育剩余的40分钟。孵育结束时可在培养基中观察到单个细胞。
  2. 每孔加入终浓度为10 mM的EDTA，以中和胶原酶和DNase的活性。后续步骤均在冰上操作。
  3. 使用1 ml移液器将耳组织碎片及全部培养基转移至含有70 μm细胞筛网的新孔中。将移液器吸头末端剪去2至3 mm，以便更易收集耳组织碎片。
  4. 使用5 ml注射器活塞的顶端在筛网上以旋转按压方式解离耳组织碎片，直至仅剩白色结缔组织。
  5. 用500 μl 1× DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA冲洗细胞筛网两次。
  6. 通过70 μm细胞筛网，将孔中全部液体转移至50 ml离心管中。
  7. 用500 μl 1× DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA冲洗孔板，并将冲洗液转移至50 ml离心管中。将离心管置于冰上保存。
    注意：从皮肤和dLN组织中分离总细胞的各个步骤总结于图5中。

7. 收集细胞的计数与活力检测

  1. 将皮肤和dLN样本在4 °C条件下以450 × g离心5分钟，弃去上清液。用300 μl 1× DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA轻轻重悬沉淀。
  2. 取每份样本少量用于血细胞计数板计数，以确定从皮肤和dLN中分离的总细胞数。加入0.04%台盼蓝以测定细胞活力。

8. 阻断非抗原特异性结合

  1. 加入10 µg/ml未标记的CD16/CD32 Fc阻断抗体。在4 °C下孵育20分钟（可延长孵育时间）。
  2. 加入2 ml预冷的1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA。在4 °C下以450 × g离心5分钟，弃去上清液。用300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA轻轻重悬沉淀，并将样品置于冰上保存。

9. 染色皮肤和淋巴结髓系细胞

  1. 将先前阻断的皮肤和分离的dLN细胞与活/死细胞追踪剂共同孵育（即 4',6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）、抗CD45和抗CD11b特异性抗体。
    注：为了富集目标髓系细胞亚群，尤其是稀有亚群，可采用CD45+ 细胞和淋巴细胞可通过磁珠分选技术分别从皮肤中纯化或从引流淋巴结（dLN）中耗竭。由于从dLN分离的大多数细胞均为CD45+，使用抗 CD45 抗体并非必需。可根据阳性或阴性设门策略，选择其他标记物以鉴定感兴趣的髓系细胞亚群。在本方案中，通过排除 CD8α 阳性细胞来富集引流淋巴结（dLN）中募集的髓系细胞+ 细胞（可通过使用抗CD3特异性抗体靶向整个T细胞区室）。
  2. 4 °C 避光孵育 30 分钟。加入 500 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA，4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟，弃上清液。重复洗涤步骤两次。
  3. 用300 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA重悬样本，将全部液体通过35 µm细胞滤网转移至流式管中。用100 μl 1x DPBS + 2% FBS + 2 mM EDTA冲洗滤网。
  4. 在流式细胞仪中检测染色后的细胞。圈选活的单细胞（DAPI-，FSC-W）以排除死细胞和双联体。绘制 CD45+CD11b+ 皮肤相关事件（图6A）和（CD45+CD8α-CD11b+ dLN 的事件图6B).

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结果

我们近期证明，在小鼠皮肤内通过针头-注射器注射免疫剂量的P. berghei子孢子，会依次募集多形核中性粒细胞，随后募集炎性单核细胞至皮肤及引流淋巴结（dLN）19。上述《实验方案》部分详细描述了在耳部真皮多次注射大量子孢子后，从上述两种组织成功分离活髓系细胞的操作流程 (图1 和 2)。在注射后24小时内，分别分离 (图3) 引流淋巴结和 (图4) 皮肤注射部位，并按 图5 所示流程进行处理，以通过多参数流式细胞术分析细胞浸润情况。总体而言，该技术使我们能够分别从皮肤和引流淋巴结中平均分离出约104个CD45+CD11b+细胞和2.104个CD11b+活单细胞。皮肤组织中非碎片活单细胞的存活率通常为40–70%，而引流淋巴结中为70–90%。如

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讨论

从使用全孢子体疟疾疫苗对人类进行大规模疫苗接种的角度来看，需要克服的主要挑战之一是开发优化的寄生虫给药途径和方法，以确保成功免疫并获得保护效果24,25。在人类中，活体减毒寄生虫（LAP）介导的保护效力评估已通过自然蚊虫叮咬2，以及皮内、皮下25,26和静脉免疫27等方式开展。正如在啮齿类动物28和非人灵长类动物25中所报道的，与上述途径相比，静脉注射LAP可诱导更强的保护性免疫反应。然而，使用注射器和针头的非静脉给药途径仍更适用于人类大规模疫苗接种，目前正致力于优化这些途径的保护效果。

最近在小鼠中进行的研究表明，尤其是采用皮内注射途径（ID）时，将少量（约1 µl）子孢子悬液分多点（4个位点）注射，相较于将寄生虫稀释于较大体积（50 µl）中进行单次接种，可显著提高寄生虫的感染能力24。在我们的实验系统（C57BL/6小鼠 - P. berghei）中，通过在耳部真皮多点注射高浓度的寄生虫悬液（0.6 µl中...

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披露

作者声明不存在任何竞争性财务利益。

致谢

作者感谢 Patricia Baldacci、Vanessa Lagal 和 Sabine Thiberge 对文稿的审阅，感谢 Irina Dobrescu 和 Sabine Thiberge 在图片拍摄方面的帮助，以及感谢 Pauline Formaglio 的指导 体内 小鼠皮肤中子孢子体运动的成像研究。我们还要感谢Marek Szatanik以及巴斯德研究所疟蚊繁殖与感染中心（CEPIA-Institut Pasteur）在蚊子饲养方面提供的支持。本研究由AXA研究基金资助 以及卓越实验室“新发传染病综合生物学”（资助号：ANR-10-LABX-62-IBEID）提供的资金。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
氯胺酮：Imalgene® 1,000Merial-50 mg/kg：注射子孢子前 125 mg/kg：处死前
赛拉嗪：Rompun® 2%拜耳-5 mg/kg：注射子孢子前 12.5 mg/kg：处死前
NanoFil 注射器 + 35 号针头世界精密仪器公司 --
Omnican® 50 支胰岛素注射器，0.5 ml/50 I.U.B. Braun Medical 9151125-
MultiwellTM 6孔细胞培养板 – 平底BD Falcon 353046-
70 µm细胞滤筛 BD Falcon 352350-
2 ml 注射器TerumoSS-02S-
BLUE MAX™ 15 ml 聚丙烯锥形管BD Falcon 352097-
BLUE MAX™ 50 ml 聚丙烯锥形管BD Falcon 352098-
5 ml 聚苯乙烯圆底试管，带 35 µm 细胞滤筛帽BD Falcon 352235-
DPBS 1x CaCl2- 和 MgCl2-无-Life Technologies14190-094-
DMEM 1x + GlutaMAXTMLife Technologies31966-021-
产气荚膜梭菌胶原酶，IV型，0.5–5.0 FALGPA单位/毫克固体 Sigma-Aldrich C5138400 U/ml 
牛胰脱氧核糖核酸酶 I，IV 型 Sigma-Aldrich D502550 µg/ml
EDTA 二钠盐Sigma-Aldrich E-513410 mM 或 2.5 mM
FBSBiowestS1810-500-
HEPES缓冲液（1 M）Gibco15630-05625 mM
0.4% 台盼蓝染色液Life Technologies15250-061稀释 1:10 
抗小鼠 CD16/CD32（2.4G2 克隆）BD 生物科学55314210 µg/ml 终浓度（1:50）
DAPI FluoroPureTM 等级Life TechnologiesD214901 µg/ml 终浓度
抗小鼠 CD45（30-F11 克隆）BD 生物科学559864 稀释比例 1:200
抗小鼠 CD11b（M1/70 克隆）BD 生物科学557657 稀释比例 1:400
抗小鼠 CD8α （5H10 克隆）Life TechnologiesMCD0830 稀释比例 1:100
7周龄雌性C57BL/6JRj小鼠 Janvier Laboratories--

参考文献

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